在此，我们使用人类esiRNA文库进行高通量筛选，以鉴定参与细胞分裂的基因。我们将演示如何设置和开展esiRNA筛选实验，以及如何分析和验证筛选结果。
本文内容
摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）是一种调控基因表达的基本细胞机制。RNAi由短的双链RNA分子诱导产生，这类分子也被称为小干扰RNA（siRNA）。这些短的双链RNA片段来源于较长的双链前体，由属于RNase III内切核酸酶家族的Dicer蛋白加工而成。所产生的片段是RNA诱导沉默复合物（RISC）的组成部分，可引导该复合物识别并结合相应的靶标mRNA。RISC随后切割靶标mRNA，从而降低其所编码蛋白的表达水平1,2,3。目前，RNA干扰已成为在哺乳动物细胞中利用小干扰RNA进行基因功能缺失研究的一种强大且广泛应用的实验方法。
目前有两种主要方法可用于制备小干扰RNA。一种方法是化学合成，另一种方法则是利用RNase III对靶标特异性的长双链RNA进行内切核酸酶切割。 体外从而产生大量类似siRNA的寡核苷酸，这类产物也被称为内切核糖核酸酶制备的siRNA（endoribonuclease-prepared siRNA，esiRNA）。对化学合成siRNA与esiRNA的效率进行比较表明，两者在沉默靶基因方面均具有较强效力。然而，在特异性方面则存在差异：许多单一的化学合成siRNA会产生显著的脱靶效应，而esiRNA由于本身是复杂的混合物，因而导致更特异性的基因敲低。10.
本研究中，我们介绍了基因组规模的 MISSION esiRNA 文库的设计及其在 RNAi 筛选中的应用，以通过 DNA 含量筛选鉴定参与细胞周期进程的基因为例。我们展示了如何优化转染方案以及高通量筛选的检测方法。同时，我们还演示了如何对大规模数据集进行统计学评估，并介绍了验证初筛阳性基因的方法。最后，我们提供了对已验证阳性基因进一步开展功能表征的潜在研究方向。
方案
1. 高质量 MISSION esiRNA 文库
- 针对每个目标基因，利用 DEQOR 算法（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）选择对 RNA 干扰最敏感且最具特异性的靶向区域4。DEQOR 基于最新的设计原则，对靶标 mRNA 上所有可能的 21 个核苷酸长度的 siRNA 的沉默潜力进行评分4。此外，通过在所研究生物体的转录组中进行 BLAST 搜索，分析每个潜在 siRNA 与其他基因发生交叉反应的可能性。该程序从而提供对潜在 esiRNA（长度为 300–600 bp）整体质量及交叉沉默能力的分析。
- 使用特异性引物通过 PCR 扩增目标基因 cDNA 的选定区域，引物两端包含噬菌体 RNA 聚合酶启动子序列。
- 用于 MISSION esiRNA 生产的每种 PCR 产物均通过测序验证其身份，并通过 Caliper Labchip 分析验证其纯度。
- 以 PCR 产物为模板，由 RNA 聚合酶转录生成长链双链 RNA，随后将转录出的单链退火形成双链。
- 使用 RNase III 对长链双链 RNA 进行有限的酶切消化以制备 esiRNA，随后利用 Q-sepharose 离心柱通过阴离子交换色谱法进行纯化。
- 将 esiRNA 沉淀后重悬于 TE 缓冲液中。通过紫外吸收测定产量，并通过加入适量 TE 缓冲液调整浓度。最终产物的整体质量通过 Caliper Labchip 分析进行检测。
2. 选择细胞系并优化转染条件以用于筛选
- 在384孔板中滴定esiRNA的用量（使用Eg5作为阳性对照，海肾荧光素酶作为阴性对照）以及转染试剂的递增用量，加入细胞并培养48小时。Eg5是一种驱动蛋白马达蛋白，对双极纺锤体的组装至关重要，其缺失会导致有丝分裂阻滞。对不同的转染试剂和细胞系重复此操作。此处，我们使用按照标准流程培养的HeLa细胞，并以Oligofectamine（Invitrogen）作为转染试剂。
- 为选择最佳转染条件，通过光学显微镜计数转染Eg5 esiRNA后显示有丝分裂阻滞（呈圆形）的细胞数量，以及转染海肾荧光素酶（RLUC）esiRNA的细胞总数。选择对RLUC毒性最低且对Eg5表型最显著的条件。
优化转染条件的另一种方法是使用一种稳定表达EGFP（或其它合适报告基因）的细胞系，该报告基因由组成型活性启动子驱动。转染针对EGFP（或其它报告基因）的esiRNA以及RLUC（或其它合适阴性对照esiRNA）后，可通过例如荧光激活细胞分选（FACS）来评估基因敲低效率和细胞毒性。确保所用的EGFP esiRNA与靶mRNA完全互补。
3. 设置初筛实验5,6
- 在自动化移液工作站（例如 Aquarius、Tecan 和 WellMate、Matrix）上优化所有组分的移液准确性。由于移液参数会随溶液类型、体积和板类型的不同而变化，因此每一步骤均需单独进行优化。如条件允许，应将移液工作站置于层流罩内，以避免污染。所有使用的组件在使用前应进行消毒处理，可采用高压灭菌（如适用）或喷洒75%乙醇的方式。优化洗涤程序，确保排除孔与孔之间的交叉污染。由于篇幅限制，无法提供自动化移液优化的详细信息，且该过程在很大程度上取决于所使用的移液工作站。更多详情请参考制造商的操作说明。
- 采用上述优化条件，在384孔板中使用针对 Eg5 和 RLUC 的 esiRNA 转染细胞。Eg5 和 RLUC 的 esiRNA 应在整个孔板中采用交替排列模式。
- 孵育48小时后，用冷的100%乙醇固定细胞，在PBS中重悬15分钟，随后在含有1 μg/ml DAPI 和100 μg/ml RNase A（Qiagen）的PBS中染色25分钟。最后用PBS洗涤，并在4°C下保存。
- 通过显微镜（例如 Olympus ScanR 系统）检测DAPI荧光强度。以DAPI荧光强度为横坐标、细胞数量为纵坐标绘制直方图，并根据具有特定DNA含量的细胞比例分析细胞周期分布：DNA含量为2N的细胞代表G1期；< 2N > 4N 的细胞代表S期；DNA含量为4N的细胞代表G2/M期；> 4N 的细胞代表非整倍体/多倍体。
- 评估结果在整块板上的均一性。若结果存在显著差异，则需进一步优化以排除位置效应。使用多孔板时常见的问题是孵育期间边缘孔的蒸发增强，导致不同孔内实验条件不一致，常表现为与板上位置相关的效应。因此，我们建议在筛选实验中将所有边缘孔留空。为进一步减少蒸发，应确保培养箱内保持高湿度。我们常规使用防蒸发屏障，例如 Corning Breathable Sealing Tape，以阻止蒸发。此外还需考虑其他可能导致位置效应的因素，例如检测系统（显微镜、酶标仪等）的技术变异，或液体处理过程中的差异（梯度、溶液不均一等）。
- 阳性对照与阴性对照之间的统计学差异可用于评估所用检测方法的显著性。在正式开展筛选前，必须确保样本与阴性对照（或背景噪声；模拟对照）之间存在显著差异。衡量统计学显著性的良好指标是Z因子。Z因子按以下公式计算：
Z = 1 - (3 SD[sample] + 3 SD[mock]) × (|Av[sample] - Av[mock]|)-1；其中SD表示标准差，Av表示平均值。Z因子在1 > Z > 0.5 范围内，表明阴性对照（及噪声）与阳性对照之间具有统计学上显著的分离度7。
4. 初筛
- 根据上述优化条件，准备用于转染esiRNA的384孔组织培养板。此处，每孔加入溶于5μl TE缓冲液中的15ng esiRNA。每块板至少设置八个对照孔，加入针对所研究生物学过程的适当阳性和阴性对照（此处为Eg5和RLUC）。为避免位置效应，边缘孔仅加入5μl TE缓冲液。
- 每孔加入含0.2μl Oligofectamine的5μl OptiMEM（Invitrogen），混匀后室温孵育20分钟。
- 将细胞悬液加入转染混合物中（此处为40μl浓度为25个细胞/μl的HeLa细胞悬液，相当于每孔1000个细胞），孵育72小时。
- 在自动化显微镜（Olympus ScanR，见上文）上测定DNA含量。使用Z分数统计法进行靶点筛选：以阴性对照信号为参考，计算所有样本esiRNA的Z分数。注意，Z分数与Z因子不同。Z分数提供了一种统计度量，用于评估样本值相对于（模拟）对照的显著性，其计算公式如下：
Z = (value[Sample] - average[mock]) * standard-deviation[mock]-1。
进行靶点筛选时需设定阈值。通常采用如2 < Z < -2的显著性标准，但具体阈值可根据数据集质量、所研究的生物学过程或筛选范围的不同而调整。除较为简单的Z分数统计外，也可采用更复杂的数学评估方法（关于筛选数据统计分析领域的初步介绍可参见Malo等人的研究8）。
5. 二次筛选与命中验证
- 继初筛之后进行二次筛选，以排除因实验误差或脱靶效应导致的假阳性结果。对于初筛中选出的阳性基因，应采用与初筛相同的实验流程，增加重复次数（3–5次），以便进行更可靠的统计学评估。
- 对于已确认的阳性基因，应使用针对初筛所鉴定靶点的另一种非重叠esiRNA（或其它非重叠的沉默触发元件）进行二次验证。检测方法和读出方式应与初筛保持一致。
- 最终，可通过跨物种RNAi拯救实验对所选基因进行验证9。该方法将包含目标基因小鼠同源物的细菌人工染色体（BAC）稳定转染至细胞中。BAC构建体可在基因组环境中完整保留基因结构，实现接近生理水平的表达。针对内源性人源基因的RNAi不会影响小鼠转基因的表达，从而可逆转RNAi引起的表型。RNAi拯救实验是目前验证RNAi表型的金标准。
- 最后，对已验证的候选基因进行深入研究，以期获得对其作用机制的理解。在许多情况下，这些实验仍可使用RNAi技术，例如在更复杂的二级功能检测中。
讨论
RNA干扰已成为研究基因功能缺失表型的标准技术。来自不同供应商的大规模RNAi介导分子文库，为基因沉默提供了一种简便、经济且快速的方法。这使得系统性筛选多种生物过程中的关键因子成为可能，从而能够从基因组水平上广泛研究不同物种和细胞类型中的生物学功能。
在RNAi筛选中，高假阳性率和假阴性率是常见的挑战。为解决这一问题，研究人员已投入大量努力以提高沉默触发物的效率，特别是其特异性。一个重要发现是，针对同一转录本的不同siRNA混合物能显著增强靶标特异性。由于内切核糖核酸酶产生的esiRNA包含大量不同siRNA的复杂混合物，因此esiRNA具有很高的靶标特异性，可降低RNAi筛选中的假阳性率。此外，esiRNA还被证明能够实现高效的基因敲低，从而同时降低假阴性率。
由于RNAi筛选在技术上要求较高，因此在一段时间内可能仍难以常规开展。然而，随着试剂和仪器的不断改进，以及越来越多的实验室分享其专业技术，RNAi筛选在现代生物学中的应用预计将在未来逐步增加。
披露
作者声明与可能对所提交工作感兴趣的商业实体存在财务关系。
致谢
我们感谢Buchholz实验室成员以及Sigma-Aldrich RNAi团队的讨论与交流。同时感谢马克斯·普朗克学会和德国联邦教育与研究部对Go-Bio项目[0315105]的资助支持。
MISSION® 是 Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 的注册商标。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | 如需更多信息，请联系：rnai@sial.com | |
| Wellmate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 透气封膜 | Corning | 透气封膜，无菌（产品编号 #3345） | |
| OptiMEM | Invitrogen | ||
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof（绝对纯度），分子生物学级 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent，10倍浓缩液，适用于细胞培养，分子生物学级 |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D8417 | 粉末，BioReagent，适用于细胞培养，>98%（HPLC 和 TLC） |
| 牛胰核糖核酸酶 A | Sigma-Aldrich | R6513 | 分子生物学级，≥70 Kunitz 单位/mg 蛋白质，冻干粉末 |
| Tris-EDTA 缓冲液 | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 倍浓缩液，分子生物学级 |
参考文献
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- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
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- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
重印与许可
