在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

摘要

我们将演示如何研究单个点突变对离子通道功能的影响。

摘要

我们将演示如何研究在离子通道中引入点突变的功能效应。我们研究的是G蛋白门控内向整流钾通道（简称GIRK通道），这类通道在调节神经元兴奋性方面具有重要作用。哺乳动物体内存在四种不同的GIRK通道亚单位（GIRK1–GIRK4），本实验聚焦于GIRK2，因其可形成同源四聚体。激活不同类型的G蛋白偶联受体（GPCR），如毒蕈碱型受体（M2R），可导致GIRK通道的激活。此外，酒精也可直接激活GIRK通道。我们将展示如何通过特异性改变GIRK通道cDNA中的一个或多个核苷酸，实现单个氨基酸的突变。该突变后的cDNA序列将在细菌中扩增并纯化，随后通过DNA测序确认点突变的存在。将野生型与突变型GIRK通道的cDNA转染至培养的人胚肾HEK293T细胞中 体外最后，将采用全细胞膜片钳电生理技术研究异源表达的野生型或突变型GIRK通道中的宏观钾电流。在本实验中，我们将检测GIRK2通道中L257W突变对M2R依赖性和酒精依赖性激活的影响。

方案

1. 位点定向诱变

我们使用编码GIRK2 cDNA的哺乳动物表达质粒pcDNA3.1，并根据制造商的说明，利用Stratagene（Agilent Technologies）的Quikchange XL II定点突变试剂盒引入点突变。

引物序列可使用以下网站提供的在线引物设计程序轻松生成：
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

注意：我们使用标准的 Eppendorf 1.5 mL 离心管替代方案中所述的 BD 14 mL 管。然而，使用经 β-巯基乙醇预处理的 XL10-Gold 超感受态 E. coli、30 秒热激时间以及 NZY⁺（或 NZYM⁺）培养基，对于成功进行定点突变至关重要。如有可能，在引入突变的同时设计一个额外的同义突变以产生新的限制性酶切位点，将有助于后续对突变菌落的筛选。

2. 质粒小提、DNA 测序与质粒大提

2.1 使用Qiagen质粒小提试剂盒进行质粒提取及测序。

挑取单个细菌菌落，在含有氨苄青霉素（AMP）的LB肉汤培养基中培养。按照制造商说明书纯化cDNA。如果在上述第1步中引入了限制性酶切位点，则可通过简单的限制性酶切鉴定来确认突变是否成功导入。DNA自动测序在外部机构完成，这对于确认cDNA中存在目标突变以及检测是否存在任何非预期突变至关重要。此步骤非常重要。我们使用位于pcDNA3.1质粒多克隆位点两侧的T7启动子正向引物和BGH反向测序引物，对整个GIRK编码序列进行测序。

注意：必须仔细检查测序电泳图谱，以确保测序数据具有足够的质量。高质量的电泳图谱应呈现尖锐、不重叠的峰，且背景噪音较低。

2.2 Qiagen 大提纯试剂盒。

我们遵循制造商的说明书。

注意：在我们的实验中，此步骤旨在提高 cDNA 的纯度，我们发现这对实现高效的转染至关重要。

3. HEK293T 细胞的培养与转染

所有这些步骤都应在无菌的组织培养罩内进行。

3.1 细胞培养

HEK293T细胞易于培养（37°C、5% CO₂的湿化培养箱），具有快速的增殖能力、高转染效率，并适用于全细胞膜片钳电生理记录，因此使用方便。HEK293T细胞表达SV40大T抗原，可确保pcDNA3.1质粒的附加体复制。

HEK293T 细胞在添加了 L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）的低糖 DMEM 培养基中培养。传代细胞时，向汇合度为 90–95% 的 HEK293T 细胞中加入 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，待细胞从培养皿上脱落之后，通过加入含 FBS 的新鲜培养基终止酶活性。将约 1 × 10⁵ 个细胞接种至 12 孔细胞培养板的每孔中，每孔加入 1 mL 无抗生素的培养基。（1 × 10⁵ 个细胞大约相当于将 T25 培养瓶中汇合的细胞用 10 mL 培养基重悬后所得细胞悬液的 350 μL）。

3.2 转染

转染前8-24小时，HEK细胞将贴附于塑料培养皿表面，即可进行转染。使用Invitrogen Lipofectamine 2000试剂，将0.2 μg通道cDNA、0.4 μg M2R受体cDNA和0.04 μg YFP cDNA共转染至细胞中。注意：我们使用少量YFP cDNA以确定成功转染的细胞（绿色荧光细胞很可能同时表达了GIRK通道和M2受体）。不同克隆所需cDNA的浓度需进行优化调整。

3.3 转染细胞的荧光观察。

将12孔板置于倒置荧光显微镜载物台上，观察细胞的YFP表达情况。与DIC图像进行比较，记录绿色荧光细胞的大致数量，以此估算转染效率。

3.4 24孔板和多聚-D-赖氨酸包被盖玻片的准备

将12 mm的玻璃盖玻片（Warner, CS-12R）与Radiacwash溶液一同振荡清洗过夜，随后用去离子水冲洗，并在95%乙醇中振荡过夜。将清洁后的盖玻片保存于70%乙醇中，直至使用。

将盖玻片放入盛有乙醇的培养皿中，用镊子和酒精灯烧去乙醇，然后放入无菌24孔板的一个孔中。

每孔加入250 μL多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液［0.2 mg/mL］，将盖玻片置于PDL溶液中，于无菌操作台内浸渍过夜。用Parafilm封住24孔板以防止蒸发。

次日早晨，吸除PDL溶液，用无菌水洗涤2次。将培养板敞开放置在超净台内干燥，然后盖上盖子。包被有盖玻片的24孔板可用无菌铝箔包裹，于室温下保存数周。

3.5 将转染的 HEK293T 细胞接种到盖玻片上

转染后24小时，将细胞接种至含多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片的24孔板中（约4 × 10³ 个细胞/孔）。注意：转染后的细胞可在转染后24–72小时内使用。细胞分种的目的是为膜片钳电生理实验提供独立的盖玻片。

4. 电生理学

4.1 配制溶液

细胞外（浴槽）溶液：20 mM KCl、140 mM NaCl、0.5 mM CaCl₂、2 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES（用 NaOH 调节至 pH 7.4）。

分装 20K 浴液并加入适当的调节剂

• 20K + Ba²⁺：含有 1 mM BaCl₂ 的溶液，为内向整流电流的特异性抑制剂
• 20K + 卡巴胆碱：含有 5 μM 卡巴胆碱的溶液，为特异性 M2R 激动剂；M2R 可与 G 蛋白偶联，从而打开 GIRK 通道
• 20K + 乙醇：含有 100 mM 乙醇（EtOH）的灌流溶液，用于直接激活 GIRK 通道

将浴液放入快速交换灌流系统的注射器（溶液容器）中。注意：我们使用 Warner 夹管阀系统来控制浴液。建议使用 PE 管。

内液/电极溶液：140 mM KCl，20 mM NaCl，5 mM EGTA，5.4 mM MgCl₂，10 mM HEPES（pH 7.4），含 2.5 mM K₂ATP 和 0.3 μM Li₂GTP。

我们配制不含ATP和GTP的电极液。ATP和GTP则分别配制成 aliquot（分装液），储存于-80°C，待实验当天再加入电极液中。将装有最终电极液的注射器置于冰上保存，以维持ATP/GTP的活性。所有内液/外液均经无菌过滤（0.2 μm），以抑制微生物生长，并降低管路和电极堵塞的可能性。

4.2 拉制电极

我们使用Narishige双步垂直拉制仪和Warner Instrument的硼硅酸盐玻璃电极（外径1.5 mm，内径0.86 mm，长度7.5 cm），在填充细胞内溶液后获得电阻为3-7 MΩ的电极。

注意：必须在实验室内针对电极拉制仪的参数和电极玻璃类型进行实际测定。对于我们的垂直拉制仪，第一次拉制的加热设定值为60.2，第二次拉制约为43。

4.3 全细胞膜片钳

1. 使用少量凡士林将盖玻片固定在35 mm培养皿中，加入外部溶液覆盖，并将培养皿置于倒置荧光显微镜载物台上。使用微分干涉差（DIC）调焦并寻找细胞，切换至YFP荧光以定位YFP阳性细胞。
2. 将灌流管路的尖端置于绿色细胞附近（距离目标细胞20–30 μm，相当于2–3个细胞长度）。
3. 用溶液填充电极，将其连接至Axopatch 200B放大器（Axon Instruments）的前置放大头阶段，初始设置如下：增益（Gain）为1，配置为全细胞模式（whole-cell β=1），工作模式为电压钳（V-clamp）。
4. 对电极施加正压以防止移液管堵塞，并使用操纵器将电极尖端移至细胞正上方。
5. 为将电极电位归零，选择“封接测试”（Seal Test）按钮以施加测试电压阶跃。在Clampex的封接测试窗口中将出现一个5 mV的矩形电压阶跃。调节放大器上的电极偏移（Pipette Offset）电位器，使基线电流回到0 nA。或者，也可将放大器模式选择器切换至V-track模式，将仪表旋钮调至Vtrack，再使用放大器上的电极偏移电位器，使放大器仪表显示的电压归零至“0.00”。
6. 使用Clampex 8.2软件的封接测试命令检查电极电阻（应为3–7 MΩ）。
7. 打开已保存的实验协议文件或创建新协议。要打开协议文件，请从主菜单选择“Acquire”（采集），然后选择“Open Protocol”（打开协议），并选择一个已保存的电压协议文件。本实验所用协议设定为：将膜电位钳制在-40 mV，施加一次50 ms的电压阶跃至-100 mV，随后在200 ms内斜升至+40 mV。该协议每2秒执行一次。此斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位和内向整流特性。对于电压门控离子通道，使用矩形电压阶跃可能更为合适。
8. 使用操纵器进行精细调节，使电极接近细胞，释放正压，在接触细胞表面后施加负压，并在封接测试示波器窗口中监测电阻的上升。当电阻达到GΩ范围时，表明电极已与细胞膜形成高阻封接（即形成Gigaseal）。
9. 施加短暂负压脉冲以破裂细胞膜，进入细胞内部。一旦进入全细胞记录模式，将观察到电容性电流的增加。
10. 切换至Clampex中的“膜测试”（Membrane Test）模式，记录接入电阻（Ra）、膜电阻（Rm）、膜电容（Cm），并通过肉眼判断理论曲线与实际电容性电流的指数拟合情况。膜电容与细胞大小成正比，后续将用于计算电流密度。
11. 切换回封接测试模式，将V-Out（膜电位）设定为-40 mV，并将滤波器设置为10 kHz。
12. 通过以下步骤在放大器上补偿膜电容和串联电阻：
    1. 打开“WHOLE CELL CAP”开关。反复调节“WHOLE CELL CAP”和“SERIES RESISTANCE”旋钮，直至测试脉冲呈平坦状。必要时还需调节移液管电容“FAST CAP”旋钮。
    2. 将“% PREDICTION”旋钮调至约60–80%，再次调节“WHOLE CELL CAP”和“SERIES RESISTANCE”旋钮（可能还需同时调节移液管电容补偿“FAST CAP”旋钮）。
    3. 在不引起细胞振荡的前提下，将“% COMP-”旋钮调至100%，同时通过重新调节“WHOLE CELL CAP”和“SERIES RESISTANCE”旋钮尽量保持脉冲平坦（可能还需调节移液管电容补偿“FAST CAP”旋钮）。通过减小时间常数来调节滞后时间（Lag）。
    4. 在实验记录本中记录放大器上设置的膜电容（Cm）、串联电阻（Rs）、%COMP、%PRED和滞后时间（Lag）的数值。Cm和Rs应与上述“膜测试”中测得的Cm和Rm值大致相同。
13. 打开外部溶液阀门以控制浴液。将放大器的8极Bessel滤波器设为2 kHz，打开电压钳协议并开始记录电流。
14. 我们使用斜升协议记录GIRK电流：先在-100 mV维持50 ms，然后在200 ms内从-100 mV斜升至+40 mV，每2秒施加一次。该斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位及其内向整流特性。在室温（22–25°C）条件下，当浴液含20 mM KCl时，GIRK电流的反转电位应接近-50 mV（即K⁺的计算平衡电位，E_K = -50 mV），在高于E_K的电位下电流保持相对平坦。
15. 实验方案：在记录稳定基线后，切换至20K + 氯化卡巴胆碱（Carbachol）溶液，等待反应达到峰值；再切换回20K浴液；随后施加20K + 乙醇溶液，等待其反应峰值；再切换回20K浴液；最后切换至20K + Ba²⁺溶液。在施加这些药物期间，可观察到GIRK电流幅度的变化（在-100 mV时最为显著）。在实验记录本中注明不同细胞外溶液施加时对应的扫描序号。单个Clampfit文件将包含整个实验的所有扫描记录。

5. 数据分析

我们使用 Clampfit 9.2 软件在 -100 mV 条件下分析 GIRK 电流数据。

1. 打开记录文件，将光标置于 -100 mV。默认情况下，屏幕上会叠加显示所有轨迹。点击“Write cursors”图标后，将生成类似 Excel 的电子表格，包含数值数据。
2. 将 X 轴指定为轨迹编号列，Y 轴指定为光标列，然后点击“Create Graph”图标，即可快速绘制实验的时间过程曲线图。
3. 通过从仅含外部灌流液记录的电流（“20K 电流”）中减去含 Ba²⁺ 时的电流，计算基础电流（“20K 电流”减去“20K + Ba²⁺ 电流”）。通过从 20K 条件下的基础电流中减去激活状态下的电流，计算诱导电流（“20K + 卡巴胆碱电流”减去“20K 电流”；“20K + 乙醇电流”减去“20K 电流”）。通过将电流除以膜电容（直接从放大器读取）计算电流密度（pA/pF）。通过将诱导电流除以基础电流再乘以 100，计算激活百分比。

6. 代表性结果

应能够记录转染了野生型通道的细胞中的电流。对于在含有20 mM K⁺的细胞外溶液（以及145 mM K⁺的细胞内溶液）中测量的GIRK通道，应表现出明显的内向整流特性，其反转电位约为-50 mV，这是钾通道的关键特性。施加卡巴胆碱后，野生型电流将显著增强（较基础电流增加3-5倍），并对100 mM乙醇产生类似反应。注意：电生理学中的符号约定为，内向电流为负，外向电流为正。对于GIRK2酒精结合口袋中的L257W突变，将观察到对卡巴胆碱和乙醇的反应均减弱。这表明L257参与了乙醇和G蛋白对GIRK2通道的激活过程。有关GIRK2突变实验结果的更多示例，请参见Aryal et al.¹的近期发表文献。

图1. Clampfit 8.0 界面显示野生型 GIRK2 记录的数据文件。 左上方面板显示在不同胞外 bah 溶液存在下，对斜坡电压方案所记录的叠加扫描曲线。光标1位于 -100 mV 处。光标数值被写入电子表格（右侧面板）。左下方面板显示扫描次数与电流的关系图。注意乙醇（EtOH）和卡巴胆碱（Carb）引起电流增加（向下偏转），而 Ba²⁺ 引起电流抑制。

图2. Clampfit 8.0 窗口显示突变型 GIRK2-L257W 的记录数据文件。 描述同图1。注意突变通道中卡巴胆碱（Carb）激活作用的丧失以及乙醇诱导电流的减弱。

讨论

定点突变是研究离子通道结构与功能关系的经典方法。该方法基于以下假设：通过改变离子通道中的关键残基，应能观察到通道功能的显著变化。相反，若在非关键位置引入突变，则通常不会对通道功能造成重大影响。通常，首先将目标残基突变为丙氨酸（一种小的非极性氨基酸），随后再突变为色氨酸（氨基酸中体积最大的一种）²。如果该残基对通道功能至关重要，则这两种突变均会改变通道活性；而若突变发生在较不重要的残基上，其效应（尤其是突变为丙氨酸）往往不明显。由于色氨酸体积较大，更容易因空间位阻效应而导致功能改变。当缺乏结构信息时，常可在通道的某一片段内系统性地进行丙氨酸或色氨酸突变（称为丙氨酸扫描或色氨酸扫描），以定位关键残基。值得注意的是，可同时平行构建多个含有不同点突变的克隆，从而在相对较短时间内检测多个残基的功能。近年来，多种离子通道的晶体结构已被解析^3,4,5，这些结构信息可用于预测潜在的关键残基，并通过本实验方案所述的方法加以验证。

对野生型通道的测量应始终与突变通道的测量同时进行，以作为阳性对照，确保转染和电生理实验操作正确。点突变可能导致无功能性电流产生、电流与野生型相似，或通道活性的调控发生改变。无法检测到电流可能是由于蛋白质折叠异常或转运改变所致。在此情况下，可通过生物素化实验或针对细胞外标签的免疫荧光染色（不进行细胞通透化处理），检测通道是否正确转运至细胞表面，从而区分位于细胞膜上的非功能性通道与滞留在细胞内的通道。最后，建议不仅研究通道的基础活性，还应探究突变对通道调控的影响。可根据所研究的离子通道类型，探讨不同的功能调节机制，包括G蛋白、PIP2、离子、ATP浓度、磷酸化（利用酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸突变）、泛素化或类泛素化修饰（利用赖氨酸突变）以及直接通道激动剂或阻断剂对通道功能的调节作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂	Sigma	Varies
质粒小量提取试剂盒	Qiagen	27104
放射性洗涤液（Radiacwash）	Biodex	005-100
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	BD Biosciences	CB40210	也可使用聚-L-赖氨酸
质粒大量提取试剂盒	Qiagen	12263
QuickChange XL II 定点突变试剂盒	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
盖玻片 ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
毛细玻璃管，硼硅酸盐，标准壁厚	Warner Instruments	G150-3
倒置荧光显微镜	Leica	DMI3000 B
电生理学	Nikon/ Leica/ Zeiss	任意配备荧光功能的倒置微分干涉差（DIC） （霍夫曼，Hoffmann） 显微镜
放大器	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B 放大器
灌流系统	Warner Instruments	VC-6 灌流系统 MM-6
数字转换器	Molecular Devices	Digidata 1320 数字转换器
显微操作器	Sutter Instruments	显微操作器：MP-85
电极拉制仪	Narishige	PC10 垂直电极拉制仪
隔振台	Technical Manufacturing Corporation	气浮台