使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过siRNA敲低Namalwa细胞中IL-4依赖性基因表达

摘要

本实验方案介绍了一种快速简便的工作流程，用于将siRNA导入难转染的细胞系，并通过实时PCR检测基因表达。使用自动细胞计数仪、多孔电穿孔板和自动电泳工作站，无需昂贵的机器人操作设备，即可获得快速且可靠的结果。

摘要

小干扰RNA介导的基因敲低技术在基因表达研究中持续发挥着重要作用。目前，siRNA研究不仅用于分析单个基因下调所产生的效应，还广泛应用于信号通路及其他复杂相互作用网络的探究。此类通路分析需要采用相关的细胞模型，并使用对细胞生理状态干扰较小的实验方法。电穿孔技术正日益成为将siRNA及其他核酸分子高效导入难转染细胞系和原代细胞的有效手段，同时避免对所研究的信号通路造成干扰。一个成功的siRNA实验包含多个关键步骤，且在多个实验环节中存在简化操作并提升数据质量的方法。为帮助您顺利开展siRNA介导的基因敲低项目，本文将演示从电穿孔前的细胞收集与计数，到转染后实时定量PCR基因表达分析的完整通路研究流程。本研究旨在探讨转录激活因子STAT6在伯基特淋巴瘤细胞系（Namalwa）中对IL-4依赖性CCL17基因表达的调控作用。所展示的技术适用于多种基于siRNA的实验，涵盖贴壁细胞和悬浮细胞。我们还将展示如何利用TC10全自动细胞计数仪简化细胞计数流程，如何使用MXcell电穿孔系统同时对多个样品进行电穿孔，以及如何利用Experion全自动电泳系统同步评估RNA的质与量。

方案

1. 准备和计数 Namalwa 细胞

1. 从培养瓶中取出细胞并离心，使细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞重悬于已知体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中。本实验方案所用细胞为悬浮细胞。如果使用贴壁细胞，则在收集前需进行胰酶消化处理。
2. 为确定活细胞数量，取部分细胞悬液，与0.4%台盼蓝溶液按1:1比例混合染色，用移液器吸取10 μl混合液加入计数载片，然后将载片插入TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad Laboratories, Inc）中进行计数。
3. TC10细胞计数仪将自动对焦以确保计数的准确性，随后开始计数，并自动计算样品中活细胞和总细胞的密度。
4. 选择“查看图像”以在屏幕上显示细胞图像，然后选择“稀释计算器”，TC10细胞计数仪将自动计算所需细胞悬液的体积。
5. 本实验共使用三种siRNA：一种对照siRNA、两种靶向STAT6基因的不同siRNA，另设未转染对照组。实验共需3.6 ml细胞悬液，终浓度为每毫升5 × 10⁶个细胞。
6. 将目标浓度和终体积数值输入稀释计算器，仪器将根据该样品的活细胞计数自动计算所需细胞悬液的体积。也可手动完成计算。随后，将所需体积的细胞悬液转移至新的离心管中。
7. 离心细胞悬液使细胞沉淀，弃去全部PBS。将细胞重悬于3.6 ml Gene Pulser电穿孔缓冲液（Bio-Rad Laboratories）中。取800 μl等分试样分别加入含有相应siRNA的离心管中，轻轻混匀。此时细胞已准备好进行电穿孔转染。

2. 在96孔板中对细胞进行电穿孔

1. 96孔电穿孔板可同时对全部四种处理的重复样本进行电穿孔。
2. 将150 μl细胞悬液转移至96孔电穿孔板的相应孔中。
3. 将电穿孔板插入MXcell电穿孔板腔室，并盖上盖子。
4. 使用针对所用细胞系和缓冲液优化的电穿孔参数进行电穿孔。本实验中采用指数衰减脉冲波形，仪器设置为250 V、350 μF和1000 Ω电阻。
5. 电穿孔完成后，轻轻吹打每孔中的细胞悬液以混匀，随后将细胞转移至含有预热培养基的组织培养板中。Namalwa细胞在RPMI（Life Technologies）培养基中培养，培养基中添加7.5%胎牛血清（FCS）和1%丙酮酸钠。
6. 未进行电穿孔的对照样品取自剩余的细胞悬液，并与电穿孔组细胞相同地接种至含有预热培养基的培养皿中。
7. 将细胞在37°C、5% CO₂条件下培养过夜。
8. 24小时后，其中一组细胞加入重组IL-4（R&D Systems），使其终浓度为10 ng/ml，进行诱导；另一组对照细胞仅补充新鲜培养基。所有细胞继续在37°C、5% CO₂条件下额外培养24小时。

3. 提取并检测 RNA

1. 经过总共 48 小时的培养后，计数每个孔中的细胞，并将每个孔中的一份等分试样转移至微量离心管中用于 RNA 提取，另一份等分试样则冷冻保存，用于后续的蛋白质印迹或其他蛋白质分析。
2. 离心样品以沉淀细胞，然后移除并弃去每根离心管中的上清液。
3. 继续进行 RNA 提取。我们通常按照说明书使用 Aurum 总 RNA 试剂盒（Bio-Rad）。
4. 在监测 siRNA 介导的基因敲低时，尤其需要验证 RNA 质量，因为降解的 RNA 会导致误导性的结果。260/280 比值无法反映 RNA 的完整性，因此必须通过琼脂糖凝胶电泳或微流控装置检测样品，以确认 RNA 未发生降解。
5. 为在一步内评估 RNA 的质量和数量，将使用 Experion 自动化电泳系统（Bio-Rad）分析这些样品。
6. 首先加热样品，然后对 Experion RNA 芯片进行引物启动、上样并涡旋混匀。将芯片插入 Experion 电泳仪中并启动运行。
7. 运行完成后，Experion 软件将自动显示结果，包括电泳图谱、结果表格（显示 RNA 浓度、核糖体比值和 RNA 质量指示数值）以及虚拟凝胶图像（与传统的 RNA 凝胶图像相似）。高质量的总 RNA 样品通常具有 8–10 的 RQI 值。

4. 实时荧光定量 PCR

1. 在确认RNA质量后，进行cDNA反应。本实验采用iScript一步法RT-PCR混合液（Bio-Rad），将cDNA合成与实时PCR反应合并在一步中完成。
2. 为每对引物配制主混合液，包含除RNA模板外的所有反应组分，并将其分装至PCR板中。
3. 将RNA稀释至统一浓度后，将RNA样品加入相应的孔中。每个反应设置三个重复。
4. 密封PCR板，放入CFX384实时PCR系统（Bio-Rad）中。选择合适的程序并开始运行。
5. 运行结束后，通过比较实验siRNA电穿孔细胞中目标基因相对于参照基因的表达水平，与对照siRNA电穿孔细胞中相同归一化处理后的表达水平，确定基因表达变化。

5. siRNA 沉默效果分析

1. 通过定量实时 PCR 检测 CCL17 的表达，以研究转录激活因子 STAT6 在 IL-4 依赖性诱导 CCL17 表达中的作用。本实验中以 GAPDH 作为参考基因，也可采用其他参考基因或多个参考基因进行类似分析。
2. CFX Manager 软件通过在软件的实验设置窗口中将 GAPDH 选择为"参考"，将对照处理（未进行 IL-4 诱导的对照 siRNA）选择为"对照"，自动将 CCL17 的表达量归一化至同一样本中参考基因的表达水平，并自动将归一化后的数值与对照处理进行比较。
3. 在无 IL-4 诱导的情况下，CCL17 的转录维持在较低的组成型水平，与对照处理相当。
4. 经 IL-4 诱导且 STAT6 通路正常的细胞（即转染对照 siRNA 或未转染的对照处理）中，CCL17 表达量升高了 8 至 10 倍。
5. 经 IL-4 诱导但通过转染 STAT6 siRNA 抑制 STAT6 表达的细胞中，CCL17 表达量仅比未诱导细胞高出约 2 倍，从而证实了 STAT6 在 IL-4 诱导 CCL17 表达过程中的关键作用。

6. 代表性结果

图1. IL-4 信号通路概述。
A) IL-4 与其受体结合后导致 STAT6 的二聚化和激活。活化的 STAT6 转位至细胞核，启动其靶基因（如 CC17）的转录。
B) 在无 IL-4 诱导的情况下，CCL17 的转录将维持在低水平的基础表达状态。
C) 在通过 siRNA 介导沉默 STAT6 基因后，使用 IL4 处理应几乎不会引起 CCL17 表达的增加。

图2. 不同条件下通过定量实时PCR检测IL-4诱导CCL17的表达。
A) 未添加IL-4培养的样本中，无论基因表达情况如何，CCL17均维持在较低的基础表达水平。
B) 如绿色和蓝色所示，对照样本对IL-4处理表现出正常的响应，CCL17表达上调8-10倍。然而，转染靶向STAT6的siRNA的细胞（红色和粉色所示）在IL-4刺激下CCL17的表达显著降低，支持STAT6在IL-4诱导CCL17表达中发挥作用的观点。

讨论

本文已演示了如何将siRNA电穿孔转染至难以转染的悬浮细胞系中，以及如何在这些细胞中检测基因表达。进行该实验操作时，重要的是要记住在所有样品中尽可能保持条件一致。