显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

摘要

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。

摘要

将外源基因导入蚊子基因组需要针对特定蚊种优化的显微注射技术。本视频方案展示了James实验室用于在斯氏按蚊胚胎中显微注射DNA构建体以获得转基因蚊子的方法。内容包括显微注射针的制备、胚胎的收集与处理以及显微注射操作的技术演示。 显微注射针制备，胚胎收集，胚胎处理，显微注射，外源基因导入，斯氏按蚊，转基因蚊子

方案

显微注射前的准备工作：

1. 为蚊子提供血液：若需在周一至周三进行注射，则于前一周的周五让雌蚊吸血；若需在周四和周五注射，则于当周周一让雌蚊吸血。
   
   
2. 使用程序2和等渗缓冲液制备石英玻璃针（见材料部分）。
   
   
3. 胚胎的“产卵管”为常规的黑腹果蝇培养管。在管底放入湿润的棉絮，并用一张湿润的滤纸圆片覆盖其上。
   
   
4. 准备塑料盖玻片：在一端粘贴双面胶带，并修剪胶带，使其与盖玻片边缘对齐，完全覆盖盖玻片末端。
   
   
5. 准备用于脱水的油。
   
   
6. 准备一个含有等渗缓冲液的培养皿，用于转移胚胎以进行孵化。

强制产卵的设置：

1. 使用吸虫器收集6-10只吸血后的雌蚊，并将其转移至 果蝇 含等渗缓冲液浸润的棉絮和滤纸的培养管。
   
   
2. 将蚊子重新放回昆虫饲养室的黑暗条件下，使其产卵 1 小时 15 分钟。
   
   
3. 让成虫飞入笼中，然后移除带有胚胎的滤纸片。
   
   
4. 在解剖显微镜下对卵进行排列。使用细毛画笔（貂毛，0000号）收集卵团，并转移至预先用等渗缓冲液浸湿的3MM Whatman滤纸方块上。始终保持滤纸湿润，避免卵干燥。用画笔去除卵的外 chorion（exochorion），这有助于卵更好地黏附于胶带。
   
   
5. 使用5号精细镊子或精细毛笔，挑取深灰色的胚胎，并将其排列在用等渗缓冲液润湿的3MM Whatman滤纸方块上，排成一行，共20-30枚胚胎。所有胚胎必须保持相同朝向，因为注射需在胚胎后极进行；胚胎前端略宽于后端。随后，用条状3MM Whatman滤纸从卵列两侧用力按压，吸干卵列周围滤纸上的液体，注意不要触碰胚胎。
   
   
6. 转移卵子时，将带有双面胶（Medicine）的载玻片倒置，轻轻按压卵子。卵子的后端必须非常接近双面胶的边缘。纸张的湿度对此步骤至关重要，若过于湿润则卵子无法粘附。我对胚胎进行干燥处理从 5-10 其次，但干燥时间取决于显微注射室内的湿度和温度。
   
   
7. 干燥处理 对卵子至关重要：脱水过度则胚胎无法孵化；若不脱水，DNA 无法进入胚胎。
   
   
8. 用卤代烃油覆盖干燥的胚胎，以防止进一步脱水。

胚胎显微注射：

良好注射最重要的方面是针头的质量（见注释）。

1. 使用微量移液器（Eppendorf #5242 956.003）将待注射的DNA溶液吸入注射针中。所需注射液体积很小，仅需1至2 ml。
   
   
2. 将注射针连接至Eppendorf  Transjector，该装置可控制注射时间、注射压力以及反向压力。显微注射在带有移动载物台（Leica）的显微镜下进行，放大倍数为10倍，并配合使用显微操作仪（Leica）。如有需要，可通过堆叠4-5张载玻片来升高显微镜载物台。将承载胚胎的盖玻片置于升高的载物台上。注射时，注射针与胚胎呈150°角，穿刺部位应位于胚胎后极。进行注射时，我保持注射针静止不动，而通过移动显微镜载物台来完成操作。新的注射针尖端通常封闭，在首次注射时会破裂。每次注射间隔，我都会测试所需压力，使少量DNA溶液在油中形成微小液滴以确认通畅。
   
   
3. 当使用新注射针时，我将注射时间设定为0.2–0.9秒，压力设定为1000 hPa。通过调整压力和时间，直至观察到针尖在油中释放出微小液滴为止。反向压力应设置在约100 hPa左右。随着针尖磨损，必须降低注射压力以维持较低的注射体积（约300 hPa）。当针尖变得过大时，会导致大部分胚胎死亡。
   
   
4. 注射完成后，用纸巾吸除油液，将带有胚胎的载玻片盖好，并 放入含有等渗缓冲液的培养皿中。将培养皿置于孵育箱内，直至胚胎孵化。胚胎通常在2–6天后开始孵化。将孵化出的幼虫转移至含有少量磨碎鱼食的蒸馏水中培养。

注意事项

用于注射的DNA：用于注射的质粒DNA溶液使用无内毒素质粒提取试剂盒（EndoFree plasmid kit）进行提取。将构建质粒与辅助质粒按正确浓度混合，用异丙醇沉淀。沉淀物用70%乙醇洗涤，然后溶于注射缓冲液中。注射前，使用Millex-GV滤柱纯化DNA。

等渗缓冲液：

1.68 M NaCl - 88.3 ml 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M Hepes - 10.7 ml 1.12 M CaCl2 - 2.2 ml dH2O - 896 ml

或

5 M NaCl - 29.67 ml 1 M KCl - 4.87 ml 1 M Hepes - 10.7 ml 1.12 M CaCl2 - 2.2 ml dH2O - 952.56 ml

调节至 pH 7.2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射用石英针		Sutter Instrument Co.		外径 1.0 mm，内径 0.70 mm，长度 10 cm，通过毛细管拉制仪将毛细管拉制成尖端细小（3–8 µm）、杆部约 100–300 mm 的微细移液管。
石英拉针仪	工具	Sutter Instrument Co.	P-2000	设置参数：加热-275，拉力-3，速度-38，延迟-250，拉力-141
内毒素清除质粒提取试剂盒		Qiagen
异丙醇
Millex-GV 滤柱			SLGV RO4 NL	用于 DNA 纯化
构建质粒 DNA				0.5 mg/ml
辅助质粒				0.3 mg/ml
注射缓冲液	缓冲液			1× 溶液：5 mM KCl，0.1 mM 磷酸钠，pH 6.8
等渗缓冲液				参见实验方案部分的配方
干燥油				卤代烷油 700 与卤代烷油 27 按 1:1 混合，充分混匀。显微注射前预先配制。
血液				用于喂养蚊子
Anopheles stephensi	动物			蚊子，雌雄均有。
果蝇培养管				用于产卵
培养皿				加入等渗缓冲液，用于胚胎孵化
精细画笔				貂毛 #0000
3MM Whatman 滤纸
#5 镊子
双面胶带
微量加样器头		Eppendorf	5242 956.003
显微注射仪		Eppendorf
显微镜		Leica Microsystems		配备移动载物台和显微操作器，放大倍数设为 10×