利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

摘要

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。

摘要

通过将绿色荧光蛋白与其感兴趣的蛋白质融合，生物学家现在能够利用荧光视频显微镜研究活细胞中复杂的细胞过程。为了追踪人类免疫缺陷病毒（HIV）在细胞间传播过程中核心蛋白的运动，我们在一种具有感染性的HIV分子克隆（称为HIV Gag-iGFP）中对Gag蛋白进行了GFP标记。我们使用共聚焦视频显微镜研究这一病毒克隆。在以下可视化实验中，我们将HIV Gag-iGFP转染至一种人类T细胞系，并使用荧光标记的未感染CD4+ T细胞作为病毒的靶细胞。通过不同的荧光标记，我们能够清晰地追踪病毒在称为病毒学突触的细胞间结构中的产生与转运过程。简单的气体可渗透成像腔室使我们能够利用活细胞共聚焦显微镜对突触进行数分钟至数天的连续观察。这些方法可用于追踪病毒蛋白从一个细胞转移到另一个细胞时的动态过程。

方案

该方法已用于Hübner等人在《科学》杂志323卷1743-1747页（2009年）发表的研究中，详见Hübner et al. Science 323: 1743-1747 (2009)。

1. 概述

HIV 的细胞间传播最初是利用感染 HIV 的 Jurkat 细胞作为供体细胞，以及初级 CD4+ T 淋巴细胞作为受体细胞来描述的^1,2,3。在这些研究中，通过抗体染色在固定细胞中检测病毒。为了在活细胞中追踪病毒的细胞间转移，我们采用了一种名为 HIV Gag-iGFP 的重组型感染性分子克隆⁴。该克隆在 Gag 蛋白的 MA 和 CA 结构域之间内部插入了绿色荧光蛋白（GFP）。这种 HIV 分子克隆无需辅助病毒即可保持感染性。由该克隆产生的病毒颗粒在化学计量上负载有绿色荧光蛋白，从而提供强烈的荧光信号，用于监测病毒的组装及细胞间的转移。当与惰性的细胞追踪荧光染料联合使用时，可区分受体细胞与输入的供体细胞，从而实现从感染的 T 细胞向未感染的 T 细胞转移 HIV 的可视化⁵。随后可在活细胞培养于密封的、透气成像腔室中时，实时观察病毒突触的形成以及病毒从一个细胞向另一个细胞的转移过程。

（第1天）

2. HIV Gag-iGFP 转染的 Jurkat T 细胞的制备

1. 通过将人 CD4+ T 细胞系 Jurkat（ATCC，Manassas，VA）维持在 Jurkat 培养基（RPMI 1640、10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）中，细胞浓度控制在 2 × 10⁵ 至 8 × 10⁵ 个细胞/mL，以妥善培养细胞。成功关键：若 Jurkat 细胞培养浓度超过 8 × 10⁵ 个细胞/mL，将导致转染效率下降。
   
   注意：如下所述，将 HIV Gag-iGFP 前病毒 DNA 转染至 T 细胞后，将产生具有复制能力的人类免疫缺陷病毒。因此，所有操作必须仅由经过培训的实验室人员在经认证的生物安全二级增强级或生物安全三级（BL2+/BL3）细胞培养室中进行。在成像设施中操作具有感染性的 HIV 必须获得当地机构生物安全办公室的批准。
2. 使用 Amaxa 核转染法（Lonza，Walkersville，MD）将病毒质粒 HIV Gag-iGFP 转染至 Jurkat 细胞中。取 5 × 10⁶ 个细胞，在 150 × g 条件下离心 10 分钟形成沉淀。吸除上清液，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。再次离心后，将细胞沉淀重悬于 97 μL 预热的、含制造商补充剂的核转染溶液 V 中。向细胞悬液中加入 3 μL 无内毒素的 HIV Gag-iGFP 质粒（1 μg/μL），轻轻混匀。将细胞悬液转移至电转杯中，使用程序 S-18 进行核转染。立即把细胞转移至 3 mL 预热的不含抗生素的 Jurkat 培养基中。
3. 为制备用于病毒突触研究的 CD4+ 靶细胞，我们采用标准 Ficoll-Paque（GE Healthcare，Uppsala，瑞典）方法从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞。随后使用磁珠分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）对 CD4+ T 细胞进行阴性筛选。这些细胞可分装为每管 5 × 10⁶ 个细胞/500 μL 冻存液（90% 胎牛血清/10% DMSO），在液氮中进行深低温保存。解冻后的原代 CD4+ T 细胞在含 10 单位/mL IL-2 的 RPMI 10% FBS 培养基中培养。

（第2天）

3. 从转染了 HIV Gag-iGFP 的 Jurkat 细胞中回收活细胞及用荧光染料标记靶细胞

1. 转染后的Jurkat细胞在培养箱中过夜恢复。然后通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心去除细胞碎片。在15 mL锥形管底部加入1.5 mL Ficoll-Paque。轻柔地将5 mL RPMI培养基中的转染Jurkat细胞叠加于该密度梯度液上方。室温下以400 × g离心20分钟（关闭刹车）。使用移液器小心收集培养基与Ficoll界面处的细胞，转移至新的15 mL锥形管中。用RPMI培养基稀释细胞至总体积15 mL，以300 × g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于3 mL Jurkat培养基中，接种于2 cm孔板（6孔板）中，并将细胞放回组织培养箱继续培养。
2. 为了在细胞间转移实验中区分靶细胞与供体细胞，我们预先用荧光染料标记CD4+靶细胞。原代CD4+ T细胞在使用前一晚进行标记。我们使用CellTracker和CellTrace系列染料（Invitrogen，Carlsbad，CA）对T细胞进行标记，效果良好。尽管染料浓度和孵育时间需根据具体染料和细胞类型优化，以下为一个代表性操作流程：将4 × 10⁶个原代CD4+ T细胞在400 × g下离心10分钟收集细胞沉淀。用5 mL PBS洗涤一次，重悬于2 mL PBS中。加入CellTracker Orange（CMTMR，Invitrogen，Carlsbad，CA），终浓度为1.5 μM，在37°C孵育20分钟。加入8 mL完全Jurkat培养基，400 × g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于3 mL含10单位/mL IL-2的完全培养基中，放入组织培养箱过夜培养。

（第3天）

4. 使用活细胞成像技术监测HIV Gag-iGFP的细胞间转移

我们常规使用转染后48小时的HIV Gag-iGFP转染Jurkat细胞。然而，我们也成功使用过转染后最早24小时以及最晚72小时的细胞。

1. 转染后约48小时，计数表达HIV Gag-iGFP的Jurkat细胞，用不含CO₂的培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）洗涤，并重悬于活细胞成像培养基（不含CO₂的培养基，10% 胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10 U/mL IL-2）中，细胞浓度为1-3 × 10⁷ 个细胞/mL。
2. 以类似方法，将标记的原代CD4+ T细胞用活细胞成像培养基洗涤并重悬，细胞浓度为1-3 × 10⁷ 个细胞/mL。
3. 按1:2或1:3的比例混合HIV Gag-iGFP转染的Jurkat细胞与原代CD4+ T细胞，并将混合液加入经组织培养处理、具有气体通透性的微腔室（Ibidi，Verona，WI）中。例如，将20 μL HIV Gag-iGFP转染的Jurkat细胞与40 μL标记的原代CD4+ T细胞混合。取50 μL该混合液加入Ibidi腔室中，并用封塞密封腔室。用封口膜包裹封塞与Ibidi腔室的接口处以固定封塞。

5. 显微镜平台的注意事项：转盘共聚焦成像

在将细胞接种到Ibidi成像腔后，我们立即将该装置安装到倒置光学显微镜（iX71 Olympus，美国宾夕法尼亚州森特瓦利）上。Ibidi成像腔仅可由经过BL2+培训并穿戴适当防护装备的实验室人员转移至显微镜。尽管活细胞成像通常使用昂贵的培养箱来维持稳定的37°C环境，但我们采用了一种简单且经济的恒温加热器（ASI 400，Nevtek，美国弗吉尼亚州威廉斯维尔），并结合安装在样品附近的T型热电偶探头，以实现准确的温度反馈控制。我们发现，使用不含CO₂的培养基可在避免使用CO₂培养箱的同时，维持细胞的高存活率。为了缓冲环境温度波动对平台的影响，并屏蔽背景环境光，整个显微镜与加热装置被覆盖上一个大型黑色遮光罩，从而在系统周围形成一个隔热的空气层。这种方法显著减少了温度波动以及由此引起的样品漂移，但在安装样品前需预先加热30分钟。

6. 数据采集、传输与图像处理

使用60倍、数值孔径（NA）为1.42的油浸物镜（UPlanApo N，Olympus）进行成像，因为高数值孔径可显著提高分辨率。为了生成三维共聚焦图像，采用转盘式共聚焦单元（CSU-10，Yokagawa，日本）进行扫描，该系统同时使用>800个共聚焦光点，从而显著提高扫描速度。为匹配其高速性能，CSU-10配备了一台高灵敏度的电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，iXon+ 897，Andor Technologies，爱尔兰）相机，实现快速、低光照成像，从而减少光漂白和光毒性。荧光光源为多波长氩氪离子气体激光器（Innova 70C，Coherent，Santa Clara），通过声光可调滤波器（AOTF，Andor Technologies）选择所需波长（488 nm）以及在显微镜物镜前测量的激光功率（<1 mW）。为进一步减少光漂白并延长总成像时间，AOTF可在相机不工作时（10–20 ms）快速（微秒级）关闭激光束，此时新采集的图像正从CCD（曝光时间15–30 ms）传输至计算机。激光光束通过一个405/488/568/647四频带二向色镜（Semrock，Rochester，NY）耦合进入转盘共聚焦系统。荧光发射光通过安装在EMCCD相机与共聚焦转盘单元之间的滤光轮（Ludl Electronic Products，Hawthorne，NY）中的525/50带通滤光片（Semrock）进行过滤。所有硬件及图像采集过程，包括Z轴载物台（Mad City Labs，Madison，WI），均由Andor iQ v1.8软件控制。为在约1.2–1.9秒内最大化三维图像堆栈的采集速度，我们将EMCCD相机的记录区域裁剪至细胞对的局部区域。此外，为换取一定的Z轴信息，可采用较大的Z步进（0.45–0.75 μm）以加快采集速度。在此条件下成像可持续长达6小时，采用连续20–60分钟的片段采集，光漂白程度极低。总体而言，由于采集了数万张图像，每个数据片段通常占用5–20 GB的存储空间。为便于大文件的传输与分析，需使用Andor iQ v1.8软件将每次采集的数据集分割并导出为1 GB大小的TIFF图像文件片段。此后，可利用多种优秀的图像分析软件进行后续处理，例如Metamorph、Volocity和ImageJ（我们推荐其衍生版本Fiji）。

当需要同时追踪两种荧光标记时，我们通过使用“分屏模式”在不降低采集速度的情况下同步记录两种信号。两种标记同时由两条不同的ArKr激光谱线激发（通常为488 nm和568 nm）。在EMCCD相机前直接安装一个图像分光器（OptoSplit II，Cairn，Kent，UK），用于分离两个不同的图像。每个图像随后通过荧光滤光片（Semrock）独立过滤，并同时并排投射到相机上，从而形成“分屏”效果。在后续图像处理中，需要手动对图像进行裁剪和对齐。

7. 图像处理与数据分析的注意事项

我们通常在 Macintosh 计算机（Apple, Inc）上使用 Volocity（PerkinElmer, Waltham, MA）进行图像分析。首先调整转盘激光共聚焦显微镜图像的强度以校正光漂白，然后使用 Volocity 进行去卷积处理。Gag 斑点的强度测量和追踪通过 Volocity 定量模块完成。对于需要计算相对于已形成突触的运动的图像序列，采用一种自动追踪算法，该算法在整个序列中持续追踪突触按钮。必须对自动追踪软件定义的兴趣区域进行人工检查，以确认软件已正确追踪目标对象。对于与周围结构对比度过弱的对象，可逐帧进行手动追踪。Volocity 软件包支持导出目标对象的 XYZ 坐标位置、体积以及积分信号强度。通过将运动归一化至突触按钮中心，计算被追踪对象距突触的距离及其运动速度。

8. 代表性结果

混合后10至15分钟内，应能观察到表达HIV Gag-iGFP的Jurkat细胞黏附于原代CD4+ T细胞。通过成像这些细胞结合体，可评估感染细胞中Gag斑点的运动情况，以及免疫突触形成后靶细胞内的Gag斑点动态。在免疫突触形成后不久，可观察到Gag-iGFP斑点向靶细胞内移动的现象。

讨论

本文介绍一种用于可视化HIV在细胞间转移的简单方法。我们实验室及其他实验室的最新研究表明，这可能是HIV在T细胞间传播的主要方式。本文所述方法采用一种重组形式的HIV，称为HIV Gag-iGFP，其在核心结构蛋白Gag中携带一个基因编码的绿色荧光蛋白标签。由于每个病毒颗粒中均产生高水平的GFP，这种具有复制能力的HIV克隆可使研究人员实时追踪单个病毒颗粒。该病毒在研究HIV的组装及细胞间转移过程中应具有特别重要的应用价值。

细胞间转移HIV的效率非常高。在三小时的共培养过程中，通过流式细胞术评估，我们常规观察到有20–30%的原代T细胞被病毒感染。活细胞成像实验中也定性地观察到类似的转移效率。病毒感染的T细胞在共培养开始后几乎立即与未感染的原代T细胞形成突触结构。有趣的是，尽管使用激光镊子强制接触，仍并非所有原代T细胞都能与HIV感染的Jurkat细胞发生相互作用（未发表观察结果，GM）。HIV Gag-iGFP无疑将有助于确定最易受细胞间病毒转移影响的T细胞亚群， 体外 和 体内.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Jurkat T 细胞	ATCC
全血来源的白细胞富集层	纽约血液中心
RPMI 培养基	Sigma-Aldrich
胎牛血清	Hyclone
青霉素/链霉素	Invitrogen
Nucleofector 系统及溶液 V	Lonza 公司
EndoFree 大量质粒提取试剂盒	Qiagen
HIV Gag-iGFP 质粒	Chen 实验室
CD4+ T 细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec
Ficoll-Paque 分离液	GE 医疗
Celltracker/CellTrace 荧光染料	Invitrogen
CO2-非依赖性培养基	Invitrogen
活细胞成像培养皿	Ibidi
Olympus IX-71 倒置显微镜	Olympus 公司
PlanApo N 1.42NA 60X 油镜物镜	Olympus 公司
Innova 70C ArKr 离子气体激光器	Coherent 公司
CSU-10 Nipkow 型转盘共聚焦成像系统	Yokogawa
Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 多波长二向色镜分光器	Semrock
525/50 带通滤光片	Semrock
iXon+ 897 电子倍增电荷耦合器件相机	Andor
ASI 400 恒温加热装置	Nevtek