显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

摘要

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。

摘要

将外源基因导入蚊子基因组需要针对特定蚊种优化的显微注射技术。本视频方案展示了James实验室用于在斯氏按蚊胚胎中显微注射DNA构建体以获得转基因蚊子的方法。内容包括显微注射针的制备、胚胎的收集与处理以及显微注射操作的技术演示。 显微注射针制备，胚胎收集，胚胎处理，显微注射，外源基因导入，斯氏按蚊，转基因蚊子

方案

显微注射前的准备工作：

1. 为蚊子提供血液：若需在周一至周三进行注射，则于前一周的周五让雌蚊吸血；若需在周四和周五注射，则于当周周一让雌蚊吸血。
   
   
2. 使用程序2和等渗缓冲液制备石英玻璃针（见材料部分）。
   
   
3. 胚胎的“产卵管”为常规的黑腹果蝇培养管。在管底放入湿润的棉絮，并用一张湿润的滤纸圆片覆盖其上。
   
   
4. 准备塑料盖玻片：在一端粘贴双面胶带，并修剪胶带，使其与盖玻片边缘对齐，完全覆盖盖玻片末端。
   
   
5. 准备用于脱水的油。
   
   
6. 准备一个含有等渗缓冲液的培养皿，用于转移胚胎以进行孵化。

强制产卵的设置：

1. 使用吸虫器收集6-10只吸血后的雌蚊，并将其转移至 果蝇 含等渗缓冲液浸润的棉絮和滤纸的培养管。
   
   
2. 将蚊子重新放回昆虫饲养室的黑暗条件下，使其产卵 1 小时 15 分钟。
   
   
3. 让成虫飞入笼中，然后移除带有胚胎的滤纸片。
   
   
4. 在解剖显微镜下对卵进行排列。使用细毛画笔（貂毛，0000号）收集卵团，并转移至预先用等渗缓冲液浸湿的3MM Whatman滤纸方块上。始终保持滤纸湿润，避免卵干燥。用画笔去除卵的外 chor....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射用石英针		Sutter Instrument Co.		外径 1.0 mm，内径 0.70 mm，长度 10 cm，通过毛细管拉制仪将毛细管拉制成尖端细小（3–8 µm）、杆部约 100–300 mm 的微细移液管。
石英拉针仪	工具	Sutter Instrument Co.	P-2000	设置参数：加热-275，拉力-3，速度-38，延迟-250，拉力-141
内毒素清除质粒提取试剂盒		Qiagen
异丙醇
Millex-GV 滤柱			SLGV RO4 NL	用于 DNA 纯化
构建质粒 DNA				0.5 mg/ml
辅助质粒				0.3 mg/ml
注射缓冲液	缓冲液			1× 溶液：5 mM KCl，0.1 mM 磷酸钠，pH 6.8
等渗缓冲液				参见实验方案部分的配方
干燥油				卤代烷油 700 与卤代烷油 27 按 1:1 混合，充分混匀。显微注射前预先配制。
血液				用于喂养蚊子
Anopheles stephensi	动物			蚊子，雌雄均有。
果蝇培养管				用于产卵
培养皿				加入等渗缓冲液，用于胚胎孵化
精细画笔				貂毛 #0000
3MM Whatman 滤纸
#5 镊子
双面胶带
微量加样器头		Eppendorf	5242 956.003
显微注射仪		Eppendorf
显微镜		Leica Microsystems		配备移动载物台和显微操作器，放大倍数设为 10×