本视频演示了为通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质而制备超薄基质/分析物层的方法。
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摘要
摘要
本视频展示了用于通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质的超薄基质/分析物层的制备方法 1,2超薄层法涉及在样品板上制备一层基质晶体（α-氰基-4-羟基肉桂酸）的基底，该基底可作为后续基质/分析物混合物结晶的成核基础。与其它样品点样方法相比，超薄层法具有以下优势（例如 干燥液滴法的优点包括：(i) 对盐类和去污剂等杂质具有更高的耐受性，(ii) 分辨率更优，以及 (iii) 空间分布更均匀。该方法特别适用于蛋白质的精确质谱测定。该实验方案最初为膜蛋白分析而开发并优化，已成功用于分析含有 2 至 12 个跨膜结构域的离子通道、代谢物转运蛋白和受体。 2自首次发表以来，该方法也被证明同样适用于可溶性蛋白质的分析。事实上，我们已将其应用于大量具有广泛特性的蛋白质，包括分子质量高达380 kDa的蛋白质。 3目前，该方法是我们进行所有蛋白质分子量分析的首选方法。所述操作流程 consistently 产生高质量的质谱图，且具有高灵敏度、高稳健性，易于实施。
方案
在制备薄层时，佩戴无粉手套非常重要。
样品板的清洗
- 使用不锈钢或金制的MALDI样品靶板。
- 用甲醇（MeOH）清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。切勿用力摩擦或刷洗表面，以免划伤靶板表面。
- 用 H2O 清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。
- 用甲醇（MeOH）清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。
- 如有需要，重复甲醇/水（H2O）/甲醇清洗步骤，每次均须以甲醇结束。
- 确保靶板表面无残留的“鬼影斑点”或残迹。若存在鬼影斑点，应在戴手套的手轻轻摩擦表面的同时，用去离子水冲洗靶板（切勿使用无尘纸擦拭），然后重复甲醇/水（H2O）/甲醇清洗步骤。
- 清洗后应立即使用该靶板。
薄层基质溶液的制备
- 将1份饱和4-HCCA（2份乙腈，1份水，终浓度0.1% TFA）与3份异丙醇混合。
注意： 薄层基质溶液非常稳定，且 可在避光条件下于室温保存一年，也可在4 °C下储存。
制备薄层基质
- 在板的左侧中心位置加入 20–50 µL 薄层基质溶液，并用移液器吸头侧面涂抹，单向扫动展开。
- 随着溶液干燥，有机溶剂迅速蒸发，导致板表面残留微小水滴。此时，用一张 Kimwipe 纸包裹食指，先轻轻蘸去板表面的水滴。
- 当表面水滴完全去除后，使用 Kimwipe 以单向扫动方式擦拭整个板面。
注意：如果溶液未能充分铺展至整个板面，可增加乙腈（ACN）的比例并重新制备薄层。可能影响溶液铺展性的参数包括环境湿度和温度。
注意：对于金质板，薄层通常呈现为带有淡黄色的反光，具体视观察角度和光照角度而定；对于钢质板，通常仅边缘部分可见。
- 将板放入板架前，使用新的 Kimwipe 擦拭板的边缘，以防止基质污染仪器。
基质溶液的制备
- 饱和 4-HCCA 在FWI（3份甲酸，1份水，2份异丙醇）中推荐用于膜蛋白和可溶性蛋白的分析。在特殊情况下，也可用于分析极疏水性的大分子肽（M >4,000 u）。确保用于点样蛋白质的基质溶液中有机相含量不超过约50%。 因为它会完全溶解薄层基底，从而破坏该方法的优势。
薄层基质的测试
- 在样品板上点加 0.5 µL 基质溶液。在薄层与液滴的界面处会出现白色沉淀。当该沉淀层完全覆盖液滴底部时（通常在 10–15 秒内），用真空管线吸去多余液体。如果沉淀形成时间超过 30 秒 ，则表明薄层基质和/或基质溶液可能存在异常。
样品应用
- 起始溶液中的分析物浓度应在 10 至 1000 µM 范围内。
- 将分析物溶液用基质溶液稀释，使最终分析物浓度在 0.2–2 µM 之间。例如，取 1 µL 样品与 9 µL 基质溶液混合。
注意：确保最终溶液中基质接近饱和状态，否则会重新溶解薄层基底。
注意：获得良好信号 所需的分析物浓度高度依赖于溶液的复杂性和组成（例如，污染物）以及分析物的电离能力。
注意：如果单步稀释无法获得理想结果，应尝试进一步稀释。尽管这看似违反直觉，但高浓度的分析物溶液通常难以产生良好的质谱图。
注意：膜蛋白通常需要更大的稀释倍数。
- 取 0.5 µL 样品/基质混合液点样至靶板上。在薄层与液滴的界面处会形成白色沉淀，此沉淀即为基质与分析物的共结晶。当该沉淀完全覆盖液滴底部时（通常在 10–15 秒内），用真空管线吸除多余液体。如果沉淀形成时间超过 30 秒 ，可能提示存在抑制结晶的污染物，或分析物浓度过高。
校准品应用
- 以类似方式制备校准物/基质混合液，最终校准物浓度在 0.1–0.5 µM 之间。
- 在靶板上靠近样品点的位置点加 0.5 µL 校准物/基质混合液。该物理邻近位置用于伪内标校准程序：在样品采集过程中，将靶板从样品点移动至校准物点，对校准物施加数次激光脉冲，将其信号加入质谱图中。该方法相比仅使用外标校准可实现更高的质量精度校准。
洗涤步骤
- 用约 2 µL 冰冷的 0.1% 水性三氟乙酸（TFA）溶液冲洗每个点位，然后用真空管线吸去多余液体。
质谱数据的采集
- 现在可以开始采集质谱。如果使用 FWI 基质溶液，必须尽快采集质谱，以防止分析物发生不可逆的修饰，例如甲酰化。
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参考文献
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
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