斑马鱼幼鱼静脉微注射用于急性肾损伤研究

摘要

我们介绍一种将氨基糖苷类抗生素庆大霉素显微注射到受精后2天（dpf）斑马鱼幼鱼中的技术，以诱导急性肾损伤（AKI）。我们还介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行整体免疫组织化学染色、塑料包埋及切片的方法，以观察AKI介导的组织损伤。

摘要

在本视频文章中，我们描述了一种使用庆大霉素作为肾毒性剂的斑马鱼急性肾损伤（AKI）模型。该技术包括对2天龄斑马鱼进行静脉内显微注射，是一种高效且快速将可溶性物质递送至斑马鱼幼鱼血液循环的方法，每小时可注射15–20条鱼。除AKI研究外，该显微注射技术还可用于其他类型的实验研究，如血管造影。我们提供了从所需设备到肾功能下降的可视化检测指标在内的详细技术操作流程。此外，我们还展示了固定、使用肾小管标记物进行整体免疫组织化学染色、幼鱼的塑料包埋及切片过程。我们证实，注射庆大霉素的斑马鱼幼鱼表现出与AKI一致的形态学特征：水肿、近端小管上皮细胞极性丧失以及小管结构的形态破坏。

方案

以下实验方案的部分内容基于已发表的方法（Hentschel et al. 2005）和（Weinstein et al. 1995），并进行了轻微修改。

第一部分：显微注射

显微注射前的预先准备

• 在受精后2天（dpf）对鱼进行注射。因此，在计划实验前3个晚上对成年斑马鱼进行交配。收集胚胎，并将其置于含有E3水（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄）的培养皿中，在28.5°C下培养。在第一天结束时，从培养皿中移除死亡的胚胎，并将存活胚胎分开，使每个培养皿中包含80–100个胚胎。
• 使用毛细管（长度4英寸，外径/内径0.63/0.20毫米（mm）R-6定制玻璃管，Drummond Scientific公司，Broomall，PA，货号9-000-3000）通过电极拉制仪制备玻璃针。针尖直径应为10–20 μm。在解剖显微镜（Leica S6E）下，借助直尺用永久性标记笔沿针管每隔约1 mm标记10条线。将制备好的针管存放在盛有黏土斜坡的大培养皿中。
• 制备固定移液管：将一根薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管（152 mm，外径/内径1/0.75 mm，TW100-6，World Precision Instruments, Inc.）的一端在本生灯火焰中进行火焰抛光，直至其尖端内径达到0.4–0.5 mm。该尺寸可有效夹持2 dpf斑马鱼幼鱼的卵黄囊。使用长镊子夹住玻璃毛细管的一端，将另一端垂直置于本生灯火焰的浅蓝色内焰（最热区域）上方，加热1–2秒，同时缓慢旋转以实现均匀熔融。重复数次后，在显微镜下的台式测微尺（Ward's 94 W 9910）上检查毛细管尖端。此步骤至关重要，可能需要预先制备多个固定移液管，并在操作幼鱼时选择合适尺寸的移液管。若操作得当，一根固定移液管可在多次显微注射实验中重复使用。
• 按照制造商说明，用矿物油填充手动显微注射泵（MMP，World Precision Instruments, Inc.）。将移液管固定器插入操纵杆式微操纵器（Narishige，MN-151），并通过磁力支架（Narishige，MN 151）将其固定在铁板（Narishige，IP）上。

显微注射

• 制备 20μl 注射混合液：2.4μl 庆大霉素（Sigma-Aldrich G8648，50mg/ml 生理盐水溶液）和 17.6μl 10-kDa 荧光黄葡聚糖（Invitrogen D1825，1mg/ml 生理盐水溶液）。在对照组鱼中，以生理盐水替代庆大霉素。荧光葡聚糖（可使用多种不同颜色）足以验证注射的准确性，并筛选出成功注射了肾毒性物质的幼鱼。
• 准备两个 30mm 培养皿，各加入 2ml 矿物油，用于覆盖注射混合液和对照混合液，防止溶液蒸发。
• 制备麻醉剂：将 400 mg 三卡因粉末（乙基-间氨基苯甲酸甲磺酸盐，SIGMA A-5040）、97.7 ml 去离子水和 2.1 ml 1M Tris（pH 9）混合。调节 pH 至 7，将此储备液分装为每份 4.2 ml，保存于冷冻室。使用时，将 4.2 ml 三卡因储备液加入 100 ml E3 水（Westerfield 1993）中稀释，并在室温下放置使用。

以下步骤需在解剖显微镜下进行

• 使用精细镊子手动去除残留的卵膜，并将斑马鱼转移至含有室温预热三卡因的培养皿中进行麻醉。在开始显微注射前，斑马鱼应至少暴露于三卡因中15分钟。
• 使用刀片（VWR scientific 55411-050）切开注射针尖端。将刀片以轻微角度倾斜，形成斜面，切割针尖以获得直径约为10–20μm的开口。
• 打开显微注射装置（World Precision Instruments Inc., PV820 气动皮升注射泵）的电源、真空和气源。将注射针插入安装在显微操作器和倾斜底座（World Precision Instruments, Inc., Model M3301R, TB-1）上的针夹中。
• 为填充注射针，将10μL待注射溶液滴加至盛有矿物油（Fisher Chemicals, 0121-1）的30mm培养皿中。调节手动显微操作器，使针尖浸入溶液液滴中，将皮升泵的“hold/vent”开关置于“vent”位置（“vent”对应PV820上的抽真空模式），通过针尖吸入溶液以填充针管。此过程需数分钟；若溶液进入过快，说明针尖直径过大，将导致注射不准确。针管填充完成后，将皮升泵切换至“hold”位置（“hold”对应PV820上的注射模式）。
• 为校准针尖，将皮升泵的“gated/timed”开关置于“gated”模式，踩下脚踏开关排出针内液体，记录弯月面从一个刻度移动到下一个刻度（总距离1 mm）所需的时间（秒）。重复三次，取平均时间（秒），再将该数值除以30（对应1 mm线性距离的纳升体积，nl），从而计算出输送1 nl溶液所需的毫秒数。将“range period”旋钮调节至该数值，并将“gated/timed”开关拨至“timed”模式。此时皮升泵已设定为每次释放1 nl的溶液脉冲。
• 移除矿物油培养皿，将盛有幼鱼的培养皿置于显微镜下。将鱼群集中于培养皿中央并调焦。
• 将固定移液管置于显微注射装置对侧的手动微注射泵（MMP, World Precision Instruments）上，推进其尖端至培养皿内，并进入显微镜焦平面。将其弯曲成较平缓的角度，使固定移液管的最尖端接触培养皿底部且接近水平。确保系统内无气泡，否则会延长响应时间并降低MMP的精确度。
• 切换至更高倍率的显微镜物镜，使用带柄超细睫毛（Ted Pella 113）将幼鱼背侧朝下摆放，使卵黄囊靠近固定移液管。通过逆时针旋转控制手动微注射泵的千分尺驱动装置，将卵黄囊吸入固定移液管以固定幼鱼。注意不要过度旋转千分尺，以免卵黄囊被吸入过深而破裂。聚焦于正在形成的公共主静脉（common cardinal vein），该血管位于卵黄上方、表皮层下方，血流速度极高。使用显微操作器引导注射针进入发育中的公共主静脉。通常在插入后需略微回撤针尖，因为公共主静脉位置非常表浅。踩下脚踏开关注射1 nl溶液，随后释放幼鱼并将其放回胚胎水中。此步骤尤为关键，尤其是初次操作时，需要一定练习来掌握鱼体定位以及吸力与压力的控制。若卵黄囊被固定移液管正确吸附，则在针插入时不会发生滚动。
• 为验证显微注射是否成功，使用荧光显微镜观察斑马鱼心脏中是否存在荧光黄葡聚糖（lucifer yellow dextran）。荧光黄在心脏中约可维持20分钟可见，之后逐渐扩散至循环系统。若肾毒性溶液注射到位，则在注射后2小时内，注射部位残留的荧光黄葡聚糖将极少；若溶液误注入卵黄囊，则注射部位会留下明显的荧光黄葡聚糖斑点（图1）。将鱼放回E3培养基中。
• 注射后两天，幼鱼因肾功能下降而出现心包水肿（图2）。

第2部分：使用Na⁺/K⁺ ATP酶抗体（α-6F）进行固定和免疫荧光染色

• 在4 dpf时，将10至15条斑马鱼幼鱼放入4 ml玻璃小瓶（Weathon, 225012）中，加入1 ml Dent's固定液（80% MeOH，20% DMSO），在室温下固定4小时。
• 用梯度MeOH/PBT（含0.5% Tween20的PBS）溶液对胚胎进行再水化：75:25、50:50、25:75、100% PBT，每次更换溶液时用移液器将原溶液吸出，并在同一小瓶中加入新溶液（每瓶1 ml），每步孵育20分钟。更换溶液过程中幼鱼不得暴露于空气中，每次操作时应保留少量液体覆盖幼鱼。
• 吸除PBT，加入1 ml封闭液（含1% DMSO、0.5% Tween20和10%正常山羊血清的PBS），在4 °C下于旋转器上孵育3小时。
• 将幼鱼转移至2 ml微量离心管中，吸除封闭血清，加入300 μl一抗孵育液（含1% DMSO、0.5% Tween20和2%正常山羊血清的PBS），在4 °C下于旋转器上孵育过夜。我们使用单克隆Na⁺/K⁺ ATP酶抗体（α-6F，上清液，Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa），按1:25比例稀释。
• 吸除一抗溶液，在室温下用孵育液清洗3次，每次30分钟。
• 在室温下用二抗（山羊抗小鼠Cy3，Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003）按1:500比例稀释于孵育液中，孵育2小时。
• 用PBT清洗3次，每次30分钟。

第3部分：使用JB-4进行塑料包埋

• 通过梯度乙醇系列（50%；75%；95%；100% × 2）对组织进行脱水，每步10分钟。
• 配制浸润溶液：25 ml JB-4 包埋液A（Polysciences 0226A）和0.24 g催化剂（Polysciences 02618）。催化剂溶解需要较长时间，约20–30分钟。该溶液可在4°C下保存最多1个月。
• 弃去100%乙醇，加入塑料浸润溶液。将小瓶置于4°C旋转仪上，持续浸润直至幼鱼沉入玻璃小瓶底部。此过程通常需要约30分钟。
• 包埋步骤：将塑料模具杯托盘（Polysciences, Inc. 16643A）置于解剖显微镜下。将幼鱼连同覆盖的浸润溶液转移至模具杯中。塑料包埋介质在小型塑料管中配制。我们通常一次包埋4–5条鱼，每杯一条鱼。按每杯1.2 ml包埋液计算，配制5–6 ml包埋塑料，并为每毫升浸润液加入35 μl JB-4 包埋液“B”（Polysciences Inc. 0226B）。为每毫升浸润液加入35 μl JB-4 包埋液“B”（Polysciences Inc. 0226B）。用塑料巴斯德吸管反复吹打数次，充分混匀。此步骤至关重要，若混合不充分，JB-4将无法正常聚合。配制好5 ml包埋塑料后，用巴斯德吸管吸除样品周围的浸润塑料。用包埋塑料充满模具杯，确保塑料从杯中溢出，以保证包埋块夹持器与样本良好结合。为检测斑马鱼肾小管，横切面效果最佳。因此，应将鱼垂直包埋，头部朝下。借助带柄睫毛或精细镊子，定期调整鱼体至垂直位置，直至塑料硬化到其不再移动为止。此过程约需20–30分钟。随后，将EBH-2包埋块夹持器（Polysciences Inc. 15899）覆盖在模具杯上，并将托盘于4°C过夜。聚合完成后，可像取出冰块一样将包埋块弹出。
• 多条幼鱼的替代包埋方案：用完全配制的JB-4填充模具至一半高度，并使其聚合。对于所用的15 mm方形模具，使用700 μl JB-4可填充至一半。接着，将经JB-4浸润并加入硬化剂的幼鱼置于已预聚合的半满模具中。将幼鱼头部朝向模具长边摆放，并对齐幼鱼，使其眼球处于同一直线上（可在单个模具中并排放置10条鱼）。待包埋块完全聚合后，可切去块边缘，将其翻转使侧面朝向切片刀，并用瞬干胶将其粘附于适配切片机的塑料“样品夹”上。采用此方法，可将大量幼鱼集中包埋于同一块中，居中固定，便于进行横切。在切片时需注意将包埋块相对于刀片正确定位，以确保单一切片中获取每条鱼的等效切面。可通过眼球部位进行定位：即调整包埋块方向，使每条鱼的眼球切面等效。最终可在一张显微镜载玻片上同时分析多条鱼。

第4部分：切片

• 将样本放入切片机的卡盘夹具中（我们使用 Shandon Finesse Thermo Electro Corporation 切片机）
• 将载玻片加热板温度设置为 45°C。
• 将去离子水倒入烧杯中，并将其放置在切片机附近。
• 切片前，确保包埋块的方向正确，以便获得鱼体的完整横截面。可通过旋转头部调节手柄，精确调整样本头部相对于刀片的位置。开始对鱼头部分进行厚切片。当切片通过眼睛部位时，调整包埋块方向，使每条鱼的眼睛部位切片位置一致。当切片中出现胸鳍时，即为前肾小管的起始位置。从此位置开始，从包埋块上连续切下约 32 片 4 µm 厚的切片。
• 用镊子收集切片，使其自然落入盛水的烧杯中，注意镊子不要接触水面。切片一接触水面便会迅速展开，此时可将其转移至载玻片上。将载玻片以 45° 角插入水中，并借助带柄的眼睫毛工具轻触切片边缘，将其引导至载玻片上。
• 将载玻片置于载玻片加热板上孵育，直至完全干燥。
• 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对切片进行成像。

第5部分：代表性结果

若操作正确，注射后的鱼应如图1所示，心脏和循环系统中仅有少量荧光葡聚糖（本例中为Lucifer Yellow）可见。如果注射过深，可观察到注射物质集中在卵黄囊中，或因刺破心脏导致大量出血。若固定用移液管制作得当，鱼类在注射过程中不会翻滚或移动，从而实现更精确的注射。此外，务必确保显微操作仪（MMP）中无任何气泡，否则会减慢响应速度并降低系统的精确度。通常情况下，由于庆大霉素的肾毒性作用，80%的注射鱼会出现心包水肿（图2）。我们采用基于表型的分类系统，其中中度水肿的鱼表现出明显的心包水肿但无其他可观察到的表型，而重度水肿的鱼则同时出现心包和躯干水肿，并伴有轻度至中度的体轴弯曲。使用针对Na⁺/K⁺ ATP酶（α-6F）的肾小管抗体，我们可在横切面上观察到受损的小管，与对照组相比，受损小管表现出明显的细胞极性丧失和管状结构破坏（图3）。该模式在多个横切面中均一致。为了获得理想的肾小管横切面，在包埋过程中正确摆放鱼类的位置至关重要。在比较切片时，胸鳍和近端曲小管被用作解剖学标志。

图1. 肾毒素显微注射。（A）成功注射与荧光素黄标记的10 kDa葡聚糖，可见在总主静脉中有微弱表达，白色箭头所示。（B）注射错误，导致与荧光素黄标记的10 kDa葡聚糖沉积，未扩散至循环系统，红色箭头所示。

图 2. 庆大霉素诱导的水肿。（A）对照组注射的斑马鱼幼体。注射庆大霉素后出现（B）中度或（C）重度水肿的斑马鱼幼体。所有幼体均为受精后4天，左侧为头部，上方为背侧。黑色箭头指示B和C中的心包水肿。

图3. 急性肾损伤（AKI）免疫组织化学分析。在对照组（A，B）和庆大霉素注射组（C，D）的幼鱼（注射庆大霉素后48小时，4 dpf）中，使用α-6F抗体对Na⁺/K⁺ ATP酶进行染色。A和C为20倍放大图像，B和D分别为A和C右侧肾小管区域的3倍数字放大图像。与B相比，D中可见基底外侧极性丧失及肾小管结构破坏（白色箭头所示）。

讨论

在本视频文章中，我们演示了一种通过静脉显微注射建立急性肾损伤（AKI）模型的技术，该方法通过庆大霉素诱导斑马鱼幼虫近端小管损伤。这种损伤会导致心包和/或全身性水肿的形成，反映出机体调节水平衡能力的丧失。我们还描述了一项免疫组织化学实验，使用一种可标记已分化肾小管的抗体（Majumdar et al. 2000），显示受损肾脏中细胞极性的丧失以及近端小管结构的破坏。静脉显微注射是一种将可溶性物质高效递送至斑马鱼幼虫血液循环的方法。该技术是引入多种物质的理想工具，结合荧光标记物的使用，可实现重复且均匀的注射，从而获得一致的实验结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α6F 小鼠单克隆抗体	发育研究杂交瘤库
EBH-2 型封埋块夹持器	Polysciences公司	15899
硼硅酸盐玻璃毛细管	精密仪器世界公司	TW100-6
R-6 定制玻璃毛细管	Drummond 科学公司	9-000-3000
催化剂粉末	Polysciences公司	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch公司	155-165-003
10k 右旋糖酐-荧光黄（可固定赖氨酸）	Molecular Probes, Life Technologies公司	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich公司	D8418
眼睫毛	Ted Pella公司	113
硫酸庆大霉素	Sigma-Aldrich公司	G8648
4 ml 玻璃小瓶	Weathon公司	225012
铁板	Narishige 国际公司	IP
JB-4 包埋液 A	Polysciences公司	0226A
JB-4 包埋液 B	Polysciences公司	0226B
操纵杆式显微操作器	Narishige 国际公司	MN 151
磁力支架	Narishige 国际公司	MN-151
手动微量注射泵	精密仪器世界公司
显微注射装置	精密仪器世界公司	PV820
显微操作器	精密仪器世界公司	M3301R
切片机	赛默飞世尔科技公司	Shandon Finesse
轻质矿物油	费希尔科技公司	0121-1
移液管拉制仪	Kopf 仪器公司	720
塑料模具杯托盘	Polysciences公司	16643A
剃须刀片	VWR 国际公司	55411-050
载片加热器	Labline 仪器公司
阶段测微尺	WARD’s 自然科学公司	94 W 9910
倾斜底座	精密仪器世界公司	TB 1
三卡因粉末	Sigma-Aldrich公司	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich公司	P7949
显微镜	徕卡显微系统公司	S6F	解剖显微镜
显微镜	徕卡显微系统公司	M205FA	荧光显微镜