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通过结构质谱分析大型蛋白质复合物

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DOI：

10.3791/1954

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2010年6月19日

 ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science

本文内容

摘要

质谱技术已被证明是分析大型蛋白质复合物的有力工具。该方法能够揭示多亚基复合物的组成、化学计量比和整体结构。本文将逐步介绍如何进行结构质谱分析，并表征大分子结构。

摘要

活细胞通过大量蛋白质的协同作用来控制和调节其生物学过程，这些蛋白质会自我组装成一系列动态的多蛋白复合物1。为了深入理解各种细胞过程的作用机制，确定这些蛋白复合物的结构并揭示其结构组织如何决定功能至关重要。然而，由于多蛋白复合物具有异质性、不对称结构以及动态特性，其许多特征难以表征。因此，亟需发展新的方法来研究蛋白质的三级组织结构。

用于分析大分子复合物的新兴结构生物学工具之一是质谱法（mass spectrometry, MS）2-5。该方法可提供有关复合蛋白组成、亚基化学计量比和结构拓扑的信息。质谱法的优势在于其高灵敏度，因而样品需求量低，能够检测内源性表达水平的蛋白复合物。另一优势是分析速度快，可实现对反应过程的实时监测。此外，该技术能够同时测定共存于混合物中不同群体的特征。

本文详细描述了利用结构质谱法分析大型蛋白质复合物的实验方案。该流程首先制备用于纳米流电喷雾电离（nESI）的镀金毛细管，随后进行样品制备，重点强调缓冲条件的选择：一方面需与nESI兼容，另一方面须能保持蛋白质复合物的完整性。接着，我们逐步说明如何优化高分子量检测的实验条件，并获取质谱（MS）及串联质谱（MS/MS）图谱。最后，我们介绍了后续的数据处理与分析方法。本方案并不试图全面表征蛋白质复合物的各个方面，而是介绍结构质谱中的基本操作步骤，使研究者能够对非共价复合物开展质谱和串联质谱实验。总体而言，我们的目标是为尚未接触过结构质谱领域的研究人员提供有关主要实验技术的基础知识。

方案

第1部分：用于纳流电喷雾电离的金镀层毛细管的制备

非共价复合物的分析通常采用纳流电喷雾电离（nESI）6技术，使用拉制成细尖端（约1 μm内径）的玻璃或石英毛细管，并在其表面涂覆导电材料（通常为金）。此类毛细管可从商业供应商（New Objective或Proxeon）直接购买并即用；然而，自行制备可能更具成本效益：

  1. 在培养皿底部粘贴两条双面胶带，相距 2 cm。将一根玻璃棒（8 cm × 5 mm）放置在其中一条胶带的中央。双面胶带用于固定毛细管，玻璃棒则用于支撑已制备的毛细管，防止其尖端断裂（图 1）。
  2. 使用外径 1.0 mm、内径 0.78 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细管（我们使用 Warner Instruments 公司的薄壁硼硅酸盐毛细管，货号 G100TF-4，每包 500 根）。将一根毛细管插入拉针仪中（我们使用 Sutter Instrument Co. 公司的 P-97 型号）。轻轻夹紧毛细管，并调整其位置，使其位于拉针仪加热丝的正中央。再轻轻拧紧夹具，确保毛细管两端牢固固定。
  3. 使用预设程序拉制毛细管。每次拉制一根毛细管可得到两根成型的最终毛细管。设定拉针程序的过程需通过反复试验，直至获得满意的尖端形状。我们使用的程序如下：
    步骤加热拉力速度时间
    1750-1580
    2700-1550
    37502002080
  4. 将拉制好的毛细管从仪器中取出，检查其尖端，丢弃任何变形或断裂的毛细管。使用钝头镊子（我们使用 C.K. Precision 公司的定位镊子）将毛细管放置于培养皿中。毛细管的基部应粘附在双面胶带上，上部则倚靠在玻璃棒上，尖端朝上。
  5. 当培养皿装满后（直径 10 cm 的培养皿可容纳约 80 根毛细管），将培养皿放入金溅射镀膜仪中（我们使用 EMS 公司的 EMS550 型号）。确保根据制造商说明选择合适的气体供应，并启动预设的镀膜程序（我们使用 4 psi 的氩气压力，在 5 × 10-2 mbar 的真空压力下，以 45 mA 的电流镀膜 1 分钟，重复 3–6 个循环，直至毛细管表面呈现均匀的金黄色）。

第2部分：样品制备

  1. 需要低微摩尔浓度的样品（1 - 20 μM）。必要时，使用离心超滤装置浓缩样品（例如，Sartorius 的 Vivaspin 或 Pall Corporation 的 NanoSep）。建议在使用前验证蛋白复合物是否吸附至装置膜上。
  2. 通常，蛋白质复合物的纯化缓冲液或储存溶液与纳电喷雾电离（nESI）不兼容，因为nESI只能使用挥发性溶液。因此，必须进行缓冲液置换。这一关键步骤旨在彻底去除盐类、缓冲液分子以及甘油、DTT或EDTA等其他任何非挥发性添加剂的残留，直接影响质谱图的质量。通常使用浓度为5 mM至1 M、pH为6–8的乙酸铵水溶液进行缓冲液置换。该步骤可通过微型离心凝胶过滤柱完成例如，Bio-Rad 的 Micro Bio-Spin 6 层析柱）。此步骤可重复 1-3 次，稀释程度极小（每次装置稀释倍数小于 1.3 倍）5），直至达到最大交换程度。如果同时需要浓缩和缓冲液置换，可使用离心超滤法一并完成（例如，Sartorius 的 Vivaspin 或 Pall Corporation 的 NanoSep）。

第3部分：为高质量测量校准质谱仪

对多蛋白复合物开展的大多数实验均采用纳米电喷雾四极杆-飞行时间（Q-ToF）质谱仪进行。建议使用调至低频率的四极杆质量过滤器，以实现对高m/z值离子的传输和质量分析7,8。还建议在第一级离子导管中为仪器增加气体进气口7,8或套管9，以实现第一级真空腔室的压力控制。后者有助于优化大质量离子的传输效率和去溶剂化过程7-9。目前，多家厂商（例如Waters、SCIEX、Bruker或Agilent）均可提供商用的ESI-ToF和Q-ToF仪器，这些仪器可相对简便且经济地改造，用于天然质谱（native MS）分析应用7,8。然而，也可直接使用标准的飞行时间（ToF）或QToF构型仪器（如LCT或QToF1，Waters），在无需硬件改装的情况下获取分子量高达1 MDa的复合物的质谱数据5。

以下方案在 Synapt 仪器（Waters）上进行。

  1. 在纯化水中配制 100 mg/ml 的 CsI 溶液。CsI 用于高质量校准，因为其单电荷盐簇 (CsI)nCs+ 覆盖较宽的质量范围，从 393 m/z 到超过 10,000（图 2）。
  2. 使用钝头镊子从培养皿中取出一支涂覆毛细管，并使用 Eppendorf GeLoader 吸头将 2μL CsI 溶液装入毛细管中。
  3. 将毛细管插入毛细管支架中，并调整毛细管位置，使管尖距离支架边缘约 10 mm。
  4. 手动或使用离心适配器将溶液向毛细管尖端移动。
  5. 将毛细管置于光学显微镜下，使用锋利的 AA 型镊子修剪管尖。
  6. 将毛细管支架连接至纳米电喷雾（nanoflow ES）接口。向后旋转 x-y-z 载物台以避免损坏毛细管，然后将载物台推至工作位置。毛细管应置于距锥孔 1 - 10 mm 的位置。
  7. 施加毛细管电压（1,050–1,400 V）和低纳米流压（0.00–0.03 bar），直至产生喷雾，随后尝试将纳米流压降至最低值。
  8. 通过调节 x-y-z 载物台位置、毛细管电压、纳米流压和去溶剂化气流来优化信号强度。
  9. 为检测宽质量范围的 CsI 峰系列，应优化加速电压（我们采用以下参数：毛细管 1.3–1.7 kV，样品锥 80–150 V，提取锥 1–3 V）。
  10. 为优化高质荷比离子的传输，这些离子需要温和的去溶剂化条件，应提高源与分析器之间初始真空级的背压。这可通过部分关闭隔离阀（SpeediValve）来谨慎降低源真空管路至旋片泵的导通性来实现。为确定最佳点，应在监测信号强度变化的同时进行此操作（我们通常使用 3.0–6.5 mBar）。
  11. 在 m/z 1,000 至 15,000 范围内，以每秒 1 次扫描的速度采集约 30 次扫描。
  12. 采集完成后，使用适当的校准表对飞行时间（TOF）进行校准。

第4部分：完整蛋白质复合物的质谱分析

  1. 按照前述方法（第3部分，第2-5节）加载样品，并启动喷雾。
  2. 首先对喷雾条件进行初步优化（第3部分，第6-9节），直至检测到信号。电荷态的具体位置取决于蛋白质；然而，可通过离子质量与平均电荷态之间的关系进行预测，即：(Zav)10： Zav = 0.0778√(m)，其中 m 为复合物的质量（单位为道尔顿）。为防止复合物解离，请勿加热离子源：应关闭加热器，或将温度保持在40 °C以下。
  3. 调节毛细管位置、样品锥孔电压和提取器电压，以最大化离子传输效率，并观察质谱图的变化。可尝试的初始参数为：锥孔电压100 V；提取器锥孔电压1 V；毛细管电压1.5 kV。将这些参数与纳流压力结合进行优化。
  4. 为改善去溶剂化效果并去除残留的水和缓冲液成分，可提高碰撞池中的偏置电压和气体压力。此步骤需谨慎操作，以避免复合物解离。典型的偏置电压范围为10–100 V，捕获池气体流速为1–10 ml/min（图3）。手动调节射频（RF）设置和四极杆轮廓可能有助于提高高质量离子的传输效率。
  5. 调节捕获（Trap）和传输（Transfer）阶段的碰撞能量。通常，高质量离子的传输需要较高的电压（一般在10–30 V范围内）。在此过程中，应特别注意避免发生复合物的碰撞诱导解离。
  6. 当信号稳定后，建议在维持稳定喷雾的前提下，将纳流压力和毛细管电压降低至最低水平。

第5部分：串联质谱：解离蛋白质复合物

  1. 获得稳定且最佳信号后，选择一个前体离子。设置质荷比中心值和隔离宽度（我们通常使用12的低分辨率，高分辨率则在13至15之间）。使用较宽的质荷比范围以检测高质荷比/低电荷的解离产物。建议先将m/z范围设为最大值，再逐步调整至所需数值。我们还建议叠加MS与MS/MS谱图，以验证所选前体离子的隔离效果。
  2. 进行MS/MS分析时，通过提高碰撞能量（CE）和碰撞池内的气压来解离前体离子。逐步增加离子阱（Trap）或传输（Transfer）CE，每次增加10–20 V，并将碰撞气压力提升至0–5 ml/min（常见值）。持续监测谱图变化，直至达到最佳活化条件。较高的活化能可导致完整复合物中一个或多个亚基解离，从而揭示不同亚基间的相互作用亲和力。我们通常在离子阱/传输池中使用氩气作为碰撞气体，尽管已有文献报道使用更重气体（e.g.，Xe或SF6）的优势；但这些气体成本显著更高11（图 3）。
  3. 建议选择多个电荷态进行MS/MS分析。在组分重叠的情况下，获取一组串联质谱有助于解析不同群体的电荷系列。此外，相较于低电荷态，高电荷态更易发生解离12。
  4. 除对完整复合物进行表征外，还建议在温和变性条件下于溶液中生成较小的亚复合物。对这些亚复合物进行MS和MS/MS分析，是确定复合物亚基结构的基础13。为部分破坏亚基-亚基相互作用，可逐步加入有机溶剂（e.g. 甲醇、异丙醇或乙腈），浓度最高达50%；或通过添加氨水或甲酸调节溶液pH值（浓度最高达4%）。
  5. 为确定构成复合物的各个亚基的质量，需在变性条件下获取质谱。该操作可使用Zip-Tip C4（Millipore）进行，洗脱液为含1%甲酸的25:75水/乙腈混合液。

第6部分：数据处理与分析

  1. 数据通过质谱的谱图分析软件进行离线分析。我们通常使用 MassLynx 软件（Waters）。
  2. 对于跨越较宽 m/z 范围的谱图，建议对高 m/z 和低 m/z 区域采用不同的平滑和质心化参数方案，以反映这些区域峰分辨率的差异。
  3. 为识别电荷系列并计算电荷态和质量，可使用 MassLynx 的“手动查找”功能。在质谱图较为复杂、组分重叠的情况下，手动计算质量可能更为简便。
  4. 为辅助完成这些归属分析，可使用其他软件；例如：MaxEnt 用于谱图去卷积14，SOMMS 用于峰拟合与模拟15，SUMMIT 用于确定蛋白质亚复合物的组成与化学计量比，并构建蛋白质相互作用网络13,16,17。

第7部分：代表性结果

薄层色谱法；展开室装置示意图显示薄层板放置方式；化合物分离。
图1. 制备镀金纳米电喷雾毛细管。
A. 在培养皿上粘贴两条双面胶带，间距为2 cm。为支撑制备好的毛细管，在其中一条胶带的中央放置一根玻璃棒（8 cm × 5 mm）。B. 将制备好的毛细管钝端粘附在胶带上，并将其尖端靠在玻璃棒上。C. 当培养皿中放满毛细管后，对其进行镀金处理，直至毛细管外表面均匀沉积一层薄金膜。

质谱结果，m/z 谱图，分析铯簇，检测离子模式。
图 2. 使用碘化铯离子进行高质量校准。
由于 CsI 能形成大尺寸且单一同位素的簇离子，已成为用于高质量范围质谱仪校准的首选化合物。该谱图中一系列等间距峰覆盖了很宽的质量范围，从 m/z 393 到超过 10,000。这些峰归属于通式为 (CsI)nCs+ 的单电荷盐簇。主峰之间的额外信号分别来自该系列的双电荷和三电荷物种：[(CsI)nCs2]2+ 和 [(CsI)nCs3]3+。提高初级真空腔室中的气压对于检测高质量簇离子至关重要。图中 A. 和 B. 分别展示了气压读数为 1.2 和 5.3 时对高质量峰的影响。 C. 为图 B. 所示质谱的局部放大图。

质谱色谱、电荷态、电泳结果、蛋白质分析示意图。
图3. 五聚体凝集素的纳流电喷雾质谱图。
A. 一种凝集素变体复合物（通过定向进化从Lib1-B7获得18）的质谱显示其电荷态分布在3,000至5,000 m/z之间；然而，由于离子去溶剂化不充分，峰形较宽。比较图A和图B可看出，将偏置电压从4 V（A）提高到15 V（B）对峰宽的影响。这种加速条件的增强导致残余水分子和缓冲液组分被剥离，从而获得分辨率更高的质谱图。测得的质量为（60,240 ± 38 Da），对应一个五聚体复合物。C. 随后选择+15电荷态进行串联质谱分析（在图B中以灰色阴影标示）。D. 提高碰撞能量导致释放出一个高电荷的单体，中心位于1,664 m/z，以及一个去溶剂化的四聚体复合物，分布在5,000–8,000 m/z范围内。所有质谱数据均来自含有20 μM样品溶液（溶剂为0.5 M醋酸铵）的样品。

讨论

为了获得高质量的谱图，应注意样品制备步骤，包括样品浓度调节和缓冲液置换。样品过度稀释会导致信号过低，而浓度过高的样品可能过于黏稠，堵塞电喷雾针头。此外，溶液添加剂如盐、甘油、去污剂、金属离子以及还原剂（DTT 或 β-巯基乙醇）倾向于吸附在蛋白质的外表面，导致峰展宽。因此，为了获得分辨良好的峰形，这些组分应尽可能以最低浓度添加。

另一个关键参数是纳米流毛细管相对于质谱仪进样口的位置。对于经验不足的用户而言，找到"最佳位置"可能具有挑战性；然而，该位置会显著影响谱图质量。在启动喷雾前，检查纳米流毛细管也十分重要。液滴大小取决于毛细管尖端直径，其尺寸应约为 1 μm。较小的液滴可实现更高效的离子化，因此更具优势。还需确认毛细管内无气泡，以免阻碍液体流动，并确保在数据采集过程中毛细管的金涂层未发生剥落；若出现剥落，应进一步修剪尖端。需注意，提供过量样品将增加优化质谱条件（如毛细管电压、加速电压、压力和碰撞能量）的可能性。

总体而言，本方案中所述的方法已被用于确定多种蛋白质复合物的组成、化学计量比和结构（参见综述文献2,3,4）。分析核糖体19等大型兆道尔顿（MDa）复合物和高度有序的病毒衣壳20-22，定义底物与分子机器的结合23-25，或表征亚基相互作用网络26,17,16,17,27,28，仅是该方法应用价值的若干实例。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢Sharon课题组成员对本文的审阅以及对稿件做出的贡献。我们感谢Morasha项目和Bikura项目、以色列科学基金会（资助号：1823/07 和 378/08）、约瑟夫·科恩明弗拉生物膜研究中心、Chais家族新科学家研究员项目、亚伯拉罕和索尼娅·罗克林基金会、沃尔夫森家族慈善信托基金、海伦和米尔顿·A·基姆尔曼生物分子结构与组装中心、什洛莫和萨宾·贝兹温斯基遗产基金、Meil de Botton Aynsley以及英国Karen Siem提供的支持。我们感谢Dan Tawfik和Itamar Yadid为我们提供了凝集素变体样品。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-2 μL 体积每根毛细管
1-20 μM 浓度每个复合物
pH = 6–8 的挥发性缓冲液（如乙酸铵）通常为 5 mM–1 M
去垢剂（尽量少）去垢剂分子簇会产生宽而未分辨的峰
甘油（尽量少，最多 5%）非特异性结合蛋白质，从而导致出现宽峰
有机溶剂（最多 50%）可能导致蛋白质复合物变性
酸类（最多 4%）使蛋白质复合物变性
盐类（尽量少）盐加合物会导致宽而未分辨的峰
DTT（尽量少）可含有 1-2 μM
螯合剂（尽量少）超过 250 μM 会导致大量加合物形成

参考文献

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