检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

摘要

唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。

摘要

哺乳动物Toll样受体（TLRs）是一类识别病原体相关分子模式的受体家族。TLRs不仅在感知微生物（例如病毒、细菌和寄生虫）感染中发挥关键作用，还在传染性疾病、炎症性疾病以及可能的自身免疫性疾病的病理生理过程中扮演重要角色。因此，针对传染性疾病的TLR反应强度和持续时间必须受到严格调控。由此可见，了解感受器受体的结构完整性、配体相互作用及其信号转导组分，对于后续的免疫保护至关重要，同时也为通过调控感受器来干预疾病提供了重要机会。尽管TLR感受器的信号通路已被充分表征，但控制感受器与其配体之间相互作用的参数仍不明确。我们最近发现了一种由天然配体激活TLR的全新机制，此前尚未被观察到^1,2。该机制表明，配体诱导的TLR激活受到Neu1神经氨酸酶激活的严密调控。我们还报道了Neu1可严格调控神经营养因子受体（如TrkA和TrkB）³，其中涉及Neu1与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在受体复合物中的相互作用⁴。神经氨酸酶活性检测最初被用于发现一种新型配体——百里醌，其可通过GPCR Gαi蛋白和MMP-9激活巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞表面的Neu4神经氨酸酶⁵。对于TLR受体，我们的数据表明，Neu1神经氨酸酶已与TLR-2、-3和-4受体形成复合物，并在配体结合任一受体后被激活。活化的Neu1神经氨酸酶可水解远离配体结合位点的唾液酸α-2,3连接的β-半乳糖残基，从而消除TLR-4二聚化、MyD88/TLR4复合物招募、NFκB激活及促炎性细胞反应的空间位阻。在一项合作研究中，Neu1神经氨酸酶已被证明可调控巨噬细胞的吞噬作用⁶。综上所述，神经氨酸酶活性检测为我们深入理解配体诱导受体激活的分子机制提供了强有力的见解。尽管Neu1神经氨酸酶与TLR、Trk受体激活之间的精确关系仍有待进一步阐明，但这一发现代表了一种全新的或开创性的细胞调控通路研究方法。

方案

1. 复苏冻存的巨噬细胞

1. 从-80°C冰箱中取出冻存细胞前，需准备培养基，使用经无菌过滤的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）和5 μg/mL的支原霉素。支原霉素是一种抗生素溶液，用于我们的研究中清除并预防细胞培养物中的支原体污染。
2. 对于一管冻存细胞，需在无菌生物安全柜中向25 cm² 的细胞培养瓶中加入4 mL、1 mL的培养基。
3. 当从-80°C冰箱中取出冻存细胞管时，应在无菌操作台中用手快速温育解冻，约需2-3分钟。
4. 细胞一旦完全解冻，应立即使用1 mL无菌移液器迅速转移至含有预置培养基的培养瓶中。
5. 含有细胞的培养瓶应置于37°C、5% CO₂ 的组织培养孵箱中培养。
6. 每天使用倒置显微镜观察细胞生长和贴壁情况，直至细胞融合度达到75%至90%。
7. 在细胞培养孵育期间，将12 mm圆形玻璃盖玻片置于大型玻璃培养皿中，用70%乙醇覆盖，在生物安全柜中消毒1小时；随后将乙醇移除并储存以备再次使用，并将湿润的玻璃片暴露于生物安全柜内经紫外照射的无菌过滤气流中，干燥24小时或直至完全干燥。

2. 唾液酸酶检测的细胞接种

1. 铺板前，使用经火焰灭菌的4英寸全弯带齿不锈钢镊子，在无菌条件下将一个单独的无菌圆形玻璃盖玻片小心放入BD Falcon 24孔平底带盖组织培养处理的聚苯乙烯板的一个孔中。对于一个75%融合度的细胞培养瓶，我们通常使用该培养板的12个孔。
2. 对于贴壁的巨噬细胞，需在无菌操作柜中用5 mL无菌移液管从培养瓶中移除DMEM条件培养基。用1×无菌Tris缓冲盐水（pH 7.4）洗涤贴壁细胞一次，以去除含血清的培养基，然后加入1 mL无钙无镁（CMF）磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4），用量以覆盖细胞为宜。将培养瓶置于37°C培养箱中约10分钟，或直至细胞开始从瓶壁脱落。可轻轻晃动或摇动培养瓶以松动残留的贴壁细胞。
3. 向培养瓶中悬浮的1 mL细胞悬液加入3 mL DMEM条件培养基。取0.5 mL细胞悬液，无菌转移至含有12 mm圆形玻璃盖玻片的组织培养板孔中。每个盖玻片上大约接种0.5 × 10⁶个细胞。
4. 将含有细胞的组织培养板置于37°C、5% CO₂条件下培养24小时，以使细胞充分贴附于圆形玻璃盖玻片上。

3. 唾液酸酶活性检测

1. 制备对照组

1. 在生物安全柜或实验台中放置一张载玻片（磨砂端：一端，1张，25 × 75 × 1 mm），按顺序依次加入以下化合物并混匀：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA，最后加入 3 μL pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水（TBS）。
2. 从含有细胞的一个孔中移除培养基后，用4英寸镊子轻轻将圆形玻璃盖玻片移至孔的角落。小心地用镊子取出盖玻片，并将带有细胞的一面朝下放置于载玻片上的混合液中。
3. 立即取该载玻片置于已设定为紫外滤光片并配备数码相机用于捕获荧光图像的落射荧光显微镜下进行观察。
4. 先在相差显微镜下聚焦，直至可见细胞，然后切换至荧光模式。分别在1分钟、2分钟和3分钟时拍摄细胞的荧光图像，另拍摄一张相差模式下的细胞图像。

2. 制备阳性对照

1. 在另一张显微镜载玻片上按以下顺序点样：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL TBS。
2. 重复上述步骤 3.1.2 至 3.1.4。

3. 使用神经氨酸酶抑制剂达菲进行阳性对照实验

1. 在另一张显微镜载玻片上，按以下顺序点样下列化合物：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL Tamiflu。
2. Tamiflu 浓度预先用 pH 7.4 的 1× Tris 缓冲盐水配制；与圆形玻璃载玻片上的活细胞接触时，各化合物的最终浓度将被稀释 5 倍。
3. 重复上述步骤 3.1.2 至 3.1.4。

4. 抑制50%唾液酸酶活性所需抑制剂浓度（IC₅₀）的测定

1. 为了定量细胞周围荧光强度，使用 ImageJ 1.38x 软件及其用于测量 RGB 的分析插件对图像进行分析。在细胞周围随机选取 50 个点进行荧光读数，并计算总荧光强度的平均值。
2. IC₅₀ 值通过非线性回归分析获得，以抑制剂浓度的对数值（例如，log ng/mL）作为横坐标，平均荧光强度作为纵坐标作图生成。

5. 成功的秘诀

1. 确保培养的细胞无支原体污染。我们通常在培养基中使用Plasmocin来预防此类污染。
2. 人工神经氨酸酶底物4-MUNANA应新鲜配制。配制好的底物可用于唾液酸酶活性检测，且在一周内有效。
3. 如果细胞系在细胞表面的受体表达水平较低，可使用较高剂量的配体进行刺激。
4. 我们还发现，传代超过6次的细胞可能会失去其受体表型。应重新复苏并培养新鲜细胞。

6. 典型结果

请参见附带的 Powerpoint 文件 中包含的唾液酸酶活性检测动画方案及代表性结果。

讨论

利用新开发的检测活巨噬细胞中唾液酸酶活性的分析方法²，我们采用该技术以剂量依赖的方式检测了活BMC-2巨噬细胞中配体诱导的唾液酸酶活性，同时也检测了活DC-2.4树突状细胞、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌细胞、人野生型（WT）以及1140F01和WG0544 I型唾液酸沉积症成纤维细胞中的唾液酸酶活性。神经氨酸酶抑制剂如达菲（磷酸奥司他韦）可抑制活BMC-2细胞中百里醌（thymoquinone, TQ）诱导的唾液酸酶活性，其IC₅₀为0.0194 μM，而神经氨酸酶抑制剂DANA（2-脱氧-2,3-脱氢-D-N-乙酰神经氨酸）的IC₅₀为19.17 μM⁵。我们还报道了其他应用：特异性抗Neu1、Neu2和Neu3抗体对活BMC-2细胞和人THP-1巨噬细胞中TQ诱导的唾液酸酶活性无抑制作用，而抗Neu4抗体则完全阻断该活性。该唾液酸酶活性还可用于检测经TQ处理的来源于野生型（WT）和组织蛋白酶A功能低下小鼠（继发性Neu1缺陷，NeuI KD）的原代骨髓（BM）巨噬细胞中显著的唾液酸酶活性，但在Neu4基因敲除（Neu4 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
胎牛血清	Hyclone
DakoCytomation 荧光封片剂	Dako	S3023	15 mL
达菲（磷酸奥司他韦）	Hoffmann-La Roche AG