本文介绍一种将染色的Drosophila胚胎以直立方式封片的实验方案，可用于共聚焦显微镜下观察其横截面图像。
本文内容
摘要
摘要
一些著名的形态发生梯度和细胞运动发生在背腹轴上Drosophila胚胎。然而，目前用于观察这些过程的技术在一定程度上存在局限性。以下方案描述了一种用于固定并标记胚胎的新技术。Drosophila用于共聚焦成像的冠状面观察胚胎。该方法包括将胚胎夹在两层甘油果冻封片介质之间，并将果冻条直立放置进行成像。夹心胚胎的第一步是在载玻片上制备一层薄薄的甘油果冻基底。接着，将胚胎仔细排列在该表面上，并覆盖第二层果冻。待第二层果冻凝固后，切割果冻条并翻转至直立状态进行成像。根据所使用的显微镜支架类型，文中还描述了若干替代方案以实现胚胎的可视化。由于背腹轴上的所有细胞均可在单个共聚焦Z平面内成像，本方法可实现荧光信号的精确测量与比较，避免了传统纵切面封片胚胎三维重建中常见的光漂白和光散射问题。
方案
1. 成像方法
- 将甘油明胶置于55°C水浴中加热20-30分钟，直至其完全融化为均匀液体。轻轻旋转瓶身，但不要摇晃，以避免产生气泡。
- 在明胶融化的同时，用Kimwipe将一层薄薄的甘油涂抹于洁净的载玻片表面（可选步骤）。
- 使用剪去尖端的P1000移液枪头吸取1至1.5 mL融化的甘油明胶，滴加到载玻片表面，形成一层薄的基底。操作时需小心移液，避免产生气泡。
- 将载玻片水平放置，使明胶固化5分钟，随后置于-20°C环境中5分钟，接着进行胚胎排列。或者，用Saran Wrap封住载玻片，并在4°C下保存最多5天。
- 在明胶基质的一侧，滴加一小滴用70%甘油/PBS或其他抗荧光淬灭的甘油类封片剂（如Slowfade或Vectashield）染色的胚胎。
- 开始预排列胚胎，使用倾斜的皮下注射针头将胚胎逐个从液滴转移至明胶表面，利用针头斜面作为“小勺”进行操作。
- 将胚胎粗略地排列成2至3列。若胚胎卡在针头中，可将其在含有其他胚胎的液滴中轻轻搅动以释放。此阶段无需精细排列，各列之间应留出适当间距。
- 借助皮下注射针头，在明胶表面水平滑动胚胎以完成排列。滑动过程中，使所有胚胎的头尾方向一致，并沿列平行排列。用拧成细条的Kimwipe吸除残留的PBS甘油痕迹。
注意：过量甘油会导致胚胎在凝胶中包裹不牢，引起两层明胶分离，从而难以切片和封片；反之，去除过多甘油则会使胚胎脱水变平。 - 使用剪切的黄色移液枪头，在胚胎上方覆盖一层薄明胶（50–150 μL，具体体积取决于已排列的胚胎数量）。
- 将载玻片置于-20°C冰箱中10–20分钟，或在4°C下过夜保存。确保明胶完全硬化后再进行切片，否则胚胎块将难以完整切除。最佳切片效果通常在次日获得。
- 在解剖显微镜下，使用刀片从排列好的胚胎两侧彻底切穿明胶。保持刀片与载玻片呈90°角，以获得整齐切口。切口应尽量靠近胚胎的前后极，以减少多余明胶对成像的干扰。
- 在切口旁加入100–200 μL冰冷的PBT缓冲液（4°C，PBS+0.1% Tween 20），并用刮铲小心刮除胚胎之间的明胶。
注意：PBT中的去污剂有助于在不损伤胚胎的前提下将明胶从载玻片上清除。 - 使用针头将包含胚胎的明胶块转移至另一洁净载玻片上，进行进一步切割。每块可切成含5–7个胚胎的小块。使用PBT可方便地移动明胶块。或者，可将明胶块置于干燥玻璃表面，使其附着于玻璃，以增加稳定性，便于必要时精确修整明胶。
- 借助刀片和针头，将嵌入明胶中的胚胎翻转至直立位置。为便于显微镜观察，请根据所用显微镜类型选择以下两种操作之一。
- 倒置显微镜：将处理好的胚胎块放置于长条形盖玻片上，确保胚胎呈直立状态。应使胚胎中明胶较少的一侧更接近物镜。
- 正置显微镜：使用四片#1盖玻片用快干胶粘合成两组堆叠结构作为“支撑物”，将含胚胎的明胶块置于甘油中并放置于两“支撑物”之间，再用长条形盖玻片搭桥覆盖。
- 进行共聚焦显微分析前，需核查所用物镜的工作距离，以确定能否完整穿透胚胎成像或仅能部分成像。例如，D. melanogaster 胚胎长度约为0.55 mm，可使用Zeiss 20x Plan-Apo或40x LD Neo-Fluor物镜实现全厚度成像。以下网站提供Zeiss物镜的相关信息，并支持按工作距离搜索：https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. 代表性结果
由于胚胎保持完整，该方法可用于精确测量胚胎大小以及基因表达模式之间的距离。在图1中，我们展示了囊胚期胚胎，其经DAPI核染色（蓝色）、抗Dorsal蛋白抗体（红色）、sog mRNA（黄色）和sna mRNA（绿色）染色。利用该方法还可观察到多种形态学过程，例如中胚层的内陷（图2A、B）以及中胚层细胞的迁移（图3和图4）。通过改变焦平面，可以获得沿背腹轴（DV轴）不同Z轴位置的图像，如图2至图4所示。
图1. 囊胚期完整胚胎的直立光学切片。 mRNA和蛋白质的双重染色。目标mRNAs用于 原位 探针（sog 和 sna）以及通过一抗（anti-Dorsal）染色的蛋白质在图中显示。使用DAPI标记细胞核。请注意，表达的 sog 和 sna 位于细胞质顶端，而Dorsal的表达位于细胞核内。来自 sog 在此放大倍数下，也可观察到位于细胞核内的新生转录本。
图 2. 完整原肠胚的直立成像。 图中标明了所使用的 mRNA 探针及其对应的颜色。A) 注意在此发育阶段，三种使用相同荧光标记的基因（sna、sog 和 dpp，绿色）在空间上分离的区域表达。内陷的中胚层表达 sna，成神经细胞层表达 ind，外胚层表达 dpp，而 sog 的表达仍存在于神经系统腹侧区域。B) 在同一胚胎更深的共聚焦焦平面中，可见内陷中胚层基部强烈表达 sna，但其顶端区域表达水平较低。
图3. 胚胎完整且原肠带伸展时的直立成像。 sog RNA（黄色）；snail、ind 和 dpp mRNA（绿色），Dorsal蛋白（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。A）靠近胚胎头部的焦平面。B）同一胚胎躯干部位的另一焦平面。注意在侧向迁移前的中胚层细胞团（与图4比较），位于原肠带伸展胚胎腹侧中线两侧。正在脱离的神经母细胞以绿色标记（ind 和 sna）。
图4. 胚胎在原肠带伸展期间完整样本的直立成像。 sog RNA（黄色）； 蜗牛, ind 和 dpp mRNA（绿色），Dorsal蛋白（红色）。A）注意从上皮层脱离的神经母细胞（箭头），均被染色 ind 和 sna 在此阶段（绿色）。还请注意其表达受限的 sog 腹侧中线（黄色）。表达 dpp 在此阶段可见于胚胎的侧边（星号所示）。B）与A图相同胚胎的光学切片，位于胚胎长度接近末端处，对应中后部区域。腹侧中线细胞经sog染色。
讨论
对果蝇（Drosophila）胚胎进行横截面成像具有挑战性，因为这需要精细的手工切片解剖2，或使用包埋介质进行切片机处理，而后者通常会对荧光染色造成不利影响。另一种方法是利用共聚焦显微镜获取Z轴层扫图像（Z-stacks），进而重建横截面的三维图像。然而，为获得精确的三维重建结果而采集多个薄层共聚焦图像耗时较长，且光漂白问题变得显著。当胚胎以纵向方式封片成像时，另一个问题是光线在穿透胚胎深层区域时会发生散射，这也会干扰对荧光信号的精确测量，从而影响蛋白或mRNA表达水平的定量分析1。即使使用双光子共聚焦显微镜，由于胚胎中央卵黄物质的不透明性，光散射问题仍然存在，这限制了可用于实现样品最佳通透性的封片介质的选择。
为解决这些问题，近期开发了一种名为“端面成像”（End-on）的新技术，通过将胚胎垂直定位来进行成像，适用于活体和固定样本4。在本文中，我们建立了一种新的垂直安装胚胎实验方案，可简便地制备和观察经多种原位杂交探针染色的、任意大小和形状的固定胚胎或组织3。该方法利用具有凝胶状一致性的封片介质，将排列整齐的胚胎包裹其中；含有包埋胚胎的介质小块可在成像前直立放置，适用于各类共聚焦显微镜观察。
通过将胚胎包埋在琼脂糖凝胶中并垂直放置，我们能够利用共聚焦显微镜进行水平横切，从而同时呈现胚胎背腹轴上的细胞。这种方法在定量分析方面具有显著优势，因为它消除了传统纵向安装胚胎进行Z轴层扫重建时常见的光散射和荧光染料光漂白问题。因此，沿胚胎背腹轴的基因表达或蛋白质水平的定量更为准确，因为位于背腹相对位置的细胞可在同一时间、同一共聚焦Z轴平面上被成像。此外，本方法使我们能够直接从三维胚胎获得跨越整个背腹轴的完整二维图像，而无需使用复杂的计算展开方法来可视化背腹轴不同位置的细胞6。
关键步骤包括在对齐胚胎后去除多余的甘油，以避免明胶两层之间发生分离。然而，如果样品脱水过度，所获得的图像将发生变形并呈现不正确的形态。此外，如果在胚胎周围的明胶未垂直切割而是倾斜切割，由于胚胎的放置角度偏离90度，所得图像可能显得不够圆形而更趋椭圆形。最后，如果在胚胎的前/后端未将明胶切割至足够接近胚胎的位置，则无法获得清晰的图像，因为物镜的工作距离将主要用于聚焦到明胶中，而非胚胎本身。
在对晚期原肠胚进行成像时，另一个可能至关重要的步骤是在排列胚胎之前，先在显微镜下仔细筛选出目标发育阶段的胚胎。通常，胚胎的分期依据其形态学特征，而这些特征在胚胎处于纵向位置时最容易识别。
该方法可进行多种替代性改进，例如将抗淬灭试剂（如对苯二胺或PPD）加入琼脂糖凝胶的第二层中，以帮助防止荧光染料发生光漂白。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者特别感谢 Deborah Harris 和 Danielle MacKay。本工作的支持来自凯斯西储大学生物系、艺术与科学学院，以及霍华德·休斯医学研究所（HHMI）授予的编号为 52005866 的资助，用于支持生物科学领域的本科生教育。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甘油明胶封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | 含有低浓度苯酚作为防腐剂，应在通风橱或通风良好的区域使用。自制该封片剂的配方见 Zander, 1997。 |
| 蔡司 LSM 700 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 使用以下物镜：Plan-Apo 20x 0.8 M27（工作距离 0.55 mm）；EC Plan-Neofluar 40x 1.3 油镜（工作距离 0.21 mm）；LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X（工作距离 2.9 mm）。 | |
| 含 0.1% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBT） | |||
| 玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| 玻璃盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | 尺寸 1 ½（专为此项工作中所用物镜设计）。 |
| 玻璃盖玻片（用于制作支撑物） | Fisher Scientific | 12-544-10 | 使用四片用瞬干胶粘合的盖玻片。 |
| 解剖显微镜 | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| 剃刀刀片 | 带钢背的单刃工业用刀片 | ||
| 刮勺 | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 皮下注射针头 | Fisher Scientific | 1482610 | 26 号规格 |
| 移液器 | Labnet International |
参考文献
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
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