in situ 黏附性与非黏附性哺乳动物细胞的亚细胞分级分离

摘要

原位 对载玻片上的哺乳动物细胞进行亚细胞分级分离，可实现蛋白质定位的可视化。

摘要

蛋白质功能与其定位密切相关。尽管某些蛋白质局限于特定位置或亚细胞区室，但许多蛋白质以自由扩散的群体形式存在，并与紧密结合于特定亚细胞区域或结构的亚群处于动态交换状态。原位亚细胞分级分离技术可实现对蛋白质区室化分布的可视化观察，同时揭示定位于特定结构的蛋白质亚群。例如，去除可溶性胞质蛋白和松散结合的核蛋白后，可揭示部分转录因子与染色质之间的稳定结合；随后进行DNA消化，在某些情况下可进一步揭示蛋白质与RNA网络之间的关联，该网络 collectively 被称为核骨架或核基质。

在此，我们描述了实验过程中所需的各个步骤 原位 在显微镜盖玻片上对贴壁和非贴壁哺乳动物细胞进行分馏。可通过特异性抗体或荧光融合蛋白结合荧光显微镜技术实现蛋白质的可视化。利用作为特定区室或结构标记物的抗体和/或荧光染料，可对蛋白质的定位进行精细绘图。 原位 组分分离还可与蛋白质印迹法结合，用于比较各组分中蛋白质的含量。这种简单的生化方法能够揭示出其他方法难以检测到的关联。

方案

一、组分分离的准备工作

本部分介绍聚-L-赖氨酸包被的显微镜盖玻片的制备以及在进行细胞分馏前的细胞贴附。如有需要，可在细胞贴附前或贴附后，使用蛋白表达载体对细胞进行瞬时转染。

A. 多聚-L-赖氨酸包被盖玻片的制备

1. 用蒸馏水配制浓度为1 mg/ml的聚-L-赖氨酸溶液。
2. 将洁净的盖玻片放入该溶液中，在22°C的摇床上孵育至少1小时，以进行聚-L-赖氨酸包被。
3. 用无菌蒸馏水洗涤包被后的盖玻片两次，再用96%乙醇洗涤一次。
4. 将包被后的盖玻片置于滤纸上自然晾干，并存放于干燥容器中以备后续使用（干燥后可叠放）。

B. 将细胞附着到盖玻片上

非贴壁细胞（此处使用 K562 细胞）

1. 将一片经多聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine）包被的盖玻片放入6孔板的一个孔中，确保包被面朝上。
2. 在含10%胎牛血清（FBS）及青霉素/链霉素（PS，青霉素100单位/mL，链霉素100 mg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，以7×10⁵ 个细胞/孔的密度接种K562细胞。对于K562细胞，可在接种前通过电穿孔法进行瞬时转染（使用0.4 cm电穿孔比色皿，2....

讨论

常见问题及建议：

洗涤过程中会丢失全部或大部分细胞。洗涤步骤中，必须将液体缓慢加入6孔板侧壁，避免直接接触盖玻片。同样，移除液体时应小心倾斜培养板，缓慢用移液器吸除多余液体。可通过使用聚-L-赖氨酸包被的盖玻片来增强细胞贴壁。

基因组DNA未被完全消化。对于某些细胞类型，可能需要延长DNA酶I的消化时间 和/或 提高DNA酶I的浓度，以实现基因组DNA的完全去除。

固定和分级分离过程中的假象。需要注意的是，某些蛋白质在固定或分级分离过程中可能发生重新定位⁶。例如，当核膜被破坏后从细胞核中释放出的蛋白质，可能会结合到原本位于不同区室的位点上。通过比较不同固定方法所获得的结果，可在一定程度上减少此类影响，例如使用多聚甲醛替代甲醛。对于整个活细胞而言，活细胞成像也有助于避免此类问题³。

该技术适用于检测GFP融合蛋白。然而，重要的是要验证融合蛋白的行为与未标记蛋白相似。此外，必.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	化学试剂	Sigma-Aldrich	A9647-100G
DNase I	化学试剂	Sigma-Aldrich	DN25-1G
poly-L-Lysine	化学试剂	Sigma-Aldrich	P-8920
胰蛋白酶	化学试剂
EGTA	化学试剂	Sigma-Aldrich	E4378-25G
甲醛	化学试剂	VWR	284216N
PIPES	化学试剂	Sigma-Aldrich	P-6757
蔗糖	化学试剂	Fisher Scientific	S/8600/53
吐温 X-100	化学试剂	Sigma-Aldrich	T-6876
含 DAPI 的封片剂	化学试剂	Vector Laboratories	H-1200
Fugene 6 转染试剂	化学试剂	Roche Group	11814443001
组蛋白 H1	抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-8030
核纤层蛋白 A/C	抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-20681
微管蛋白-α	抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-32293