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Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

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DOI：

10.3791/1869

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2010年5月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University , 5Department of Applied Mathematics, Harvard University , 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

通讯作者： Job Dekker <job.dekker@umassmed.edu>, Eric S. Lander <lander@broadinstitute.org>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C 结合了邻近连接和大规模并行测序技术。由此产生的数据可用于在多个尺度上研究基因组结构：早期结果鉴定了染色体疆域、开放与封闭染色质的分离以及兆碱基尺度的染色质结构等特征。

摘要

染色体的三维折叠使基因组形成区室化结构，并可将远端的功能元件（如启动子和增强子）在空间上拉近 2-6。解析染色体结构与基因组活性之间的关系，将有助于理解转录和复制等基因组过程。然而，目前对染色体如何折叠仍知之甚少。显微镜技术无法同时或在高分辨率下区分大量基因座。迄今为止，利用染色体构象捕获技术（3C）及其后续改进方法检测染色体相互作用时，必须预先选定一组目标基因座，因而无法实现全基因组范围的研究 7-10。

我们开发了Hi-C技术，这是3C技术的一种延伸，能够以无偏倚、全基因组范围的方式识别长距离相互作用。在Hi-C实验中，细胞首先用甲醛固定，使发生相互作用的基因位点通过共价的DNA-蛋白质交联而彼此结合。随后使用限制性内切酶对DNA进行切割时，这些相互作用的位点仍保持连接状态。在补平5'突出末端的过程中，引入生物素标记的核苷酸残基。接下来，在稀释条件下进行平末端连接，有利于发生交联的DNA片段之间的连接反应。由此生成一个全基因组范围的连接产物文库，其中每个连接产物对应于细胞核中原本空间位置相近的两个DNA片段。每个连接产物在其连接位点处均带有生物素标记。随后将文库片段化，并利用链霉亲和素磁珠富集含有连接位点的片段。纯化后的连接片段可进一步通过高通量测序仪进行分析，从而获得一份完整的相互作用DNA片段目录。

对所得接触矩阵的直接分析揭示了基因组结构的多种特征，例如染色体疆域的存在以及富含基因的小染色体之间的优先关联。对接触矩阵进行相关性分析表明，人类基因组被划分为两个区室：一个为结构较松散的区室，包含开放、可接近且具有活性的染色质；另一个为结构更致密的区室，包含闭合、不可接近且无活性的染色质区域。最后，结合理论推导和计算模拟对接触矩阵进行系综分析发现，在兆碱基尺度上，Hi-C 揭示的特征与分形球状构象相符。

方案

本方法已用于所报告的研究中 Lieberman-Aiden 等，Science 326，289-293（2009）.

一、交联、消化、DNA 末端标记及平末端连接

  1. Hi-C 实验首先对细胞进行交联，这是所有基于 3C 的方法共有的步骤。开始时，培养 2 × 107 至 2.5 × 107 个哺乳动物细胞（贴壁或悬浮生长），然后对细胞进行交联。（有关细胞交联的详细信息，请参见：11
  2. 使用匀浆器在 550 μl 裂解缓冲液（500 μl 10 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM NaCl、0.2% Igepal CA-630 和 50 μl 蛋白酶抑制剂）中裂解细胞。以 5,000 rpm 离心染色质，并用 500 μl 1× NEBuffer 2 洗涤沉淀两次。
  3. 将染色质重悬于 1× NEBuffer 2 中，分装至 5 个编号的试管中，并加入 1× NEBuffer 2 至终体积为 362 μl。加入 38 μl 1% SDS，轻轻混匀，于 65 °C 孵育 10 分钟。孵育后立即将试管放回冰上。
  4. 通过加入 44 μl Triton X-100 淬灭 SDS，并轻轻混匀。加入 400 单位 HindIII 消化染色质，于 37 °C 旋转孵育过夜。
  5. 接下来的步骤是 Hi-C 特有的，包括用生物素标记 DNA 末端，并对交联的片段进行平末端连接。此步骤将使后续能够纯化连接位点。1 号管不应进行生物素标记步骤，应单独保留，作为 3C 对照，以确保消化和连接条件处于最佳状态。
  6. 为了填补限制性酶切片段的突出末端并在剩余的 4 个试管中用生物素标记 DNA 末端，向 2–5 号管中各加入 1.5 μl 10 mM dATP、1.5 μl 10 mM dGTP、1.5 μl 10 mM dTTP、37.5 μl 0.4 mM 生物素-14-dCTP 和 10 μl 5 U/μl Klenow 酶。轻轻混匀，于 37 °C 孵育 45 分钟。
  7. 将试管置于冰上。为灭活酶，向 1–5 号管中各加入 86 μl 10% SDS。于 65 °C 准确孵育 30 分钟，随后立即放回冰上。
  8. 连接反应在极稀释条件下进行，以促进交联片段之间的连接。在冰上操作，向五个编号的 15 ml 试管中各加入 7.61 ml 连接混合液 [745 μl 10% Triton X-100、745 μl 10× 连接缓冲液（500 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、100 mM DTT）、80 μl 10 mg/ml BSA、80 μl 100 mM ATP 和 5.96 ml 水]。将每份消化后的染色质混合物转移至对应的 15 ml 试管中。
  9. 对于常规 3C 连接，向 1 号管中加入 10 μl 1 U/μl T4 DNA 连接酶。对于平末端 Hi-C 连接，向 2–5 号管中各加入 50 μl 1 U/μl T4 DNA 连接酶。通过倒置试管混匀，所有 5 个试管于 16 °C 孵育 4 小时。
  10. 通过每管加入 50 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 来逆转交联并降解蛋白质，于 65 °C 孵育过夜。次日每管再加入 50 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K，继续于 65 °C 孵育 2 小时。
  11. 将反应混合物冷却至室温，并转移至五个 50 ml 锥形管中。通过苯酚抽提纯化这些管中的 DNA。加入 10 ml pH 8.0 苯酚，涡旋振荡 2 分钟。以 3,500 rpm 离心 10 分钟，尽可能多地将水相转移至新的 50 ml 管中。
  12. 使用 pH 8.0 苯酚:氯仿（1:1）重复抽提一次，并用乙醇沉淀 DNA。（有关 DNA 纯化的详细信息，请参见：11
  13. 乙醇沉淀的 DNA 离心后，将每份 DNA 沉淀溶解于 450 μl 1× TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA）中。将 DNA 混合物转移至 1.7 ml 离心管中。
  14. 通过两次苯酚:氯仿抽提进行另一轮纯化。加入 500 μl pH 8.0 苯酚:氯仿（1:1），涡旋振荡 1 分钟。以 14,000 rpm 离心 5 分钟，将水相转移至新管中。第二次抽提后，加入 0.1 倍体积的 NaOAc 和 2 倍体积的 100% 乙醇，于 -80 °C 孵育 30 分钟以沉淀 DNA。
  15. 沉淀的 DNA 离心后，用 70% 乙醇洗涤每份 DNA 沉淀，并将每份 DNA 沉淀重悬于 25 μl 1× TE 中。通过每管加入 1 μl 1 mg/ml RNA酶 A 并于 37 °C 孵育 30 分钟，降解可能存在的任何 RNA。将 2–5 号管的 Hi-C 内容物合并，仍保持 1 号管单独作为 3C 对照。
  16. 现在是检测 Hi-C 标记和连接效率的良好时机。这些对照是判断 Hi-C 文库是否成功的良好指标。
    1. 为检测文库的质量和数量，将 3C 和 Hi-C 文库的 1:10 稀释液各取 2 μl 和 6 μl，在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳。（见图 2A）
    2. 通过 PCR 消化实验验证 Hi-C 标记和 Hi-C 连接效率。成功填补并连接 HindIII 位点（AAGCTT）会形成限制性内切酶 NheI（GCTAGC）的识别位点。使用 PCR 扩增由两个邻近限制性片段形成的特定连接产物（如 3C 11 所述，以每份文库 0.2 μl 作为模板）。随后用 HindIII、NheI 或两者共同消化 PCR 产物。将样品在 2% 凝胶上电泳后，通过定量切割和未切割条带的强度，可估算 3C 和 Hi-C 连接事件的相对数量（见图 2B）。
  17. 部分片段可能未被连接：为避免后续富集这些片段，需利用 T4 DNA 聚合酶的外切酶活性去除未连接末端上的生物素。
    1. 利用 T4 DNA 聚合酶的外切酶活性去除未连接 DNA 末端上的生物素-14-dCTP。将 5 μg Hi-C 文库与 1 μl 10 mg/ml BSA、10 μl 10× NEBuffer 2、1 μl 10 mM dATP、1 μl 10 mM dGTP 和 5 单位 T4 DNA 聚合酶混合，总体积为 100 μl，于 12 °C 孵育 2 小时。如有可能，可同时进行多个 5 μg 的反应。
    2. 通过加入 2 μl 0.5 M EDTA pH 8. 终止反应。
    3. 为纯化 DNA，进行 pH 8.0 苯酚:氯仿（1:1）抽提，随后进行乙醇沉淀。
    4. 弃去上清液，将 DNA 沉淀重悬并合并于总体积为 100 μl 的水中。

II. 剪切与片段大小选择

  1. 为了使生物素标记的DNA适用于高通量测序，必须使用Covaris S2仪器将DNA打断至300-500个碱基对的大小（工作循环5，强度5，每循环微脉冲200次，每次60秒，共进行4次循环）。
  2. 为修复打断后的DNA末端，加入14 μl 10x连接缓冲液、14 μl 2.5 mM dNTP混合液、5 μl T4 DNA聚合酶、5 μl T4多核苷酸激酶、1 μl Klenow DNA聚合酶和1 μl水。在室温下孵育30分钟。
  3. 孵育结束后，按照制造商的说明，使用Qiagen MinElute柱纯化DNA。用15 μl 1x Tris-低EDTA缓冲液（TLE: 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA）洗脱两次。随后，在末端修复的DNA的3'端添加dATP，方法是加入5 μl 10x NEBuffer2、10 μl 1 mM dATP、2 μl水和3 μl Klenow（exo-）。在37°C下孵育反应30分钟。
  4. 为使Klenow片段失活，将反应在65°C下孵育20分钟，然后在冰上冷却。使用真空浓缩仪将反应体积浓缩至20 μl。
  5. 接下来，将DNA上样至含1X TAE的1.5%琼脂糖凝胶中，在80-90V电压下电泳3.5小时。用SYBR Green染色后，在DarkReader上观察DNA。切取300至500个碱基对之间的DNA片段，并根据凝胶重量使用2-4个Qiagen胶回收柱进行纯化。用50 μl 1x TLE洗脱DNA。
  6. 合并Qiaquick柱的洗脱液，并用1x TLE将最终体积调至300 μl。最后，使用Quant-iT试剂盒和QuBit荧光计测定DNA浓度，并计算DNA总量。

III. 生物素下拉与成对末端测序

  1. 在本实验方案部分，从DNA文库中纯化连接接头，从而通过成对末端测序高效鉴定相互作用的染色质片段。所有后续步骤均需在DNA LoBind离心管中进行。
  2. 通过以下步骤准备用于生物素下拉的磁珠：将150 μl重悬的磁性链霉亲和素珠用400 μl Tween缓冲液（TB：5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween）洗涤两次。
    此处及后续的每次洗涤均包括以下五个步骤：
    1. 向磁珠中加入缓冲液
    2. 将混合物转移至新离心管中
    3. 室温下旋转孵育3分钟
    4. 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠
    5. 移除上清液
  3. 将磁珠重悬于300 μl 2x无Tween缓冲液（2x NTB：10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，2 M NaCl）中，并与300 μl Hi-C DNA混合。将混合物在室温下旋转孵育15分钟，使标记有生物素的Hi-C DNA与链霉亲和素磁珠结合。
  4. 使用磁性粒子浓缩器回收结合了DNA的链霉亲和素磁珠，移除上清液。用400 μl 1x NTB（5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）洗涤磁珠，随后用100 μl 1x连接缓冲液洗涤。将磁珠重悬于50 μl 1x连接缓冲液中，并将混合物转移至新离心管中。
  5. 为准备Illumina成对末端测序的DNA，取步骤2.6中先前计算的用于生物素下拉的总DNA量，将其除以20，以估算已下拉并可用于连接的Hi-C DNA量。每微克可用于连接的Hi-C DNA中加入6皮摩尔的Illumina成对末端接头。使用1200单位T4 DNA连接酶将接头连接至DNA。室温孵育2小时。
  6. 通过回收结合Hi-C DNA的磁珠，并用400 μl 1x TB洗涤磁珠两次，去除未连接的成对末端接头。
  7. 用200 μl 1x NTB洗涤磁珠，随后依次用200 μl和50 μl 1x NEBuffer 2洗涤。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于50 μl 1x NEBuffer 2中，并转移至新离心管中。
  8. 为确定生成足够测序量PCR产物所需的循环数，设置四个测试性PCR反应，分别进行6、9、12或15个循环。（PCR扩增的详细信息，请参见第12步。）通过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，并用Sybr Green染色，以确定最佳循环数，确保无非特异性条带，并在400–600碱基对之间出现弥散条带，该长度为连接接头后剪切产物的预期大小。
  9. 使用最佳PCR循环数对结合Hi-C文库的链霉亲和素磁珠进行大规模PCR扩增。合并来自不同孔的PCR产物，并回收磁珠。保留1%的大规模PCR产物用于凝胶电泳分析，其余PCR产物按照生产商推荐方法，使用1.8倍体积的Ampure磁珠进行纯化。
  10. 用50 μl 1x TLE缓冲液洗脱DNA，并将Ampure磁珠纯化的PCR产物的1%与原始PCR产物的1%等分试样在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行比较，以确认PCR引物已成功去除。
    1. 我们还建议克隆1 μl Hi-C文库，并通过Sanger测序分析约100个克隆的产物。这将有助于评估PCR混合物中可比对的Hi-C读段的相对数量。典型结果见图3B。
  11. 使用Illumina成对末端测序对Hi-C文库进行测序。使用Maq（http://maq.sourceforge.net/）对每个末端独立比对，以鉴定相互作用的染色质片段。

IV. Hi-C 结果的代表性示例

  1. 当 Hi-C 实验方案操作得当时，应获得以下结果，这些结果可作为质量控制标准。
  2. 质量控制步骤应显示，3C 和 Hi-C 文库均呈现为略大于 10 kb 的较窄条带。若出现 DNA 弥散条带，则表明连接效率较低。通常，Hi-C 文库的连接效率略低于 3C 模板（见图 2A）。
  3. 可通过使用 3C 引物扩增出的 PCR 产物进行酶切，来评估 Hi-C 标记和连接效率。3C 连接位点可被 HindIII 切割而不能被 NheI 切割，而 Hi-C 连接位点则相反。该 PCR 酶切实验显示，70% 的 Hi-C 扩增子可被 NheI 切割而不能被 HindIII 切割，证实了连接位点的有效标记（见图 2B）。
  4. 对测序读段的分析应显示，来自染色体内和染色体间相互作用的读段（分别以蓝色和红色线条表示）比随机生成的读段（绿色表示）更显著地靠近 HindIII 限制性酶切位点（见图 3A）。
  5. 在成功的实验中，55% 的可比对读段对代表染色体间相互作用；15% 代表相距小于 20 kb 的染色体内相互作用，30% 为相距大于 20 kb 的染色体内读段对（见图 3B）。该分布可在高通量测序前通过取样进行质量控制；通常克隆并进行约 100 个克隆的 Sanger 测序即可满足要求。
  6. 染色质相互作用可被可视化为热图，其中 x 轴和 y 轴按基因组顺序表示基因座，每个像素代表两者之间观察到的相互作用次数。通常，在线性基因组中彼此非常接近的 DNA 片段倾向于频繁相互作用。这在染色体内热图中表现为一条明显的对角线（见图 4A）。
  7. 以下结果展示了多种数据分析方法，用于揭示不同层次的基因组结构。绘制接触概率与基因组距离的关系图（见图 5A）显示，接触概率随基因组距离增加而下降，最终趋于平缓。在任一距离上，实线表示的染色体内相互作用均较虚线表示的染色体间相互作用富集。这直接表明存在染色体疆域。
  8. 计算所有染色体对之间的观察值/期望值的染色体间接触数，可揭示特定染色体对之间的优先关联。富含基因的小染色体倾向于彼此相互作用，表现为亮红色（见图 5B）。
  9. 也可对单个染色体进行分析。通过使用期望热图对原始热图进行校正，以消除基因座对之间基因组距离的影响，从而获得观察值/期望值热图。随后，可通过计算观察值/期望值热图的行与列之间的相关性生成相关性矩阵。相关性分析表明，人类基因组被划分为两个区室。这在相关性热图中表现为格子状图案（见图 4A-D）。（有关 Hi-C 数据分析的详细信息，请参见：1）。
  10. 利用 Hi-C 数据，人们对兆碱基尺度上的染色质折叠获得了新的认识。经典的聚合物凝聚模型认为，染色质会折叠成平衡球状结构。将接触概率对距离作图表明，接触概率随基因组距离呈幂律关系变化，其斜率约为 -1（见图 6A）。这与平衡球状结构的行为不符，但与一种称为分形球状结构（fractal globule）的替代模型的预测一致（见图 6B）。
  11. 此处展示了两种球状结构。颜色对应于距一端的距离，从蓝色到青色、绿色、黄色、橙色，再到红色（见图 6C 上图）。与平衡球状结构不同，分形球状结构无缠结现象。在分形球状结构中，沿轮廓线邻近的基因座在三维空间中也倾向于邻近，从而形成单色区块（见图 6C 中图）。此类区块在平衡球状结构中不存在（见图 6C 下图）。

DNA基因编辑示意图；限制性内切酶过程；序列分析；生物素标记方法。
图1. Hi-C技术概述。细胞用甲醛进行交联，使空间上相邻的染色质片段之间形成共价连接（DNA片段：深蓝色、红色；介导此类相互作用的蛋白质以浅蓝色和青色表示）。使用限制性内切酶（此处为HindIII；限制性位点：虚线，见插图）消化染色质。将产生的黏性末端用核苷酸填补，其中一种核苷酸被生物素标记（紫色点）。在极稀释条件下进行连接反应，以促进分子内连接事件；此时HindIII位点丢失，并形成一个新的NheI位点（插图）。随后纯化DNA并进行片段化处理，利用链霉亲和素磁珠富集带有生物素标记的连接位点。通过双端测序鉴定相互作用的DNA片段。

使用 HindIII 和 NheI 酶进行 3C 和 Hi-C DNA 消化后的琼脂糖凝胶电泳比较。
图 2. Hi-C 文库质量控制。(A) 将不同量的 3C 对照和 Hi-C 文库在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。两个文库均呈现为略大于 10 kb 的较紧密条带。Hi-C 文库中的典型连接效率略低于 3C 模板中的连接效率，这可通过 Hi-C 泳道中出现的弥散条带（smear）来体现。(B) PCR 消化对照。使用标准 3C PCR 条件扩增由两个邻近片段形成的连接接头。通过消化连接位点可区分 Hi-C 与传统 3C 产生的连接产物。Hi-C 接头可被 NheI 切割，但不能被 HindIII 切割；而 3C 接头则相反。70% 的 Hi-C 扩增子被 NheI 切割，证实连接接头被有效标记。为确保定量结果可靠，实验设置了两个重复。

Hi-C 数据分析；折线图和柱状图；读段分布比较；基因组研究。
图 3. Hi-C 读段质量控制。（A）来源于染色体内（蓝色）和染色体间（红色）相互作用片段的读段，相较于随机生成的读段（绿色），在HindIII限制性酶切位点附近显著更密集地比对。染色体内读段和染色体间读段的曲线均随着与HindIII位点距离的增加而迅速下降，直至在约500 bp处达到平台期。该距离对应于用于测序的最大片段大小。（B）通常情况下，可比对读段对中约55%代表染色体间相互作用，15%代表间隔小于20 kb的染色体内相互作用，30%为间隔大于20 kb的染色体内读段对。该分布可在高通量测序前通过取样进行质量控制评估；通常克隆并进行约100个克隆的Sanger测序即已足够。

染色体14的相互作用分析，包含观测值、期望值、比值以及皮尔逊相关性热图。
图4. 相关性分析表明细胞核被划分为两个区室。(A) 染色体14上染色体内相互作用对应的热图。每个像素代表一个1-Mb位点与另一个1-Mb位点之间的所有相互作用；颜色强度对应于测序读段总数（范围：0–200条读段）。刻度标记每10 Mb出现一次。该热图呈现出明显的结构特征，包括一条强烈的对角线以及一系列较大的区块。（染色体14为近端着丝粒染色体；短臂未显示。）利用Hi-C数据集计算在特定基因组距离下两个位点之间的平均接触概率，可生成一个期望矩阵（B），该矩阵表示在不存在长距离结构情况下的预期结果。上述两个矩阵的商即为观测值/期望值矩阵（C），其中蓝色表示信号耗竭，红色表示信号富集［范围：0.2（蓝色）至5（红色）］。区块模式在此图中更加清晰。相关性矩阵（D）展示了染色体14上每一对位点的染色体内相互作用谱之间的相关性［范围：-1（蓝色）至1（红色）］。明显的格纹模式表明染色体内存在两个区室。

接触概率图；染色体内与染色体间；人类染色体相互作用矩阵。
图5. 染色体区域的存在及其组织方式。（A）染色体1上接触概率随基因组距离增加而下降，最终在约90 Mb处达到平台期（蓝色）。不同染色体对之间的染色体间接触水平存在差异；染色体1上的位点最可能与染色体10上的位点相互作用（绿色虚线），而最不可能与染色体21上的位点相互作用（红色虚线）。相对于染色体内相互作用，染色体间相互作用减少。（B）所有染色体对之间染色体间接触的观测值/期望值。红色表示富集，蓝色表示耗竭［范围：0.5（蓝色）至2（红色）］。较小且基因富集的染色体倾向于彼此之间发生更多相互作用。

聚合物折叠；双对数图；接触概率与距离关系；分形模型与平衡模型。
图6. 染色质的局部堆积方式与分形球状结构的行为一致。（A）全基因组平均的接触概率随基因组距离的变化关系（蓝色）。在500 kb至7 Mb范围内（阴影区域）观察到显著的幂律标度行为，斜率为-1.08（青色线为拟合结果）。（B）平衡球状结构（红色）和分形球状结构（蓝色）的模拟结果，显示接触概率随距离的变化关系。分形球状结构的斜率接近-1（青色），验证了我们提出的新理论预测1。平衡球状结构的斜率为-3/2，符合以往的理论预期。分形球状结构的斜率与Hi-C实验结果中观察到的斜率非常相似，而平衡球状结构的斜率在Hi-C数据中并未出现。（C）上图：一条展开的聚合物链，包含4000个单体。颜色表示距离链一端的距离，从蓝色到青色、绿色、黄色、橙色，再到红色。中图：从我们的系综中生成的一个典型的分形球状结构示例。分形球状结构无缠结现象。沿着链轮廓相近的位点在三维空间中也倾向于靠近，从而形成大块的单色区域，在表面和截面中均清晰可见。下图：一个平衡球状结构。该结构高度缠结；沿着链轮廓相近的位点（颜色相似）在三维空间中不一定靠近。

讨论

我们介绍一种通过无偏倚、全基因组范围的染色质相互作用作图来研究基因组三维结构的方法。最关键的实验步骤——也是使该技术区别于以往工作的核心环节——是在交联片段的限制性酶切末端连接之前，引入生物素标记的核苷酸。成功完成这一步骤可实现对所有连接位点的深度测序，从而赋予Hi-C技术广泛的覆盖范围和强大的分析能力。

测序读段的数量最终将决定相互作用图谱的分辨率。此处展示的是利用约3000万条可比对读段绘制的人类基因组1 Mb分辨率的相互作用图谱。为了将“通用”分辨率提高一个数量级 n，测序读段数量必须增加一个倍数 n2.

Hi-C 技术可轻松与其他技术结合使用，例如在文库构建后进行杂交捕获（以靶向基因组的特定区域），或在连接反应后进行染色质免疫沉淀（以研究与特定蛋白质相关的区域的染色质环境）。

披露

一种关于Hi-C方法的临时专利（编号61/100,151）正在审查中。

致谢

感谢 A. Kosmrlj 提供的讨论和代码；感谢 A. P. Aiden、X. R. Bao、M. Brenner、D. Galas、W. Gosper、A. Jaffer、A. Melnikov、A. Miele、G. Giannoukos、C. Nusbaum、A. J. M. Walhout、L. Wood 和 K. Zeldovich 提供的讨论；感谢 L. Gaffney 和 B. Wong 在可视化方面提供的帮助。

本研究得到了Fannie和John Hertz基金会研究生奖学金、国家国防科学与工程研究生奖学金、美国国家科学基金会（NSF）研究生奖学金、国家太空生物医学研究所、美国国家人类基因组研究所（NHGRI）资助项目编号T32 HG002295（E.L.）；i2b2（生物与临床信息整合信息学）项目及美国国立卫生研究院（NIH）资助的布莱根妇女医院生物医学计算中心（L.A.M.）；NHGRI资助项目编号HG003143以及Keck基金会杰出青年学者奖（J.D.）的支持。原始及比对后的Hi-C测序数据已存入GEO数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），登录号GSE18199。更多可视化数据可访问http://hic.umassmed.edu。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichP8340-5ml步骤 1.2
生物素-14-dCTPInvitrogen19518-018步骤 1.6
KlenowNew England BiolabsM0210步骤 1.6 和 2.2
T4 DNA 连接酶Invitrogen15224步骤 1.9
T4 DNA 聚合酶New England BiolabsM0203步骤 1.17 和 2.2
10x 连接缓冲液New England BiolabsB0202步骤 2.2 和 3.4
T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）New England BiolabsM0201步骤 2.2
Klenow (exo-)New England BiolabsM0212步骤 2.3
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠Invitrogen650.01步骤 3.2
T4 DNA 连接酶 HCEnzymaticsL603-HC-L步骤 3.5
Phusion HF 预混液New England BiolabsF531步骤 3.8
Ampure 磁珠Beckman Coulter Inc.A2915步骤 3.9

参考文献

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