多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

摘要

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为 体内靶向细胞消融有助于研究神经环路功能及细胞特异性神经元再生模式。

摘要

活体斑马鱼幼鱼的高分辨率延时成像可用于观察生物过程的动态展开（综述见¹）。携带在相邻细胞类型中表达不同荧光报告基因的复合转基因鱼，为追踪细胞间相互作用²和/或随时间变化的组织水平对实验干预的响应提供了手段。在本视频中，我们演示了可用于在单条鱼中连续时间点（时间跨度可从数分钟至数天）对多个转基因标记的细胞类型进行成像的方法。所述技术适用于任何旨在随时间关联相邻细胞类型“行为”的研究，包括：1）用于在连续数天内对大量鱼类进行成像的连续“捕获-释放”方法；2）分离激发/发射光谱重叠的荧光团（例如GFP和YFP）的简化方法；3）利用低色素突变品系延长高分辨率成像在发育晚期幼体阶段的时间窗口；4）使用膜定位荧光报告基因揭示单个细胞的精细形态细节以及细胞群体中的细胞结构细节；以及5）一种先前描述的化学诱导消融转基因靶向细胞类型的方法，即硝基还原酶（NTR）介导前药底物（如甲硝唑（MTZ））转化为细胞毒性衍生物的方法^3,5。

以这些方法为例，我们将在数天内对单条鱼体内某一亚型视网膜双极神经元的消融及再生过程进行可视化观察。同时，我们将监测其他多种视网膜细胞类型，包括邻近的非靶向双极细胞以及可能因退变刺激而激活的视网膜干细胞（即Müller胶质细胞）。ϋ胶质细胞。该策略正在我们的实验室中用于表征细胞和组织水平（例如干细胞微环境）对特定神经元细胞类型选择性丢失与再生的响应。

方案

1. 转基因与突变品系

1. 建立或获取转基因斑马鱼品系，使其特定细胞类型通过不同荧光报告基因变体进行特异性标记。理想情况下，所选荧光报告基因的激发/发射光谱应尽量不重叠（例如 ECFP 与 EYFP），但此条件并非绝对必要。在本研究中，使用膜锚定型荧光报告基因可显著增强对细胞精细结构（如神经突起）的成像效果，有助于在大量混合的细胞群中分辨单个细胞的数量和/或形态，并“突出”膜含量较高的区域，例如突触神经网。
2. 在晚期幼体阶段进行成像时，将转基因品系导入色素减少的突变背景中会更有利 [例如 roy orbison (roy) 或 roy orbison; albino (roy;alb)；⁴]。根据我们的经验，减少虹彩细胞（如 roy）的影响最为关键；黑色素生成可通过化学方法使用 1-苯基-2-硫脲（PTU）抑制，或通过缺乏黑色素细胞的“白化”突变体实现。然而需注意，Ren et al.⁴ 已证明缺乏黑色素细胞的鱼类视网膜存在视觉功能缺陷及轻微的形态学改变，且强光可诱导“白化”突变体中光感受器细胞的死亡。因此，在设计成像实验和/或解释数据时，必须充分考虑上述问题。
3. 本实验所用的转基因及突变斑马鱼品系如下：
   1. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+;Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+; Tg(pax6-DF4:gap43-CFP)^q01/+; roy^a9/a9
   2. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+;Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+;Tg(gfap:GFP)^mi2001/+;roy^a9/+
   3. 注：在鱼类“1”中，由 nyx 启动子定义的一类视网膜双极细胞亚群表达膜标记的 YFP 和/或 NTR-mCherry 融合报告基因（多数同时表达两者），几乎所有视网膜细胞均表达膜标记的 CFP。鱼类“2”与前者类似，但穆勒胶质细胞表达胞质 GFP，且全局性视网膜 CFP 表达已被消除。NTR-mCherry 融合蛋白的表达使 nyx 定义的双极细胞对前药诱导的消融敏感 ^3,5。

2. 选择和准备用于活体成像的胚胎/幼虫

1. 交配感兴趣的转基因/突变品系，收集受精卵，并在28.5°C条件下使用0.3X Danieau溶液（或选择的“胚胎培养液”）进行孵育和培养。
2. 若非处于“白化”遗传背景，应在目标组织出现任何色素沉积迹象之前加入PTU以抑制酪氨酸酶活性（例如，眼睛约在16 hpf时加入，终浓度为200 μM）。请注意，PTU浓度超过75 μM时可能引起毒性或致畸效应。然而，由于眼睛色素含量较高，低于200 μM的处理不足以满足高分辨率共聚焦成像的需求；在此情况下，应选择外观健康的鱼进行成像。对于其他组织的成像，75 μM PTU可能更为合适。此外，如上所述，使用“白化”突变品系可避免对胚胎进行PTU处理，是晚期幼鱼阶段成像的优选策略。
3. 一旦荧光报告基因表达明显，使用荧光体视变倍显微镜或类似设备，根据转基因表达情况和鱼的整体健康状况进行筛选。
4. 在首次成像前一天，将低熔点琼脂糖（LMA）溶解于胚胎培养液中，终浓度为0.5%，加热并混匀至完全溶解，储存于40°C备用。
5. 在首次成像当天，配制包埋溶液：向含0.5% LMA的胚胎培养液中加入三卡因（麻醉剂，终浓度756 μM）和PTU（如需要），轻轻混匀后放回40°C保温。
6. 将鱼转移至含有PTU和/或三卡因的胚胎培养液中进行麻醉，静置至鱼对触碰无反应（约3分钟）。
7. 将单条鱼转移至包埋溶液中，注意避免稀释琼脂糖以便重复使用。我们使用剪去尖端的移液枪头进行转移，这也有助于控制转移体积（约30 μL）。转移后，将移液枪头倒置，让鱼自然沉降至底部，随后将枪头轻触包埋液表面，利用重力实现无液体排出的转移。
8. 转移后，从移液枪头中排出麻醉液，然后用其将约30 μL包埋液中的鱼转移至培养皿中。
   注意：此包埋方法仅适用于直立式显微镜，使用长工作距离水浸物镜进行成像。对于需使用盖玻片的倒置显微镜相关方法，请参见 Andersen et al., 2010；O'Brien et al., 2009；Graeden and Sive, 2009。
9. 将包埋溶液放回40°C加热块中保温。
10. 使用睫毛刷或类似工具，轻轻旋转鱼至所需方向，并将目标区域置于琼脂糖液滴中央。
11. 重复步骤6至10，以在每个培养皿中包埋所需数量的胚胎。对于连续时间序列成像实验（见下文），我们通常每次包埋六条鱼，并尽量将每组成像时间控制在1小时以内。
12. 在包埋其他鱼的同时，定期检查先前包埋的样本，确保其在琼脂糖凝固前（约3分钟）保持所需方向。
13. 琼脂糖完全凝固后，将鱼转移至共聚焦显微镜载物台上，并在培养皿中轻轻加入含有PTU和/或三卡因的胚胎培养液，直至所有鱼完全浸没。

3. “多色” 体内 共聚焦成像

注意：我们已尽量将以下实验方案进行通用化处理，以便为其他显微镜配置提供相关信息。文中对 Olympus 和 ImageJ 软件应用的具体引用均以引号标出。我们的成像系统为 Olympus FV1000 直立式共聚焦显微镜，配备 405、440、488、515、559 和 635 nm 激光器，两个可调滤光片检测通道（允许发射波长以 1 nm 为增量进行调节），一个标准滤光片通道（用于红色和远红成像），以及一个透射光通道。

1. 打开成像软件（“FV10-ASW”），使用透射光或荧光光源定位目标区域。为获得最佳的细胞和/或分子细节成像效果，应使用长工作距离、高数值孔径（N.A.）的物镜（例如 60X，1.2NA）。
2. 若采集透射光图像，需调节视场光阑以实现科勒照明。
3. 从“染料列表”中选择合适的荧光染料，或从先前保存的图像文件中加载采集参数。根据需要调整发射波长范围（“光谱设置”），以实现报告信号的清晰分离和/或最大化信噪比。这些设置需根据每个实验的具体情况进行经验性优化，以最小化串扰并最大化信号强度；本文所列示例的设置如下所示：

   荧光染料	激光器（nm）	屏障设置 / 发射滤光片（nm）
   1) ECFP、EYFP、mCherry*	440, 515, 559*	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP**, EYFP**, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   使用更长波长的激光（例如 568 或 594 nm）可改善 mCherry 的成像效果
   **由于GFP与YFP之间的激发/发射光谱重叠，需采用可更换二向色镜和发射滤光片的顺序成像模式（“虚拟通道”）。GFP与mCherry可分配至同一通道，YFP则分配至独立通道。注意：在图像相减（第6部分）之前，GFP与YFP图像间的串色现象将明显可见。**
4. 确保在下拉菜单中选择正在使用的物镜，以正确调整软件定义的预设参数。
5. 为聚焦激光并设置功率水平，选择一个查找表（LUT），以显示各通道的像素饱和情况（“高-低”）。将探测器灵敏度（“HV”，即光电倍增管电压）调节至与所需图像质量（通过经验确定）相匹配的数值，并逐步提高激光输出，直至图像强度达到理想水平，同时避免像素饱和。
6. 检查各通道间的串扰；通过手动依次开启和关闭各激光线，同时监测所有成像通道，确保每条激光线仅在相应通道中产生可检测信号。若发现串扰，应降低激光功率以消除干扰。若未观察到明显串扰，则可同时采集所有通道信号，从而显著节省时间。
7. 若无法避免串色干扰，请使用“逐次”成像模式，依次单独切换激光器或通道。在极端情况下（例如同时成像GFP和YFP），需采用同时切换二向色镜和/或发射滤光片的逐次模式（“虚拟通道”）。注意：此选项会显著延长图像采集的时间间隔，可能不适用于捕捉高度动态的过程。
8. “缩放”和“旋转”功能可用于进一步调整目标区域的构图。缩放还可用于提高图像分辨率，最高可达所用物镜和扫描格式的极限（例如，512 × 512；有关这些问题的更多信息，请参见 http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res.pdf）。
9. 对于 体内 成像总体上，尤其是对于延时成像而言，需要特别强调可最大限度减少光毒性问题（即自由基积累）的技术；快速扫描速度（例如， 2 μs/pixe应尽可能使用较长的激发波长（l）和较低的激光输出功率（例如1%），以及足以捕捉关键信息的最低分辨率扫描模式。
10. 为提高图像分辨率，可在采集过程中使用扫描平均（“Kalman”）。较慢的扫描速度也能提高分辨率，但会增加激光驻留时间，从而加剧光毒性和荧光漂白问题。需要注意的是，由于可能无法捕捉z序列中快速变化的过程，上述两种方法均不适用于延时成像，这一现象我们称之为“时间模糊”。需注意，按线平均与按帧平均可在单个成像平面内帮助消除“时间模糊”问题，但无法解决不同z深度之间的“时间模糊”。
11. 如果信号强度较低且无需最高图像分辨率（例如仅需计数细胞数量），可通过增大共聚焦针孔直径来增强信号。这种方法有助于保持较低的激光强度，从而减少光毒性和光漂白；然而，当针孔直径调整至超过1个艾里单位时，图像质量会迅速下降。
12. 使用快速扫描模式（“Focus x4”）定义 z 轴深度范围。由于信号强度通常随 z 轴深度增加而减弱，因此建议从最深层面开始采集 z 轴层叠图像，并在最表层结束采集，这样可在发生显著光漂白前优先获取较弱的信号。
13. 检查图像全深度范围内的信号检测是否充分。如有需要，可使用z维度亮度校正功能（“Bright Z”）在指定深度调整图像采集参数。
14. 根据实验需求设置 z 轴步进尺寸。例如，在第一个示例（图 1）中，我们仅对不同时间点的单个视网膜进行“细胞普查”，因此将 z 轴深度设为 15 微米，每块视网膜采集 5 至 7 张图像。该策略使我们能够在各视网膜中采样，且图像之间无细胞重叠。在第二个示例（图 2）中，我们进行了快速的 4D 时间序列成像，其中需要对 GFP 和 mCherry 信号进行空间关联，因此将步进尺寸设为理论横向分辨率的三倍——这一折中方案使得每 5–10 分钟即可获取一组 z 轴层扫图像，同时仍能分辨单个细胞的细节。
15. 采集图像（“XYLZt”），并保存。若进行连续时间序列成像实验（见下文第4步），则继续下一条鱼。快速时间序列成像请参见下文第5步。

4. 连续“捕获与释放”成像：一种在连续数天内追踪单条鱼类个体细胞变化的方法

1. 采用“捕获-释放”方案可最大限度地减少鱼类被固定的时间，并提高每次实验中成像的鱼类数量。该技术的适用范围仅限于在数天内展开的生物学过程（例如，Mumm 等 2006²）。这种方法的一个优势在于能够进行内部对照，即对同一个体在不同状态下的比较，而非在不同群体之间进行比较。例如，即使不同个体鱼最初被标记的细胞数量存在较大差异，仍可准确追踪特定组织中被标记细胞数量的变化。本方案在前药诱导细胞消融实验中的应用方法 ^3,5 在此提供。
2. 为在个体鱼类中随时间观察特定细胞类型的消融与再生过程，需在前药给药前（Pre-treatment）、前药去除后立即（Post-treatment）以及恢复期间（Recovery images）采集共聚焦图像。
3. 治疗前成像：将斑马鱼按上述方法固定并进行成像。成像完成后，将斑马鱼释放至胚胎培养基（含前体药物）中，并在 28.5°C 直到治疗后的成像阶段。两人一组协作操作，一人负责固定和释放斑马鱼，另一人进行成像，是提高每日成像鱼数量的有效方法。
4. 成像完单个培养皿中的所有鱼后，将含有三卡因的胚胎培养基替换为不含三卡因的胚胎培养基（含或不含PTU）。
5. 使用珠宝镊在幼鱼两侧切开琼脂糖，然后轻轻剥离琼脂糖，直至幼鱼在胚胎培养基中自由游动。
6. 前药诱导消融：将幼虫转移至含胚胎培养基（加/不加PTU）和前药（如10 mM甲硝唑，MTZ）的多孔板单个孔中。为确保前药终浓度准确，通常先将含有2倍浓度前药（如20 mM）的一定体积胚胎培养基（加/不加PTU）分装至各孔中，再向每孔加入等体积含或不含PTU的胚胎培养基的鱼类样本，使前药终浓度达到1倍。
7. 孵育于 28.5°C 直至靶向细胞消融得到验证。
   注意：实现成功消融所需的前药治疗方案因靶向的细胞类型而异；前药浓度和处理时间需通过实验经验确定，需注意高浓度可能引起普遍毒性，例如 >10 mM MTZ。此外，断裂的报告基因信号可能存在持续性，这会使消融效果的评估变得复杂，在某些情况下需要共聚焦显微镜来充分观察细胞丢失情况。
8. 处理后成像：将斑马鱼固定，使其相同组织处于最佳方向，并按上述方法进行成像。同一培养板上所有斑马鱼完成成像后，将其释放至含胚胎培养基（±PTU）的独立孔中（同上），并于 28.5°C 以促进被消融细胞类型的再生。
9. 根据鱼类的年龄以及恢复所需时间，可能需要在此检测阶段喂食。我们使用草履虫或轮虫等活体饲料以确保最佳存活率。建议每天更换新鲜培养液，特别是当鱼类饲养在较小体积的环境中时（例如96孔板）。
10. 恢复期成像：为记录细胞替代的动力学过程，可在恢复期间每天对鱼类进行成像。一旦确定了动力学特征，即可通过仅在感兴趣的时间点（例如完全恢复时）获取恢复期图像来简化检测。图1展示了我们在视网膜细胞再生研究中采用该方法的示例。
11. 实验结束时，应将鱼置于20X三卡因溶液中浸没处死（15.3 μM) 溶液置于冰上。

5. 快速时间序列成像。

1. 对于多种荧光物质的快速延时成像（即“动态影像”），必须采用可最大程度减少光毒性的技术（见上文）。如前所述，该技术最适合用于支持同时成像而非顺序成像的荧光物质。
2. 使用加热载物台、ITO玻璃加热元件或类似装置，将斑马鱼维持在28.5°C。
3. 采用减少蒸发的方法，以帮助稳定温度和渗透压（例如，对倒置显微镜使用O形圈密封的盖玻片）。
4. 若进行长时间的自动图像采集，请务必设置足够的Z轴堆栈范围，以容纳样本的生长和/或Z方向的漂移。
5. 设定时间间隔和扫描次数（“TimeScan”或“TimeController”）。采集频率需根据所观察生物学过程的动力学特征，或目标细胞群体对光毒性的敏感性，通过实验经验确定或相应调整。
6. 采集图像（点击“XYLZt”按钮）并保存。
7. 为构建“动态影像”，需定义感兴趣区域，并在X、Y和Z维度上进行对齐。完整流程超出本方案综述的范围，但已有多种软件程序可支持在4D图像组装过程中实现缩放、旋转和平移等功能（如Volocity、Amira等）。

6. 使用 ImageJ 免费软件进行光谱分离图像处理

1. 理想情况下，在进行多报告基因成像实验时，应使用光谱上充分分离的荧光染料。然而，这并不总是可行或实际的。本文提供了一种简化方法，用于分离具有重叠激发和发射光谱的荧光染料，此处以GFP和YFP为例。在所提供的示例中，我们采用了上述时间推移成像技术，追踪GFP标记的视网膜“干细胞”——穆勒胶质细胞——在靶向消融及再生YFP与NTR-mCherry标记的视网膜双极细胞过程中的行为（图2）。
2. 使用顺序成像模式和可变的阻挡滤光片采集图像，可分别实现对重叠荧光染料的独立采集和部分分离（GFP/YFP设置示例见上文）。为消除串色信号，我们采用简单的图像减法策略，即从一个通道中减去另一通道的信号。
3. 图像减法处理：安装最新版本的 ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html）、Loci Bio-Formats 工具（http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej）以及堆栈对齐插件（http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html）。
4. 使用 Loci Bio-Formats Import 插件打开图像文件；只需将目标文件拖放到 ImageJ 窗口中即可启动导入工具。在导入窗口中勾选“拆分通道”复选框，或在加载后使用“通道工具”下的“拆分通道”选项卡（shift + ctrl + z），将各通道拆分为独立的图像栈。
5. 启动 Align 3 TP 插件（plugins>对齐图像序列> 对齐3个TP）。需要对图层进行对齐以确保正确减影。在第一个下拉框中选择参考图层，在第二个下拉框中选择未对齐的图层。勾选“使用xy相对原点”和“使用z相对原点”选项，然后点击“OK”。
6. 开始配准过程时，点击“Volume Registration”按钮。此时将出现一个包含配准参数的新窗口。该部分已由插件供应商优化，无需修改，直接点击“OK”即可。
7. 完成后，将出现“对齐堆栈”窗口。在对齐窗口中选择“输出”，输出窗口应随之出现。该窗口已优化，无需修改，点击“确定”。工作区中将出现一个新的堆栈，文件标题末尾附加有“对齐”字样。
8. 将使用“图像计算器”（Process）去除串扰>图像计算器）。在“图像1”下拉框中选择待减去的图像栈，在“图像2”下拉框中选择用于减法运算的图像栈。在“操作”下拉框中选择“减去”，然后点击“确定”。ImageJ 将提示是否处理该图像栈，选择“是”。此时应出现一个新的图像栈，其中已去除重叠通道间的串扰。
9. 为在配准和减影前重建相同的图像结构，需要合并图像序列。在通道工具窗口中选择“合并通道”。该工具允许您将最多四个序列合并为一个复合图像序列。
   注意：若要合并超过 4 个图层，请使用拼接工具按所需顺序拼接图层（图像>堆叠>工具>拼接）。将拼接后的图像序列转换为超图像序列（images>超堆栈>将堆栈合并为超堆栈。合并堆栈会改变深度、时间、通道（zct）顺序，需在出现的下拉框中重置；将“order”设为xyztc，根据堆栈数量、堆栈深度和时间点数分别设置“channels”、“slices”和“frames”。
10. 最后，所有通道均需进行染色、调整亮度与对比度，并保存为TIFF文件。此后，转换为RGB、拼接、z轴投影或时间序列的操作与原始文件的处理流程相同。

7. 代表性结果

图 1. 一系列延时共聚焦图像，展示表达 NTR-mCherry 的视网膜双极细胞（红色细胞）的靶向性丢失与再生过程。A 和 A') 处理前，“对照”双极细胞中表达膜标记的 YFP 报告基因，呈黄色；“靶向”双极细胞中表达硝基还原酶-Cherry 融合蛋白，呈红色，呈现马赛克样分布。B 和 B') 经甲硝唑处理后，表达红色硝基还原酶的双极细胞消失，而黄色的“对照”双极细胞得以保留。这表明该消融方法具有高度特异性。C 和 C') 停止甲硝唑处理后，表达 NTR（红色）的细胞重新出现。

图2. 展示了图像减影处理的一个示例，该处理可在图像采集后将GFP和YFP清晰分离。A与A'：在减影前，对GFP（绿色）和YFP（伪彩为紫色）图像进行排列对齐。B与B'：减影过程可将标记YFP的双极细胞从GFP图像中去除，从而更易于检测标记GFP的穆勒胶质细胞。C与C'：箭头所指细胞中可见GFP（绿色）与mCherry（红色）的共表达。由于穆勒胶质细胞标志物与双极细胞标志物的共表达，提示双极细胞消融可触发穆勒胶质细胞替代丢失的细胞。这一解释与近期关于视网膜再生的研究一致，这些研究认为穆勒胶质细胞在哺乳动物和鱼类中均可作为损伤诱导的“干细胞”。

讨论

在本视频中，我们概述了用于多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。我们采用延时成像技术在活体（in vivo）条件下监测多种目标细胞类型的行为，同时利用靶向细胞消融技术研究神经环路功能及细胞特异性的神经元再生模式。所展示的实例突出了这些方法带来的若干优势。其中最为显著的是，延时成像提供了一种内部自对照的研究范式：所有观察到的现象均可与先前状态进行直接关联，从而实现不同实验时间点之间的直接比较而非推断性比较，使相对变化更易于量化，并减少因群体内个体差异带来的实验“噪声”。多色成像的一个优势在于能够可视化相互作用和/或相邻细胞类型的变化。例如，通过使用标记穆勒胶质细胞的转基因品系，我们正在表征这些潜在的损伤诱导性干细胞对视网膜特定细胞亚群丢失所作出的反应。我们还利用该方法揭示了神经环路形成的新型机制²。此外，除了细胞再生研究外，我们最近也开始利用基于NTR的消融系统，结合多种行为学范式和电生理检测手段，探究神经元亚型——即特定神经环路——的功能作用。采用斑马鱼进行此类研究的独特优势在于，由于其具有强大的再生能力，所诱导的功能缺陷是暂时性的。因此，通过与延时成像分析相结合，我们能够明确导致功能恢复的再支配机制，以及实现功能恢复所需的再支配程度。

所提供的方法可适用于许多不同的科学问题。例如，类似的消融与再生分析可应用于任何可通过转基因手段定义的细胞亚型。总体而言，此类研究有望在单个细胞类型水平以及特定干细胞微环境层面拓展我们对再生机制的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 试剂：
Danau溶液：
氯化钠（Fisher, S271 1） 氯化钾（Fisher, P217 500） HEPES（Fisher, BP310500） 硫酸镁（Fisher, M65 500） 硝酸钙（Fisher, C109500） 青霉素-链霉素（Fisher, ICN1670049）
其他试剂：
低熔点琼脂糖（Fisher, BP165-25） 三卡因甲磺酸盐（Fisher, NC9435281） N-苯基硫脲（Fisher, NC9968868） 甲硝唑（Fisher, AC21034-1000）
2. 耗材：
深型培养皿（Fisher Scientific/Corning, 08-772-32） Dumont #5 精细镊子（Fisher, NC9404145）
3. 仪器：
变倍体视显微镜（Olympus, SZ51） 荧光变倍体视显微镜（Olympus, SZX16） 共聚焦显微镜（Olympus FV1000） 数字恒温金属浴（Fisher, 11-715-125DQ） Barnstead/Thermolyne 台式培养箱（Fisher, 11-702-4）