根据细胞贴壁速度从肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
成体干细胞长期以来一直被讨论其在再生医学中的应用。由于成体干细胞具有多向细胞分化能力和自我更新能力，在治疗受损和病变组织方面引起了极大关注。最重要的是，这些特性使其在自体细胞移植治疗中具有显著优势。本实验方案将向读者介绍一种改良的预贴壁技术，该技术利用骨骼肌系统的软组织，例如肌腱和肌肉，进行成体干细胞的分离与培养。st经酶解离后，置于包被有胶原的培养瓶中培养。含有培养基和未贴壁细胞的上清液每日连续转移至新的培养瓶中。干细胞是贴壁最慢的细胞，通常需要5-7天（连续转移或预铺板）。利用该技术，可借助相对无创的操作简便地获取存在于这些组织中的成体干细胞。
方案
通常，完成改进的预铺板操作需要1-2天的准备工作，1周的技术操作时间，2-3天通过免疫细胞化学进行细胞鉴定，以及额外2-3周用于干细胞群体的扩增。干细胞培养所需的设备与其他细胞培养系统相似，包括台式离心机、CO2 培养箱、层流洁净工作台以及配备荧光装置和数码相机的倒置显微镜。分离得到的干细胞还可进行克隆化，并可长期冻存在液氮中，用于当前或未来的研究1,2。本操作中使用的所有试剂和材料必须无菌，并以无菌技术操作。
步骤 1：准备
- 胶原蛋白包被组织培养皿和培养瓶：使用来自小牛皮的I型胶原蛋白（0.1 g/L；Sigma-Aldrich）。需包被的塑料器皿包括：T-25培养瓶、6孔或12孔板、培养皿（60 mm和100 mm，BD Falcon），具体如前所述1,2。轻轻摇动器皿，每半小时一次，持续4小时，以确保胶原蛋白均匀包被。随后吸除胶原蛋白溶液，并将包被后的器皿置于组织培养超净台中，在开启紫外灯和风机的条件下晾干，以保证无菌，最后盖好盖子或覆盖保存，以备后续使用。
- 配制细胞培养基：将400 mL DMEM（高糖DMEM；Invitrogen）、50 mL 热灭活胎牛血清（FBS，Invitrogen）、50 mL 马血清（HS，Invitrogen）和5 mL 鸡胚提取物（CEE；Accurate Chemical Co.）使用一次性无菌0.22 μm 500 mL滤器系统（Corning....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
已认识到某些成体组织中含有多种干细胞。近年来的研究发现，软性骨骼肌系统组织（包括骨骼肌和肌腱）中存在干细胞。本实验方案详细描述了一种称为改良预贴壁法的技术，该方法已在本实验室成功用于从肌腱和骨骼肌中分离成体干细胞。利用上述改良预贴壁法，可根据细胞在胶原包被培养瓶上的贴壁特性，将其分为多个细胞群（图1）。组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞可在24–48小时内迅速贴附于胶原包被的培养瓶，最初通过PP1–PP2阶段与其他细胞分离。成肌细胞或内皮细胞则在较长时间后（48–96小时内）贴附于胶原包被培养瓶（PP3–PP5），可通过细胞表面标志物进行收获与鉴定。更晚贴壁的细胞（96小时或之后，PP6）被视为成体干细胞（图2）。晚期预贴壁细胞在分离初期表现为体积小、圆形、半透明形态，可通过流式细胞术或免疫细胞化学进一步鉴定其干细胞抗原1（Sca1）、CD34、胎肝激酶1（Flk1）及其他干细胞标志物的表达情况（图3）。分离获得的干细胞具有自我更新能力，实验研究已证实其多向分化潜能，可分化为三个胚层：中胚层、外胚层和内胚层。 9多项研究还表明，这些干细胞可分化为中胚层谱系的细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和造血细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者非常感谢潘海英女士和 Ian Bellayr 先生在当前视频中细胞分离方面的技术支持，以及 Kyle Holden 先生和 Jonathan Lucas 先生在幻灯片编辑方面的帮助。衷心感谢多年来参与改良预铺板技术发展的以下各位：Burhan Gharaibeh 博士、BaoHong Cao 博士、Deasy Bridget 博士、Thomas R. Payne 博士、Aiping Lu 博士、Hairong Peng 博士、Hideki Oshima 博士、Bo Zeng 博士、Xiaodong Mu 博士、Kimimasa Tobita 博士、Ron Jankowski 博士、Makato Ikezawa 博士。我们感谢 James H. Cummins、Ryan Pruchnic、Joseph Feduska、Rebecca C. Schugar、潘海英和 Jessica Tebbets 提供的技术协助。作者还感谢美国肌肉萎缩症协会（MDA）、美国国立卫生研究院（NIH）、美国国防部（DOD）、UPMC 匹兹堡儿童医院、骨科系以及匹兹堡大学为本研究提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| 热灭活马血清 | Invitrogen | #26050-088 | |
| 鸡胚提取物 | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100 U/mL 青霉素/链霉素 | Invitrogen | #15140-122 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS） | Invitrogen | #14190-250 | |
| 亨克氏平衡盐溶液（Hank's Buffered Salt Solution） | Invitrogen | #24020-117 | |
| XI型胶原酶 0.2%（wt/vol） | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| 中性蛋白酶 2.4 U/mL | Invitrogen | #17105-041 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.5%（wt/vol）（10倍浓缩液；每升含5克胰蛋白酶（1:250）） | Invitrogen | #15400-054 | |
| 用于包被培养瓶的胶原：源自小牛皮肤的 I 型胶原，0.1 克/升 | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
参考文献
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identificatio....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
