我们介绍一种制备澄清的人类大脑皮层匀浆物的技术，通过SDS-PAGE进行蛋白质分离，抗原修复，并使用针对Aβ肽的抗体进行免疫印迹。采用该方案，我们能够持续在患有阿尔茨海默病病理的人类皮层组织中检测到单体及多聚体形式的Aβ。
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摘要
摘要
β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的异常折叠与聚合被认为会启动阿尔茨海默病发病过程中的神经退行性级联反应1Aβ 主要是由40或42个氨基酸组成的多肽，易于自我聚集形成富含β片层结构的淀粉样纤维，这些纤维存在于阿尔茨海默病患者脑内老年斑的核心中。越来越多的证据表明，低分子量、可溶性的Aβ多聚体比纤维状的Aβ淀粉样蛋白更具毒性。2在阿尔茨海默病研究中，识别和定量脑组织中低分子量与高分子量的多聚Aβ物种是一项基本目标，所采用的方法也可用于其他蛋白质病中毒性多聚体的鉴定与表征。3. 天然存在的 Aβ 多聚体可通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后使用 Aβ 特异性抗体进行免疫印迹检测。然而，分离和检测多聚体 Aβ 需要使用高浓度的皮质匀浆液，并在小孔径硝酸纤维素膜上进行抗原表位修复。本文介绍一种制备澄清人脑皮质匀浆液的技术，通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并利用针对 Aβ 肽 N 端区域的 6E10 抗体进行抗原表位修复及蛋白质印迹分析。采用本方案，我们能够持续在阿尔茨海默病病理患者的人脑皮质组织中检测到 Aβ 单体、二聚体、三聚体、四聚体以及更高分子量的多聚体。
方案
第1部分：澄清组织匀浆液的制备
- 使用约4倍体积的预冷缓冲液（0.1 M 磷酸盐缓冲液［无 Ca++ 和 Mg++］，加入2倍量的蛋白酶抑制剂混合物［Santa Cruz］），对未固定的皮质组织进行Dounce匀浆处理，匀浆过程约需30次均匀的研磨冲程（例如，向100 mg组织中加入400 μl缓冲液）。
- 将匀浆液在3,000g条件下离心5分钟（4°C）。小心收集上清液，并将提取物分装后于-80°C保存备用。
- 根据制造商说明（ThermoFisher），采用二辛可宁酸（BCA）法测定澄清匀浆液的总蛋白浓度（μg/μl）。
第2部分：SDS-PAGE样品制备
- 使用10孔、10-20% Tricine凝胶（Invitrogen）时，每孔最大上样体积约为25μl。总体积包括2x SDS上样缓冲液和10x还原剂，因此每孔最多可上样10μl澄清的匀浆液。澄清的20%（w/v）皮层匀浆液的总蛋白浓度应高于5 μg/μl，以保证每孔上样50μg总蛋白。蛋白浓度低于5mg/ml的样品将需要减少每孔上样的总蛋白量。然而，较高的蛋白水平更有利于单体及聚集态Aβ的检测（每孔50-60μg总蛋白为最佳）。
每孔务必上样相同量的总蛋白。 - 每块凝胶至少留一孔上样10μl分子量标记物，如SeeBlue Plus2（Invitrogen）。另设一孔作为阳性对照，上样10-100ng合成Aβ40或Aβ42肽段（用1x PBS稀释）。
- 在冰上配制反应混合物，使用新鲜解冻并已澄清的匀浆液。涡旋振荡管子5-10秒，在干浴仪中100°C加热5分钟，然后迅速离心所有样品以去除管盖内的冷凝液。
第3部分：SDS-PAGE凝胶电泳
- 根据制造商说明（Invitrogen），使用Tricine SDS电泳缓冲液，在XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox中将涡旋混匀的样品上样至10–20% Tricine凝胶中，
- 以恒定电压125 V电泳约90分钟。电泳至4 kDa标记条带距凝胶底部约1 cm处为止。
第4部分：将蛋白质从凝胶转移至膜上
- 根据制造商说明（Invitrogen），小心地将凝胶从塑料外壳中取出，并在 XCell II Blot Module 内组装转膜夹心结构。使用含 20% 甲醇的 Tris-甘氨酸转移缓冲液预湿印迹垫片和 0.2μm 硝酸纤维素膜，并去除印迹垫片或滤纸/膜夹心结构中的任何气泡。
- 在 XCell Gelbox 中，向内槽加入转移缓冲液，向外槽加入 dIH2O（长期接触甲醇可能会导致塑料凝胶盒老化）。
- 以恒定电流 25mA 运行转膜 2–3 小时。
- 转膜完成后，拆解夹心结构，将凝胶放入盛有 dIH2O 的方形塑料培养皿（或其他合适的容器）中，同时将膜放入 1×PBS 中。
- 为观察蛋白质转膜效率，可分别使用 Simply Blue SafeStain（Invitrogen）对凝胶染色，以及使用 Ponceau S 红染色液（Sigma Aldrich）对膜染色，具体操作均按照制造商说明进行。此类染色不会干扰后续的免疫印迹实验。若染色结果显示转膜效率不佳，应调整第 3 步中的转膜时间。
第5部分. 抗原表位修复与免疫印迹
- 抗原修复是免疫印迹过程中暴露膜上 Aβ 表位以供抗体结合的重要步骤。任何能够维持 100°C 恒温的蒸锅、微波炉或水浴装置均可使用。若使用蒸锅进行抗原修复，需在室温下将膜密封于装有 1xPBS 的高强度 Kapak 塑料袋中。将袋子平放于预热好的蒸锅内；当袋子开始膨胀后，继续孵育 15 分钟。取出前让膜在袋中缓慢冷却，以防止过度皱缩。
- 在室温下小心从蒸煮袋中取出膜，先用 1xPBS 漂洗 5 分钟，随后在 TBS-T（Tris 缓冲盐水，pH 8.0，含 0.05% Tween-20 [Sigma]）中于旋转摇床上漂洗 5 分钟。将膜置于封闭液（含 2.5% 脱脂奶粉的 TBS-T）中，室温震荡孵育 1 小时。无需漂洗，直接将膜转移至含有用封闭液稀释的一抗（6E10，1:1,000 [1μg/ml] 或 1:5,000 [0.2μg/ml]，Covance）的培养皿或塑料袋中，避免产生气泡。先在室温下于旋转摇床上孵育 1 小时，随后在 4°C 震荡孵育 24–48 小时（更长的孵育时间可能获得更强信号）。
- 用 TBS-T 漂洗膜 30 分钟（一次快速漂洗，随后进行三次每次 10 分钟的漂洗）。
- 将膜置于 HRP 标记的二抗（Amersham ECL 羊抗小鼠抗体，GE Healthcare）中，按 1:10,000 比例用封闭液稀释，在室温下于摇床上孵育 90 分钟。
- 用 TBS-T 漂洗膜 30 分钟（一次快速漂洗，随后进行三次每次 10 分钟的漂洗）。
- 在摇床上，将膜与新配制的 SuperSignal West Pico 电化学发光试剂（ThermoFisher）孵育 5 分钟，用无绒滤纸吸去多余试剂，将膜夹在塑料保护膜之间并放入胶片暗盒中。如有必要，可用无尘 Kimwipes 纸进一步吸除多余的 SuperSignal 试剂。
- 使用 Kodak Biomax MR 胶片曝光，时间从 30 秒至 30 分钟不等，并在胶片显影仪中显影。通常 5 分钟后，Aβ 单体条带可能已饱和。
- 若需重复检测其他抗体，可在用 TBS-T 漂洗后，将膜在 Restore Plus 洗脱缓冲液中室温震荡洗脱 30 分钟，随后重新进行抗体孵育。
第6部分：代表性免疫印迹：
图1a-c. 对来自7名人类受试者的含50μg总蛋白的澄清匀浆进行多聚体Aβ和APP的检测。使用6E10抗体进行免疫印迹，在所有阿尔茨海默病病例中均检测到Aβ单体、二聚体、三聚体、四聚体以及APP（最上方条带），并在2例AD病例中发现大量高分子量Aβ多聚体。合成Aβ40用于确认低分子量条带的身份。AD：阿尔茨海默病，DLB：路易体痴呆，ND：无痴呆人类。(a) 30分钟胶片曝光，(b) 5分钟胶片曝光，(c) 30秒胶片曝光。
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讨论
尽管Aβ聚集在阿尔茨海默病发病机制中具有重要意义1,4,5，但很少有研究描述或量化人脑皮层组织样本中多种Aβ多聚体的分布情况2。常用的免疫组织化学技术无法在固定的皮层组织中区分不同的多聚体Aβ亚型。在未固定的皮层组织匀浆中，可通过凝胶电泳结合基于抗体的检测方法对Aβ多聚体进行分离和生物化学分析。然而，所靶向的Aβ表位可能被包裹在聚集态或翻译后修饰的肽结构内部，从而阻碍了对聚集态Aβ的检测和准确定量。通过采用热诱导抗原-表位修复技术，结合SDS-PAGE以及针对Aβ N端区域的抗体进行免疫印迹6,7，我们能够分离并检测从人脑组织中提取的天然存在的Aβ多聚体。随后，可通过密度测定法对澄清组织匀浆中不同Aβ多聚体群体进行定量。此外，将凝胶或膜提取技术与Aβ免疫印迹相结合，可进一步对来源于人体组织的天然存在且经过翻译后修饰的Aβ多聚体进行结构表征。明确人脑中的Aβ多聚体是否具有SDS抗性，或是否为SDS敏感型（即在特定条件下经SDS变性后会分解为较小的聚集体）将具有重要意义。对人脑中各种聚集态Aβ形式的系统表征，将有助于推动阿尔茨海默病治疗手段及生物标志物的研发。
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致谢
感谢Elaine Pranski和Carolyn Suwyn提供的出色技术协助，感谢Harry LeVine III、M. Paul Murphy和Marla Gearing的重要讨论。本研究由RR-00165、PO1AG026423、P50AG025688、AG030539、伍德拉夫基金会以及埃默里大学研究委员会提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 完全蛋白酶抑制剂混合物片剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1片溶于25 ml缓冲液中 |
| BCA 蛋白质测定试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司 | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转膜模块试剂盒 CE 标志 | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS 样品缓冲液 (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE 样品还原剂（10X） | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 预染标准蛋白 Marker | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine 胶，1.0 mm，10 孔 | Invitrogen | EC6625BOX | |
| 硝酸纤维素膜，0.2 μm孔径 | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS 电泳缓冲液（10X） | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-甘氨酸转膜缓冲液（25X） | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 不会干扰免疫染色 |
| ATX Ponceau S 红色染色液 | Sigma-Aldrich | 09276 | 不会干扰免疫染色 |
| 可热封塑料样品袋 | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 小鼠单克隆抗体抗 Aβ(1-16) | 科文斯 | SIG-39320 | WB 检测中按 1:1,000 至 1:5,000 比例稀释 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL 小鼠 IgG，HRP 标记的完整抗体β （来自绵羊） | GE Healthcare | NA931-1ML | 稀释比例为1:10,000 |
| SuperSignal West Pico 化学发光底物 | 赛默飞世尔科技公司 | 34077 | |
| Kodak Biomax MR 胶片 | 锐珂医疗 | 870 1302 |
参考文献
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
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