评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX

Summary

微观分析γH2AX灶，形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂，已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们使用一种抗体，单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。

Abstract

早期的分子反应，DNA双链断裂（DSB的）磷酸化的SER - 139内的组蛋白^H2AX 1,2终端SQEY图案的残留。 H2AX的磷酸化介导的磷脂，inosito 3 -激酶（PI3K）的蛋白质家族，共济失调毛细血管扩张症（ATM）的突变，DNA -蛋白激酶催化亚基，ATM和相关RAD3（ATR）的^3。 H2AX的磷酸化形式，简称为γH2AX，蔓延到邻近地区的染色质的DSB网站，形成离散灶，很容易由³ immunofluorecence显微镜可视化。分析和定量γH2AX灶已被广泛用于评估DSB的形成和修复，特别是在电离辐射和评估各种修改化合物和细胞毒素化合物⁴辐射的功效， 。

鉴于这种双链断裂从头标志的精美的特异性和灵敏度，它在染色质中的DNA损伤和修复的过程提供新的见解。例如，在辐射生物学中心的范例是核DNA与放射敏感性的关键目标。事实上，在该领域的普遍共识在很大程度上被认为染色均匀的模板为DNA损伤与修复。然而，与γH2AX作为分子标记，DNA双链断裂，在γ射线照射，诱导γH2AX灶在常染色质和异染色质的形成悬殊的使用已^被观察到5-7。最近，我们使用的抗体面板，无论是单，双或三甲基化组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me1，H3K9me2，H3K9me3）后生印记构异染色质和转录沉默和赖氨酸4（H3K4me1，H3K4me2，H3K4me3 ），这是密切相关的积极抄写常染色质区域，调查γH2AX的空间分布， ^电离辐射8。按照当时的想法，关于染色质生物学，我们的研究结果表明γH2AX的形成和^活跃转录9之间的密切相关。在这里，我们展示了非贴壁细胞中γH2AX灶的检测和定量的免疫方法，特别注重与其他的表观遗传标记，图像分析和三维建模与合作本地化。

Protocol

细胞制备

1. 人红白血病K562细胞生长在10％（V / V）饱和湿度5％的CO ₂环境中的胎牛血清和20毫克/毫升的庆大霉素的RPMI - 1640补充介质在37 ° C。
2. 染色前约18小时，洗指数生长的细胞^{（5 ×} 10 5细胞/毫升是最优的）用磷酸盐缓冲液（PBS），悬浮在新媒体和返回到37 ° _C，5％的CO 2。
3. 两次用PBS离心洗涤细胞，在5分钟的转速约1500，并重新悬浮在新鲜的媒体。
4. 计数细胞并调整细胞密度约为5 × 10 ⁵细胞/ ml。

细胞可以算作一个自动化的方法（如过滤器的大小5至20微米之间的希森美康或库尔特计数器），或通过台盼蓝排除方法和血球。过量的细胞数（> 800细胞/厘米^2），可能会导致非均匀染色。

辐照和免疫荧光染色

1. cytospin剪辑，过滤器卡和幻灯片的组装与适当的标签。

当装配cytospin仪器，确保漏斗过滤卡孔重合。

2. 使细胞或γ-辐射或X射线（在这个例子中2Gy）。

为了防止在照射病灶的形成，为5至10分钟之前和期间照射细胞置于冰上。

以下照射细胞在37℃，5％的CO ₂所需的时间（峰γH2AX水平的30分钟至1小时，在这个例子中的1小时）。

3. 用冷PBS清洗细胞两次离心悬浮在新鲜PBS。
4. 在5分钟500转100到150μL的细胞悬液，免除到每个cytospin漏斗和自旋。
5. 从cytospins分隔的幻灯片，让细胞适度空气干燥约15分钟。

不要让细胞完全干燥细胞形态可能瓦解。

6. 周围的细胞具有疏水笔绘制一个圆。
7. 4％多聚甲醛在室温（RT）5分钟，修复细胞。

根据我们的经验，与多聚甲醛固定是优于乙醇或甲醇固定。悬浮细胞需要固定在室温下5分钟，而贴壁细胞的最佳固定需要较长的固定时间（15至20分钟）。

我们发现，染色立即产生更好的效果，比储存在-20 ° C，通常在高背景荧光固定的幻灯片。

8. 用PBS清洗细胞两次，每次5分钟。
9. 通透细胞，用0.1％TRITON - X的RT 100 5分钟。

吐温80相比，我们通常观察与Triton X - 100通透细胞更好的信号。根据细胞类型，它可能需要改变的permeabilisation时间。例如，在K562细胞在室温下5分钟的通透性是足够的，而在15分钟的贴壁细胞通透需要。

10. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
11. 座在室温为30分钟（3 × 10分钟）的1％BSA的细胞。

我们比较使用血清（二级抗体的同一品种产生）和牛血清白蛋白的PBS阻断效率。 BSA是在最大限度地减少非特异性二次抗体结合更有效率相比，血清。我们比较了不同的阻断时间，一夜之间堵在4 ° C相比，3 × 10分钟和3 × 20分钟的阻塞在室温下的步骤，并确定为3 × 10分钟的阻塞是最佳的。

12. 每张幻灯片添加50μL初级抗体（1:500 1％BSA稀释）。

孵育过夜抗体在室温为60分钟，结果减少背景染色的潜伏期比4 ° C。

13. 染色不同的标记，同时使用在不同的物种（如鼠抗γH2AX和兔抗在这个例子中的甲基化H3K4）提出的抗体。
14. 在室温为90分钟，在250 RPM摇摆平台上小学抗体孵育。

所有孵化加湿染色槽。

15. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
16. 加入50μL（1:1000稀释在1％BSA）二级抗体，以每张幻灯片。

染色同一张幻灯片上的不同标记，使用二次抗体与Different种属特异性（抗体）和荧光发射波长（如抗鼠Alexa的488（绿色）和抗兔Alexa的- 546（红色）在这个例子中）。

17. 在室温为60分钟，在250 RPM摇摆平台上培养的细胞。

建议在黑暗潮湿的会议厅，避免褪色和干燥的二级抗体孵育的细胞。

18. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
19. 每张幻灯片添加50μL（1:500 PBS稀释）TOPRO - 3。
20. 3X 5分钟，用PBS冲洗幻灯片。
21. 从幻灯片中删除多余的水分和添加防褪色的解决方案。

这是建议，没有完全晾干后方可加入防褪色的解决方案的细胞。

22. 盖玻片，指甲油密封和离开幻灯片在黑暗中过夜，在室温。

这是推荐使用的具体盖玻片焦＃1.5（0.16-19微米厚）和透明指甲油。

在幻灯片上放置盖玻片，应小心，以避免形成气泡。

图像采集

1. 蔡司LSM510元共聚焦显微镜是用来获取图像，使用标准GFP（绿色，488纳米），PI（红色543纳米）和远红光（蓝色633纳米）的激光。

图片收购，使用共聚焦显微镜，揭示了更好的空间分辨率。

由于γH2AX灶的大小可能会低于0.5μicrons，它是建议获得至少0.5μicron沿Z轴的步长大小的图像。

一个63 ×油浸物镜相比或高或低放大倍率是首选。对于成像许多灶计数细胞，最好是使用8个扫描速度和图像尺寸1024 × 1024像素。为了说明不同，它是建议使用2048 × 2048像素图像的大小为6扫描速度的核蛋白质的空间之间的关系。

当来自多个渠道的成像相比，一帧扫描线扫描收购建议。这就避免了漂白和更好的分辨率达到。顺序扫描是用来防止渠道之间的流血。

佛慈计数

图像分析和灶计数，可以使用各种套装软件（计有Metamorph，图像- J和Imaris）。这里描述灶使用Metamorph计数程序。

1. 无论是直接从文件菜单，或通过建立数堆栈选项打开γH2AX形象栈。
2. 转到进程"菜单，并选择堆栈算术。
3. 选择了最大的投影，选择要包含的飞机，并单击"确定"。
4. 保存作为γH2AXTIFF图像。文件，并打开TOPRO - 3（蓝色）的图像。
5. 进入的地区，选择一个区域的绘图工具画原子核周围的地区。
6. γH2AXTIFF图像处理菜单，并选择形态滤波器。
7. 选择顶帽子，并选择γH2AX图像作为源图像。
8. 应用自顶帽子过滤器和由此产生的图像将是一个二进制图像灶强度，低噪音和减少变异。

顶帽子值时，应注意选择。最优值，可以得到图像的视觉对比前后应用过滤器。

9. 前往处理菜单，并选择阈值图像。
10. 选择包容性阈值和选择较低和较高的阈值。

它通常是影响癌灶数目的阈值。因此，选择阈值时，需要十分重视。这可以最好地实现计数灶使用不同的阈值值在细胞暴露于γ辐射低于2 Gy的，然后比较与人工计数（眼），疫源地号码。最优阈值是一个最小化背景的包容性和最大限度地提高列入灶。

11. 选择TOPRO - 3的形象和地区菜单，并选择转移地区选项。选择TOPRPO - 3的源图像和顶帽子的目标，并单击确定。
12. 一旦核地区转移到了顶帽子的形象去测量菜单，并选择综合形态计量学分析。
13. 在弹出窗口中选择源图像顶帽子和按面积的措施。
14. 选择测量上衡量各地区，各获得所有相应的核顶帽子的形象灶数量。
15. 疫源地从每个区域的数字可以被导出到一个MS - Excel文件，使用日志数据的选项。

3D图像重建

要创建一个三维图像，从使用Metamorph栈:

1. 转到堆栈菜单选择三维重建。
2. 选择旋转的角度（如160 °，320 °）。
3. 选择类型最大的三维重建。
4. 选择旋转平面（水平或垂直）。
5. 选择的Z -校准距离。

最好是使用用户指定的Z轴的距离（最佳为0.5μicrons）。

6. 选择确定以创建一个三维重建。

线扫描分析

对于线扫描分析，使用Metamorph:

1. 打开一个单一的平面图像或堆放文件。
2. 转到测量工具栏"命令，选择线扫描分​​析。
3. 整个单元格中画一条线，这将自动显示每个标记的荧光强度和距离沿行的路径。

为了澄清各种染色标记的空间关系，例如，γH2AX灶和组蛋白甲基化，这是可取的画线，跨越地区，都是密集的差，在这些标记。

具有代表性的数据

对于这个演示的目的，我们利用抗体来γH2AX灶和H3K4me，双链断裂的空间分布来评价一个积极抄写常染色质的表观因素。如图1所示，与2Gy照射后γH2AX灶形成，主要为H3K4me染色和DNA染色TOPRO - 3（鲜艳染色的DNA区域指示异）沉闷的地区。

图1。γH2AX灶形式在常染色质主要在电离辐射。 （一）人红白血病K562细胞的免疫可视化γH2AX灶（绿色），1小时后，γ射线照射（2戈瑞）。 γH2AX灶有关H3K4me，代表积极抄写常染色质（红色）。 DNA标记TOPRO - 3（蓝色）。合并后的图像（蓝色，红色和绿色）演示了从排斥异色地区γH2AX灶。线扫描分析（荧光强度与距离）表示在一个平面上的标记相对分布。 （二）在不同的飞机从合并后的图像三维重建片上面所述。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
罗斯威尔公园纪念研究所 -1640 （RPMI-1640）	生长培养基	Invitrogen	22400071	RPMI-1640，pH 7.4 培养基，补充有 10% （v/v） 胎牛、2mM L-谷氨酰胺、20μg/ml 庆大霉素，20 mM （HEPES） N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸胎
牛血清 （FBS）		Sigma-Aldrich	F2442
牛血清白蛋白 （BSA）		Sigma-Aldrich	A7906	BSA （1%） 用于阻断任何非特异性抗体结合。一抗和二抗在 BSA 中稀释。
PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）		Invitrogen	17-517Q
台盼蓝		Sigma-Aldrich	T6146	用于区分活细胞和死细胞。
Triton X-100	试剂	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 （0.1%） 用于透化细胞。
多聚甲醛	试剂	Sigma-Aldrich	158127	用于固定细胞的多聚甲醛 （4%）。
小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白-H2AX 抗体	一抗	EMD Millipore	16193	一抗 （1：500） 在 1% BSA 中的稀释度。
组蛋白H3 （单甲基 K4）	一抗	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG （H+L）	二抗	Invitrogen	11029	二抗稀释液 （1：500），溶于 1% BSA 中。
Alexa Fluor 546 山羊抗兔 IgG （H+L）	二抗	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA 染料	Invitrogen	T3605	TOPRO3 是一种 Abs/Em 值为 642/661 nm 的 DNA 染料。如果共聚焦显微镜配备 405 nm 激光器，则可以使用 DAPI。
ProLong Gold	抗褪色溶液	Invitrogen	P36930	这种基于甘油的封固剂必须与与其折射率相匹配的油性镜片一起使用。
聚赖氨酸载玻片		Menzel-Glaser
盖玻片 （22x50mm）	盖玻片	Menzel-Glaser	CS2250100
组织培养瓶，通气盖	培养瓶	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific， Inc.
Cytofunnels		Shandon， Inc.
过滤卡		Shandon， Inc.
Coplin 染色罐，玻璃		Grale Scientific P/L	1771-OG
染色槽		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories， Inc.
Gammacell 1000 Elite 辐照	Gamma 辐照器	Nordion International Inc.
蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦	共聚焦显微镜			配备 3 个激光器：488 nm、543 nm 和 633 nm。
用于成像分析	Metamorph	Molecular Devices