使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

摘要

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程，用于对在组蛋白结合结构域上存在差异的蛋白质异构体进行全基因组定位分析。我们将其应用于ChIP-Seq分析，以鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的作用靶点。

摘要

转录因子和表观遗传因子招募至其靶点是调控过程中的关键步骤。在招募过程中，能够结合特定组蛋白修饰的蛋白质结构域尤为突出。其中一个结构域是植物同源异型域（plant homeodomain, PHD），存在于多种染色质结合蛋白中。表观遗传因子 RBP2 含有多个 PHD 结构域，但这些结构域具有不同的功能（图4）。特别是，在人类白血病中发现的 RBP2 致癌融合蛋白中所含的 C 末端 PHD 结构域能够结合组蛋白 H3 第4位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K4me3）¹。在原始单核细胞、淋巴瘤来源的 U937 细胞向单核细胞分化过程中，包含 C 末端 PHD 的 RBP2 亚型对应的转录本逐渐积累²。与上述两组数据一致的是，全基因组分析显示，在分化的 U937 细胞中，RBP2 蛋白定位于富含 H3K4me3 的基因组区域³。RBP2 在其靶位点的定位与其组蛋白去甲基化酶活性相关，导致 H3K4me3 水平下降，并伴随转录活性降低。相比之下，RBP2 的另外两个 PHD 结构域无法结合 H3K4me3。值得注意的是，较小的 RBP2 亚型中缺失了 C 末端的 PHD 结构域⁴。可以推测，缺乏与 H3K4me3 相互作用能力的小亚型在基因组定位上不同于较大的亚型。RBP2 不同亚型在基因组定位上的差异可能解释了其功能多样性的现象。具体而言，RBP2 是视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）介导的细胞分化过程中的关键参与者。与这些数据一致，此前未区分亚型的全基因组分析鉴定了两类不同的 RBP2 靶基因：1）以不依赖于分化的方式被 RBP2 结合的基因；2）以依赖于分化的方式被 RBP2 结合的基因。

为了鉴定不同亚型在定位上的差异，我们通过ChIP-Seq进行了全基因组定位分析。利用可检测两种RBP2亚型的抗体，我们确定了所有RBP2的靶位点。此外，我们还拥有仅结合大分子量RBP2亚型而不结合小分子量亚型的抗体（图4）。在鉴定出大分子量亚型的靶位点后，可通过从全部RBP2靶位点中扣除这些位点，从而揭示小分子量亚型的靶位点。这些数据表明了染色质相互作用结构域在将蛋白招募至基因组结合位点过程中的作用。

方案

该方案最初改编自 B. Ren，2001 年。它是对 Odom 等人⁵提出的方案稍作修改而成，原始方案可从以下网址获取：http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads

1. 抗体与磁珠的预封闭及结合（应在下一步前一晚进行）

1. 每次免疫沉淀（IP）使用100 μL Dynabeads Protein G（多个IP可合并处理），在1 mL新鲜的BSA/PBS溶液中（10 mL PBS中含50 mg BSA，该溶液可保存一周）洗涤一次。
2. 使用磁力架收集磁珠，并重复洗涤步骤两次。
3. 接着，每IP向250 μL PBS/BSA溶液中的磁珠悬液加入10 μg抗体，于4°C在旋转平台上孵育过夜。
4. 孵育结束后，用1 mL PBS/BSA溶液洗涤磁珠三次，然后每IP用10 μL PBS/BSA溶液重悬磁珠。

2. 细胞交联

1. 开始该实验步骤时，每次免疫沉淀（IP）需培养约 10⁸ 个细胞。此处使用弥散性组织细胞性淋巴瘤 U937 细胞，并用 TPA 诱导其向单核细胞分化，持续 96 小时。
2. 细胞培养完成后，将甲醛溶液直接加入培养基中，使其终浓度为 1%。轻轻摇动培养瓶数秒，室温静置 10 分钟。随后吸除培养基，用 15 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞一次，重复洗涤一次。
3. 接着，将 6 mL 裂解缓冲液 1（含蛋白酶抑制剂，成分为 50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA，10% 甘油，0.5% NP-40，0.25% Triton X-100）加入冰上的每个培养瓶中，然后在 4°C 条件下轻轻振荡 20 分钟。
4. 最后，用细胞刮刀收集细胞，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。此时细胞可保存于 -80°C。

3. 细胞超声处理

1. 若细胞为冷冻状态，需先将其解冻。解冻后，在 4°C 条件下以 3,000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。随后，将细胞重悬于 6 mL 裂解缓冲液 2（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，200 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，含蛋白酶抑制剂）中，在室温下轻轻摇动试管 10 分钟。
2. 重复离心操作，并将细胞重悬于 2.5 mL 裂解缓冲液 3（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，0.1% 脱氧胆酸钠，0.5% N-月桂酰肌氨酸，含蛋白酶抑制剂）中。
3. 接下来，将细胞悬液置于冰水中，并使用 Branson 450 超声破碎仪，将微探头振幅设定在 50% 至 60% 之间，为超声处理做准备。
4. 以持续 30 秒的脉冲进行超声处理，随后在冰上冷却 1 分钟。重复该过程 10 至 15 次。然后用移液器反复吹打管内液体，并转移至新管中。再额外进行 5 次脉冲与冷却循环。
5. 超声处理完成后，向溶液总体积中加入终浓度为 10% 的 Triton X-100。将裂解物转移至 1.5 mL 离心管中，用微量离心机离心去除碎片，然后将上清细胞裂解物转移至新的离心管中。

4. 染色质免疫沉淀

1. 在进行染色质免疫沉淀（ChIP）之前，保留50 μL细胞裂解液作为输入样本。然后将澄清的细胞裂解液与上述方法预先制备的、已结合抗体的Dynabeads混合。将混合物连同50 μL输入样本一起，在4°C下轻轻摇动过夜。
2. 用1 mL洗涤缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.6，0.5 M LiCl，1 mM EDTA，0.7%脱氧胆酸钠，1% NP-40）洗涤磁珠。使用磁力架收集磁珠并去除上清液。重复此洗涤步骤6至8次。
3. 用1 mL含50 mM NaCl的TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）进行最后一次洗涤。在4°C下以3,000 rpm的转速将磁珠在微量离心机中离心2分钟。离心后，吸除残留的TE缓冲液。
4. 然后向样品中加入100 μL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，1% SDS）。立即在65°C下孵育10至15分钟。每2分钟将离心管在1.5 mL管架上轻轻刮擦，以保持磁珠悬浮状态。
5. 通过离心和磁力架收集磁珠，并将上清液转移至PCR管中。取出之前保存的输入样本，加入3倍体积的洗脱缓冲液。
6. 最后，将免疫沉淀（IP）样本和输入样本放入热循环仪中，在65°C下孵育过夜，以逆转交联。
7. 次日，向各样品中加入1倍体积的TE缓冲液。然后加入RNase A至终浓度为0.2 μg/μL。在热循环仪中37°C孵育1至2小时。
8. 孵育结束后，加入蛋白酶K至终浓度为0.2 μg/μL。然后在热循环仪中55°C孵育2小时。
9. 接下来，用1倍体积的苯酚对样品进行第一次抽提；再用1倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）进行第二次抽提；最后用1倍体积的氯仿:异戊醇（24:1）进行第三次抽提。
10. 然后向每个样品中加入30 μg甘油原。同时加入NaCl至终浓度为0.2 M，并加入2倍体积的乙醇。在-80°C下孵育30分钟。孵育后离心样品，弃去上清液。用500 μL 75%乙醇洗涤沉淀。随后将沉淀干燥，并重悬于40 μL水中。
11. 为检测超声处理产生的DNA片段大小，取5 μg纯化的输入样本上样至1.8%琼脂糖凝胶并进行电泳。超声处理应产生150–350碱基对范围内的DNA片段。若片段大小不在该范围内，应通过调整脉冲次数和振幅来优化超声处理条件。
12. 为评估ChIP的稳健性和特异性，使用1 μL IP样本及输入样本的系列稀释液，对对照结合区域进行基因特异性PCR检测。需选择两到三个“结合”区域及一个“非结合”对照区域，以评估IP样本和输入样本的质量。

5. 基因组DNA的扩增

1. 使用34 μl的IP样品或200 ng的input样品，利用Genomic DNA Sample Prep Kit http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn（Illumina, Inc., San Diego, CA）对DNA片段进行末端修复、'A'尾添加及接头连接。
2. 使用MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA，然后将其洗脱于预热至50 °C的缓冲液EB（10 mM Tris Cl，pH 8.5）中。例如，IP和input DNA样品的最终洗脱体积分别使用23 μL和46 μL。
3. 使用23 μL已连接接头的DNA，加入试剂盒中的25 μL Phusion DNA聚合酶、1 μL 20 μM Sol_PCR_1和1 μL 20 μM Sol_PCR_2进行PCR反应。PCR程序如下：1）98°C下30秒；2）98°C下10秒；3）65°C下30秒；4）72°C下30秒；重复步骤2–4共18次，然后72°C延伸5分钟，最后在4°C保存。
4. PCR扩增后，使用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA。将15 μL缓冲液EB预热至50 °C并用于DNA洗脱。取0.5 μL样品稀释1:4后进行Nanodrop测定。

6. 扩增产物的凝胶纯化

1. 为纯化扩增产物，使用HPLC级水制备50 mL的1.8%琼脂糖凝胶。待琼脂糖完全融化后，加入TAE缓冲液和溴化乙锭。然后倒入凝胶模具中。在输入样本和IP样本中各加入4 μL上样缓冲液后上样。以120伏电压电泳45分钟。
2. 电泳结束后分析凝胶结果。凝胶应显示产生大小在150至350碱基对之间的片段，这些片段代表长度为50至250碱基对的基因组DNA片段以及一个接头序列。
3. 用解剖刀切下含有150至350碱基对范围内DNA的凝胶区域，注意避免切下在约120碱基对位置迁移的接头-接头二聚体条带。按照试剂盒说明书使用QIAquick凝胶回收试剂盒回收DNA。具体而言，每柱适用于不超过400 mg的凝胶切块。开始提取时，向1体积凝胶中加入3体积的QG缓冲液，再加入1体积的异丙醇，混匀后上柱。先用0.5 mL QG缓冲液洗涤柱子，随后按试剂盒手册中的标准步骤操作。使用预热至50°C的H₂O洗脱DNA。洗脱前，将30 μL预热H₂O加入柱中，37°C孵育5分钟，然后离心收集DNA。
4. 使用无加热的Speedvac将样品浓缩至恰好11 μL。取1 μL样品，用Nanodrop分光光度计测定DNA浓度。
5. 最后，按照http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf ⁶中所述方法，使用Illumina Genome AnalyzerIIe鉴定富集的基因产物。

7. 代表性结果

图1. 下述实验的总体目标是鉴定组蛋白去甲基化酶KDM5A/JARID1A/RBP2的基因组靶标。

（P1）通过制备交联的染色质，并进行超声处理以获得合适大小的DNA片段来实现该过程。（P2）第二步，使用RBP2抗体对与RBP2结合的DNA片段进行免疫沉淀。（P3）随后，对回收的DNA片段进行末端修复，并将接头连接到基因组DNA的两端，以制备用于Illumina簇生成仪流动池分析的基因组DNA文库。DNA文库通过PCR扩增，使用较少的循环数。（P4）最后，将Illumina测序获得的短读段唯一比对至人类基因组，识别出显著的富集峰，并注释到最近的基因，以确定RBP2富集区域。（P5）获得的结果展示了基于全基因组范围内RBP2富集区域的鉴定所关联的RBP2靶基因的分子功能。

图2. 检测染色质超声破碎结果 为检测超声破碎处理所产生的DNA片段大小，将5 μg（1/10）纯化的输入样品加入1.8%琼脂糖凝胶进行电泳。如预期所示，我们的超声破碎程序产生的片段大小在150–350 bp范围内。然而，若片段大小不在该范围内，应通过调整脉冲次数和振幅来相应优化超声破碎条件。

图3. 扩增产物的凝胶纯化。 将PCR产物进行凝胶电泳，以去除接头序列，并选择适合簇生成平台的模板片段大小范围。该凝胶显示，产生的片段大小在150至350个碱基对之间。这些片段包含长度为50至250个碱基对的基因组DNA片段以及接头序列。我们使用手术刀切下所选的凝胶区域。操作时应小心避免切到接头-接头连接形成的条带，该条带迁移位置约为120个碱基对。

图 4. 亚型特异性抗体可区分 RBP2 的长亚型与短亚型。 RBP2 蛋白结构以结构域形式展示。RBP2 包含多个结构域：催化组蛋白去甲基化的 JmjC 结构域及其相关的 JmjN 结构域、能够进行序列特异性 DNA 结合的 ARID 结构域、可能与 DNA 或其他蛋白质相互作用的 C5HC2 锌指结构域，以及多个 PHD 结构域。两种可用于区分 RBP2 亚型的抗 RBP2 抗体分别针对图中粗线所示的 RBP2 片段制备。

图5a. RBP2结合区域在染色体及Ensembl基因上的分布概览。 已鉴定的RBP2（所有异构体及大异构体）富集结合区域的基因组坐标按染色体展示。Ensembl基因（版本54；hg18）在染色体上的分布（本图中为染色体10）以黑色条形表示（上层面板）。每个RBP2结合区域以垂直线表示，其中中层面板展示染色体10上所有RBP2异构体的结合区域，下层面板展示RBP2大异构体的结合区域。中层与下层面板共同呈现了RBP2异构体在染色体10上重叠与特异性占据的总体情况。

图5b. RBP2靶基因的功能富集分析。 热图显示在RBP2（全部亚型及大亚型）结合的基因（RBP2结合区域最近的基因）中，经FDR校正后显著富集（p值 ≤0.05）的GO分子功能类别。颜色越接近红色表示统计学显著性越高，黄色表示统计学显著性较低，灰色表示无统计学显著性。富集分析揭示了RBP2靶基因在功能上的重叠性以及亚型特异性的分子功能。

讨论

RBP2同工型之间的功能差异尚未确定。我们采用综合方法鉴定RBP2同工型结合的基因组区域，并界定这些区域所代表的功能类别。该目标通过ChIP-Seq分析及对获得的测序读长进行生物信息学分析来实现。

RBP2 可修饰组蛋白尾部的甲基化赖氨酸残基。我们发现，包含甲基化组蛋白赖氨酸识别模块的 RBP2 大亚型与缺乏该模块的 RBP2 小亚型在人类基因组中结合于不同的区域（图 5A）。重要的是，这些亚型特异性结合区域以及重叠区域所对应的基因具有不同的分子功能（图 5B）。例如，“染色质结合”和“转录因子结合”功能可归因于 RBP2 小亚型靶向的基因，而不能归因于 RBP2 大亚型靶向的基因（图 5B）。通过比较为所有亚型以及 RBP2 大亚型生成的实际基因集合（数据未显示），我们还可以确定大亚型是否被特异性招募至某些基因。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F79500
BSA	USB Corp., Affymetrix	10852
chloroform/isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	C0549
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Genomic DNA Sample Prep Kit	Illumina	FC-102-1001
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
glycogen	Boehringer Ingeheim	901393
Hepes	Invitrogen	15630080
KOH	Fisher Scientific	P250-500
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
Low molecular weight DNA ladder	New England Biolabs	N3233S
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
N-lauroyl sarcosine	MP Biomedicals	194008
NP-40	Sigma-Aldrich	I3021
PBS	Fisher Scientific	mt21040cv
phenol	Sigma-Aldrich	P-4557
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	F-540S
proteinase K	GIBCO, by Life Technologies	25530-049
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
MinElute PCR purification Kit	Qiagen	28004
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RNAse A	Sigma-Aldrich	R4642
SDS	Invitrogen	24730020
TE (endofree for maxi-prep kit)	Qiagen	19048
Tris	Sigma-Aldrich	154563
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151100
Ultra Agarose, Certified low-range	Bio-Rad	161-3106
Oligonucleotide sequences 2006 Illumina, Inc. All rights reserved. Sol_PCR_1 Sequence 5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’ Sol_PCR_2 Sequence 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3’