使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过siRNA敲低Namalwa细胞中IL-4依赖性基因表达

摘要

本实验方案介绍了一种快速简便的工作流程，用于将siRNA导入难转染的细胞系，并通过实时PCR检测基因表达。使用自动细胞计数仪、多孔电穿孔板和自动电泳工作站，无需昂贵的机器人操作设备，即可获得快速且可靠的结果。

摘要

小干扰RNA介导的基因敲低技术在基因表达研究中持续发挥着重要作用。目前，siRNA研究不仅用于分析单个基因下调所产生的效应，还广泛应用于信号通路及其他复杂相互作用网络的探究。此类通路分析需要采用相关的细胞模型，并使用对细胞生理状态干扰较小的实验方法。电穿孔技术正日益成为将siRNA及其他核酸分子高效导入难转染细胞系和原代细胞的有效手段，同时避免对所研究的信号通路造成干扰。一个成功的siRNA实验包含多个关键步骤，且在多个实验环节中存在简化操作并提升数据质量的方法。为帮助您顺利开展siRNA介导的基因敲低项目，本文将演示从电穿孔前的细胞收集与计数，到转染后实时定量PCR基因表达分析的完整通路研究流程。本研究旨在探讨转录激活因子STAT6在伯基特淋巴瘤细胞系（Namalwa）中对IL-4依赖性CCL17基因表达的调控作用。所展示的技术适用于多种基于siRNA的实验，涵盖贴壁细胞和悬浮细胞。我们还将展示如何利用TC10全自动细胞计数仪简化细胞计数流程，如何使用MXcell电穿孔系统同时对多个样品进行电穿孔，以及如何利用Experion全自动电泳系统同步评估RNA的质与量。

方案

1. 准备和计数 Namalwa 细胞

1. 从培养瓶中取出细胞，离心使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于已知体积的 PBS 中。本实验所用细胞为悬浮细胞。若使用贴壁细胞，则需在收集前进行胰蛋白酶消化处理。
2. 为确定活细胞数量，取部分细胞悬液，与 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1 比例混合染色，用移液器吸取 10 μl 混合液加入计数载玻片，然后将载玻片插入 TC10 自动细胞计数仪（Bio-Rad Laboratories, Inc）中进行计数。
3. TC10 细胞计数仪将自动对焦以确保计数的准确性，随后自动完成计数，并计算出样品中活细胞和总细胞的密度。
4. 选择“查看图像”以在屏幕上显示细胞图像，然后选择“稀释计算器”，由 TC10 细胞计数仪自动计算所需细胞悬液的体积。
5. 本实验共使用三种 siRNA：一种对照 siRNA、两种靶向 STAT6 基因的不同 siRNA，以及未转染的对照组。所需细胞终浓度为每毫升 5 × 10⁶ 个细胞，总体积为 3.6 ml。
6. 将所需的细胞浓度和最终体积输入稀释计算器，仪器将根据该样品的活细胞计数自动计算所需细胞悬液的体积。也可手动完成计算。然后将计算所得体积的细胞悬液转移至新的离心管中。
7. 将细胞悬液离心使细胞沉淀，并完全去除 PBS。用 3.6 ml Gene Pulser 电穿孔缓冲液（Bio-Rad Laboratories）重悬细胞。将 800 μl 细胞悬液分装至含有相应 siRNA 的离心管中，轻轻混匀。此时细胞已准备就绪，可进行电穿孔转染。

2. 在96孔板中对细胞进行电穿孔

1. 96 孔电穿孔板可同时对全部四种处理的重复样本进行电穿孔。
2. 将 150 μl 细胞悬液转移至 96 孔电穿孔板的相应孔中。
3. 将板插入 MXcell 电穿孔板腔室，并关闭盖子。
4. 使用针对所用细胞系和缓冲液优化的参数进行电穿孔。本实验中采用指数衰减波，仪器设置为 250 V、350 μF 和 1000 Ω 电阻。
5. 电穿孔完成后，轻轻吹打每个孔以混匀细胞，然后将细胞转移至含有预热培养基的组织培养板中。Namalwa 细胞在 RPMI（Life Technologies）培养基中培养，添加 7.5% FCS 和 1% 丙酮酸钠。
6. 未进行电穿孔的对照样品取自剩余的细胞悬液，与电穿孔细胞相同地加入预热的培养皿培养基中。
7. 将细胞在 37°C、5% CO₂ 条件下培养过夜。
8. 24 小时后，一组细胞加入重组 IL-4（R&D Systems），终浓度为 10 ng/ml 进行诱导；另一组对照细胞仅补充新鲜培养基。所有细胞继续在 37°C 和 5% CO₂ 条件下培养额外 24 小时。

3. 提取并检测 RNA

1. 经过总共 48 小时的培养后，计数每个孔中的细胞，并从每个孔中转移一份等分试样至微量离心管中用于 RNA 提取，另一份等分试样则冷冻保存，用于后续的蛋白质印迹或其他蛋白质分析。
2. 离心样品以沉淀细胞，然后移除并弃去每管中的上清液。
3. 随后进行 RNA 提取。我们通常使用 Aurum 总 RNA 试剂盒（Bio-Rad），并按照试剂盒提供的操作说明进行。
4. 在监测 siRNA 介导的基因敲低时，尤其需要验证 RNA 的质量，因为降解的 RNA 会导致误导性的结果。260/280 比值并不能反映 RNA 的完整性，因此必须通过凝胶电泳或微流控装置检测样品，以确认 RNA 未发生降解。
5. 为在一步内评估 RNA 的质量和数量，这些样品将使用 Experion 自动化电泳系统（Bio-Rad）进行分析。
6. 首先加热样品，然后对 Experion RNA 芯片进行预处理、加样并涡旋混匀。将芯片插入 Experion 电泳仪中，启动运行程序。
7. 运行完成后，Experion 软件将自动显示结果，包括电泳图谱、结果表格（显示 RNA 浓度、核糖体比值和 RNA 质量指示数值）以及虚拟凝胶图像（其外观类似于传统的 RNA 凝胶）。高质量的总 RNA 样品通常具有 8–10 的 RQI 值。

4. 实时荧光定量PCR

1. 在确认 RNA 质量后，进行 cDNA 反应。本实验采用 iScript 一步法 RT-PCR 混合液（Bio-Rad），将 cDNA 合成与实时 PCR 反应合并为一步完成。
2. 配制主混合液，包含除 RNA 模板外每对引物所需的全部反应组分，并将其分装至 PCR 板中。
3. 将 RNA 稀释至统一浓度后，将 RNA 样品加入相应的孔中。每个反应设三个重复。
4. 密封 PCR 板，放入 CFX384 实时 PCR 系统（Bio-Rad）中。选择合适的程序并开始运行。
5. 运行结束后，通过比较实验 siRNA 电穿孔细胞中目的基因相对于参照基因的表达水平，与对照 siRNA 电穿孔细胞中相同归一化处理的结果，确定基因表达变化。

5. siRNA 沉默效果分析

1. 为了研究转录激活因子STAT6在IL-4依赖性诱导CCL17表达中的作用，采用定量实时PCR检测CCL17的表达水平。本实验中使用GAPDH作为参考基因，也可采用其他参考基因或多个参考基因进行类似分析。
2. CFX Manager软件可自动将同一标本中CCL17的表达量归一化至参考基因的表达量，并只需在CFX Manager软件的实验设置窗口中选择GAPDH为“参考基因”、对照处理（未进行IL-4诱导的对照siRNA）为“对照”，即可自动将归一化后的数值与对照处理组进行比较。
3. 在无IL-4诱导的情况下，CCL17的转录维持在较低的基础水平，与对照处理组相当。
4. 经IL-4诱导且STAT6信号通路正常的细胞（即转染对照siRNA或未转染的对照处理组）中，CCL17的表达量升高了8至10倍。
5. 经IL-4诱导但通过导入STAT6 siRNA抑制STAT6表达的细胞中，CCL17的表达量仅比未诱导细胞高出约2倍，从而证实了STAT6在IL-4诱导CCL17表达过程中的关键作用。

6. 代表性结果

图 1. IL-4 信号通路概述。
A) IL-4 与其受体结合后，导致受体二聚化并激活 STAT6。活化的 STAT6 转位至细胞核，启动其靶基因（如 CC17）的转录。
B) 在无 IL-4 诱导的情况下，CCL17 的转录将维持在低水平的基础表达状态。
C) 在通过 siRNA 介导沉默 STAT6 基因后，即使使用 IL-4 处理，CCL17 表达也应几乎不升高或无明显增加。

图2. 通过不同条件下的定量实时PCR检测IL4诱导的CCL17表达。
A) 未添加IL-4培养的样品中，无论基因表达情况如何，CCL17均维持在较低的基础表达水平。
B) 如绿色和蓝色所示，对照样品对IL-4处理表现出正常响应，CCL17表达上调8-10倍。然而，转染靶向STAT6的siRNA的细胞（如红色和粉色所示）在IL-4刺激下CCL17表达显著降低，支持STAT6在IL-4诱导CCL17表达中发挥作用的观点。

讨论

本文已演示了如何将siRNA电穿孔转染至难以转染的悬浮细胞系中，以及如何在这些细胞中检测基因表达。进行该实验操作时，重要的是要记住在所有样品中尽可能保持条件一致。