唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。
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方法文章
检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物Toll样受体（TLRs）是一类识别病原体相关分子模式的受体家族。TLRs不仅在感知微生物（例如病毒、细菌和寄生虫）感染中发挥关键作用，还在传染性疾病、炎症性疾病以及可能的自身免疫性疾病的病理生理过程中扮演重要角色。因此，针对传染性疾病的TLR反应强度和持续时间必须受到严格调控。由此可见，了解感受器受体的结构完整性、配体相互作用及其信号转导组分，对于后续的免疫保护至关重要，同时也为通过调控感受器来干预疾病提供了重要机会。尽管TLR感受器的信号通路已被充分表征，但控制感受器与其配体之间相互作用的参数仍不明确。我们最近发现了一种由天然配体激活TLR的全新机制，此前尚未被观察到1,2。该机制表明，配体诱导的TLR激活受到Neu1神经氨酸酶激活的严密调控。我们还报道了Neu1可严格调控神经营养因子受体（如TrkA和TrkB）3，其中涉及Neu1与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在受体复合物中的相互作用4。神经氨酸酶活性检测最初被用于发现一种新型配体——百里醌，其可通过GPCR Gαi蛋白和MMP-9激活巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞表面的Neu4神经氨酸酶5。对于TLR受体，我们的数据表明，Neu1神经氨酸酶已与TLR-2、-3和-4受体形成复合物，并在配体结合任一受体后被激活。活化的Neu1神经氨酸酶可水解远离配体结合位点的唾液酸α-2,3连接的β-半乳糖残基，从而消除TLR-4二聚化、MyD88/TLR4复合物招募、NFκB激活及促炎性细胞反应的空间位阻。在一项合作研究中，Neu1神经氨酸酶已被证明可调控巨噬细胞的吞噬作用6。综上所述，神经氨酸酶活性检测为我们深入理解配体诱导受体激活的分子机制提供了强有力的见解。尽管Neu1神经氨酸酶与TLR、Trk受体激活之间的精确关系仍有待进一步阐明，但这一发现代表了一种全新的或开创性的细胞调控通路研究方法。
方案
1. 复苏冻存的巨噬细胞
- 从-80°C冰箱中取出冻存细胞前，需准备培养基，使用经无菌过滤的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）和5 μg/mL的支原霉素。支原霉素是一种抗生素溶液，用于我们的研究中清除并预防细胞培养物中的支原体污染。
- 对于一管冻存细胞，需在无菌生物安全柜中向25 cm2 的细胞培养瓶中加入4 mL、1 mL的培养基。
- 当从-80°C冰箱中取出冻存细胞管时，应在无菌操作台中用手快速温育解冻，约需2-3分钟。
- 细胞一旦完全解冻，应立即使用1 mL无菌移液器迅速转移至含有预置培养基的培养瓶中。
- 含有细胞的培养瓶应置于37°C、5% CO2 的组织培养孵箱中培养。
- 每天使用倒置显微镜观察细胞生长和贴壁情况，直至细胞融合度达到75%至90%。
- 在细胞培养孵育期间，将12 mm圆形玻璃盖玻片置于大型玻璃培养皿中，用70%乙醇覆盖，在生物安全柜中消毒1小时；随后将乙醇移除并储存以备再次使用，并将湿润的玻璃片暴露于生物安全柜内经紫外照射的无菌过滤气流中，干燥24小时或直至完全干燥。
2. 唾液酸酶检测的细胞接种
- 铺板前，使用经火焰灭菌的4英寸全弯带齿不锈钢镊子，在无菌条件下将一个单独的无菌圆形玻璃盖玻片小心放入BD Fal....
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讨论
利用新开发的检测活巨噬细胞中唾液酸酶活性的分析方法2，我们采用该技术以剂量依赖的方式检测了活BMC-2巨噬细胞中配体诱导的唾液酸酶活性，同时也检测了活DC-2.4树突状细胞、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌细胞、人野生型（WT）以及1140F01和WG0544 I型唾液酸沉积症成纤维细胞中的唾液酸酶活性。神经氨酸酶抑制剂如达菲（磷酸奥司他韦）可抑制活BMC-2细胞中百里醌（thymoquinone, TQ）诱导的唾液酸酶活性，其IC50为0.0194 μM，而神经氨酸酶抑制剂DANA（2-脱氧-2,3-脱氢-D-N-乙酰神经氨酸）的IC50为19.17 μM5。我们还报道了其他应用：特异性抗Neu1、Neu2和Neu3抗体对活BMC-2细胞和人THP-1巨噬细胞中TQ诱导的唾液酸酶活性无抑制作用，而抗Neu4抗体则完全阻断该活性。该唾液酸酶活性还可用于检测经TQ处理的来源于野生型（WT）和组织蛋白酶A功能低下小鼠（继发性Neu1缺陷，NeuI KD）的原代骨髓（BM）巨噬细胞中显著的唾液酸酶活性，但在Neu4基因敲除（Neu4 .......
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披露
S.R.A. 和 P.J. 对本研究的贡献相同，同为第一作者。
致谢
MRS 部分经费来自加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、Harry Botterell 神经科学研究基金会、ARC 以及 Garfield Kelly 心血管研究与发展基金。S.R.A. 获得了女王大学研究奖和 Robert J. Wilson 研究生奖学金。P.J. 获得了女王大学研究生奖和 Robert J. Wilson 研究生奖学金。A.G. 和 S.A. 获得了女王大学研究生奖。S.F. 获得了安大略省科技研究生奖学金（OGSST）。A.G. 获得了女王大学 Franklin Bracken 研究生奖学金。S.A. 获得了女王大学 R.S. McLaughlin 研究生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| 胎牛血清 | Hyclone | ||
| DakoCytomation 荧光封片剂 | Dako | S3023 | 15 mL |
| 达菲（磷酸奥司他韦） | Hoffmann-La Roche AG |
参考文献
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
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