基于γH2AX焦点对DNA双链断裂进行定量已成为一种不可或缺的工具，尤其在辐射生物学中，可用于评估组织的放射敏感性以及辐射修饰化合物的作用效果。本文展示了在组织样本中利用免疫荧光法对γH2AX焦点进行定量的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
DNA双链断裂（DSBs）是一类具有高度致死性和基因毒性的损伤，可由内源性（生理或病理）过程或外源性因素（尤其是电离辐射和放射模拟化合物）引起。组蛋白H2A的变体H2AX在其高度保守的C末端SQEY基序中的丝氨酸-139位点发生磷酸化，形成γH2AX，是DNA双链断裂的早期应答反应。1这一磷酸化事件由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）蛋白家族、共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATR）介导。2总体而言，DSB 诱导会导致形成离散的核内 γH2AX 焦点，可通过免疫荧光显微镜轻松检测和定量2鉴于该标志物具有独特的特异性和灵敏性，对γH2AX焦点的分析已在生物医学研究中得到广泛应用，尤其在辐射生物学和核医学领域。在细胞培养体系中，针对电离辐射诱导的DNA双链断裂（DSBs），γH2AX焦点的定量分析已得到最为广泛的研究。除了用于评估细胞放射敏感性外，基于免疫荧光的检测方法还被用于评价辐射修饰化合物的效果。此外，γH2AX已被用作分子标志物来检测多种诱导DNA双链断裂化合物的有效性，并且最近被视为衰老及疾病（尤其是癌症）的重要标志物。3此外，基于免疫荧光的方法已被改进，适用于检测和定量γH2AX焦点ex vivo和in vivo4,5. 本文展示了一种在小鼠组织中检测和定量γH2AX焦点的典型免疫荧光方法。
方案
组织
- 将肺组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂4583中，使用Leica 1950型恒冷切片机切片（5 μm），并贴附于多聚赖氨酸载玻片上。
冷冻样品由墨尔本儿童研究所的Simon Royce博士提供。肺组织取自未经处理的Balb/c小鼠，以及一种慢性过敏性气道疾病小鼠模型，该模型表现出许多与人类哮喘相似的病理特征6。动物实验均依照墨尔本儿童研究所动物伦理委员会制定的指南和规定进行，该委员会遵循澳大利亚实验动物用于科学目的的护理与使用规范。
- 切片在室温下静置干燥1小时。
免疫荧光染色
- 切片在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2%（w/v）多聚甲醛固定20分钟。
- 切片用PBS洗涤两次，每次15分钟，进行平衡。
- 切片用预冷至-20°C的70%乙醇处理20分钟，随后用PBS洗涤三次，每次10分钟。
此时，载玻片可置于密封容器中，在 4°C 下保存长达 2 周。
- 切片用 PBS 每次 10 分钟，洗涤三次，然后在含 0.5% Tween-20 和 0.1% Triton X-100 的 PBS（PBS-TT）中加入 100 μL 新鲜配制的含 8% BSA 的溶液，在室温下封闭 1 小时。
所有孵育步骤均在湿盒中的染色槽内进行。 - 切片用 PBS-TT 洗涤 5 分钟，并用 Pap 笔在组织周围标记疏水边界。
- 吸去多余缓冲液后，每张切片加入 100 μL 一抗溶液（兔多克隆抗-γH2AX 抗体，用含 1% BSA 的 PBS 稀释至 1:500，Millipore），在室温下孵育 2 小时。
一抗孵育也可在 4°C 过夜进行。
为进一步证明 γH2AX 焦点代表 DNA 双链断裂（DSB），可同时使用识别 DSB 修复蛋白的一抗。例如，γH2AX 与磷酸化 ATM（phospho-ATM）的共定位是一种常用的组合。 - 切片用 PBS-TT 洗涤两次，每次 5 分钟，然后在避光条件下加入 100 μL 二抗溶液（Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG，用含 1% BSA 的溶液稀释至 1:500，Invitrogen），室温孵育 1 小时。（稀释后的抗体在整个操作过程中均需避光保存）。
- 切片用 PBS-TT 洗涤三次，每次 5 分钟，然后加入 0.5 mg/mL RNA酶A，在 37°C 孵育 30 分钟。
- 使用含碘化丙啶的 Vectashield 封片介质进行核复染和封片。
- 载玻片用指甲油封固后，在 4°C 避光保存过夜，再进行分析。
显微镜 / 分析
- 使用蔡司 LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准 GFP（用于 γH2AX - Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG）和 PI（543 nm）激光获取图像。
采用Z轴系列模式采集图像，步长为0.5 μm。分析过程中，对各个成像平面进行去卷积处理并叠加，生成最大强度投影图像，以最大限度减少焦点重叠。
在进行颗粒计数之前创建最大投影图像的方法，仅适用于使用薄切片（例如 5μm）且背景染色可忽略的情况。当必须分析具有显著背景的较厚切片时，应采用更复杂的分析方法，例如 Bolte 和 Cordelieres（2006）所述的 3D 对象计数器7。
- 使用 MetaMorph（Molecular Devices，美国）软件生成融合（红色和绿色）图像，以定量分析焦点数量。
尽管可以使用 Metamorph 对焦点数量进行定量分析，但在使用组织切片时，通常通过人工（肉眼）计数以获得更高的准确性。
可根据组织学特征并参考苏木精和伊红染色的连续切片，选择特定的目标细胞类型进行定量，例如肺上皮细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本实验中，我们使用了未经处理的 Balb/c 小鼠的肺组织以及慢性过敏性气道疾病小鼠模型的肺组织。我们对每细胞中焦点数量的差异进行了定量分析，发现受损肺组织中的平均值略高于未经处理的组织。具体而言，定量结果显示，在未经处理的组织和慢性过敏性气道疾病组织中，每细胞的焦点数分别为 6.5 和 9.4（每组织切片手动计数 20 个细胞）。然而，若使用可诱导 DNA 双链断裂（DSB）的试剂（例如萘），已知其可在小鼠肺模型中诱导 DSB，则会产生更高的焦点数量。事实上，本方案最适合用于研究电离辐射对组织的影响；当使用电离辐射时，γH2AX 焦点的数量和分辨率会获得更为显著的结果。众所周知，在接受 X 射线照射后，γH2AX 焦点迅速形成，焦点数量在 30–60 分钟内达到峰值2。因此，照射后 1 小时的时间点最适合评估初始 DSB 的形成，而更长的时间点（通常长达 48 小时）可用于监测 DNA 修复过程。
总体而言，组织中γH2AX的定量检测可用于监测DNA双链断裂（DSB）的形成与修复。除了在电离辐射研究中的应用外，该方法还可用于评估各类组织中诱导DSB化合物的效...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）和生物医学影像合作研究中心补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）在本研究中提供了 invaluable 的支持。MMT 感谢美国国立卫生研究院 Olga Sedelnikova 博士提供的专业协助与建议。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA（1%）用于阻断非特异性抗体结合。一抗和二抗均用BSA溶液稀释。 | |
| PBS（不含Ca）2+ 和 Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | 多聚赖氨酸载玻片 | Menzel-Glaser | SF41296SP | 通过静电作用吸引冷冻组织切片，减少对额外涂层和黏附剂的需求。 |
| Tween 20 | 试剂 | Calbiochem | 655205 | Tween 20（0.5%）是一种用于细胞通透的去垢剂 |
| Triton X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用0.1% Triton X-100对细胞进行通透处理。 |
| 多聚甲醛 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 抗磷酸化-γH2AX（兔多克隆抗体） | 一抗 | Upstate，Millipore | 07-164 | 一抗稀释比例（1:500），溶于1% BSA中。 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L） | 二抗 | Invitrogen | A-11008 | 在含1% BSA的溶液中稀释二抗（1:500）。 |
| 乙醇（70%） | 赛默飞世尔科技公司 | BSPEL316 | ||
| RNAse A | 试剂 | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | 试剂 | Vector Laboratories | H-1300 | 一种含碘化丙啶（红色细胞核染料）的甘油基封片介质。该介质必须与匹配其折射率的油镜配合使用。 注意：常用的DNA染料为4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），仅可用于配备相应激发激光的显微镜。 |
| 迷你PAP笔 | Invitrogen | 008877 | ||
| 盖玻片（22×50 mm） | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin 玻璃染色缸 | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| 染色槽 | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| 蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | |||
| CM Leica 1950 冷冻切片机 | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | 成像分析软件 | Molecular Devices |
参考文献
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
