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方法文章

电离辐射后γH2AX空间分布的评估

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DOI：

10.3791/2203

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2010年8月7日

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1Epigenetics in Human Health and Disease, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, 2Epigenomic Medicine, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, 3Department of Pathology, University of Melbourne

本文内容

摘要

在DNA双链断裂后，H2AX在Ser-139位点发生磷酸化，形成γH2AX焦点，其显微分析已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文中，我们采用针对赖氨酸4位单甲基化组蛋白H3的抗体作为活跃转录的常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导的γH2AX在细胞核内的空间分布。

摘要

DNA双链断裂（DSBs）发生后早期的分子响应之一，是组蛋白H2AX羧基末端SQEY基序中丝氨酸139位点（Ser-139）的磷酸化1,2。H2AX的这一磷酸化过程由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）家族蛋白介导，包括毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated, ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATM and RAD3-related, ATR）3。磷酸化的H2AX形式被称为γH2AX，可从DSB位点向邻近的染色质区域扩散，形成离散的焦点结构，可通过免疫荧光显微镜清晰观察到3。对γH2AX焦点的分析与定量已被广泛用于评估DSB的形成与修复，尤其在电离辐射暴露后，以及用于评价多种辐射修饰化合物和细胞毒性化合物的效果4。

鉴于这种新生的DNA双链断裂（DSB）标记物具有极高的特异性和灵敏度，它为染色质背景下DNA损伤与修复过程的研究提供了新的见解。例如，在辐射生物学中，核心范式认为细胞核内的DNA是决定辐射敏感性的关键靶标。事实上，该领域普遍共识长期以来将染色质视为DNA损伤与修复的均一模板。然而，利用γH2AX作为DSB的分子标记，已观察到γ射线诱导的γH2AX焦点在常染色质和异染色质之间形成存在差异5-7。最近，我们使用一系列特异性识别组蛋白H3在赖氨酸9位点单、二或三甲基化（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）的抗体，这些修饰是组成型异染色质和转录沉默的表观遗传印记；同时还使用识别赖氨酸4位点甲基化（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3）的抗体，这些修饰与活跃转录的常染色质区域密切相关，用以研究电离辐射后γH2AX的空间分布8。与当前染色质生物学的主流观点一致，我们的研究结果表明γH2AX的形成与活跃转录之间存在密切关联9。本文中，我们展示了在非贴壁细胞中检测和定量γH2AX焦点的免疫荧光方法，特别聚焦于其与其他表观遗传标记的共定位分析、图像分析以及三维建模。

方案

细胞准备

  1. 人红白血病 K562 细胞在添加了 10% (v/v) 胎牛血清和 20 mg/ml 庆大霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
  2. 在染色前约 18 小时，将处于对数生长期的细胞（最佳密度为 5 × 105 个细胞/ml）用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，重悬于新鲜培养基中，并放回 37°C、5% CO2 环境中。
  3. 用 PBS 以约 1500 rpm 离心 5 分钟洗涤细胞两次，并重悬于新鲜培养基中。
  4. 计数细胞，并将细胞密度调整至约 5 × 105 个细胞/ml。

可通过自动化方法（例如使用孔径为5至20微米的Sysmex或Coulter计数仪）或使用台盼蓝排染法结合血细胞计数板进行细胞计数。 过量的细胞（>800 个细胞/cm²2可能导致染色不均。

照射与免疫荧光染色

  1. 组装细胞离心涂片夹、滤纸卡和载玻片，并进行适当的标记。

组装细胞离心装置时，应确保滤纸卡上的孔与漏斗对齐。

  1. 将细胞暴露于γ射线或X射线照射下（本示例中为2 Gy）。

为防止照射过程中形成焦点，在照射前和照射期间将细胞置于冰上 5 到 10 分钟。

照射后，将细胞在37°C、5% CO2条件下孵育所需时间（γH2AX水平峰值通常在30分钟至1小时之间；本示例中为1小时）。

  1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，离心后重悬于新鲜PBS中。
  2. 取100至150 μL细胞悬液加入每个细胞离心涂片装置的漏斗中，以500 rpm离心5分钟。
  3. 将载玻片从细胞离心涂片装置中取出，让细胞在空气中适度干燥约15分钟。

切勿让细胞完全干燥，以免细胞形态发生解体。

  1. 用疏水性笔在细胞周围画一个圆圈。
  2. 在室温（RT）下用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。

根据我们的经验，使用多聚甲醛固定优于使用乙醇或甲醇固定。悬浮细胞在室温下固定5分钟即可，而贴壁细胞则需要更长的固定时间（15至20分钟）才能达到最佳固定效果。

我们发现，染色后立即观察比将固定后的切片在-20°C下保存效果更好，后者通常会导致较高的背景荧光。

  1. 用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
  2. 用 0.1% Triton-X 100 在室温下对细胞进行通透处理，持续 5 分钟。

与Tween-80相比，我们通常在使用Triton-X 100进行细胞通透处理的细胞中观察到更好的信号。根据细胞类型的不同，可能需要调整通透处理的时间。例如，在K562细胞中，室温下通透5分钟已足够，而在贴壁细胞中则需要15分钟的通透处理。

  1. 用 PBS 清洗细胞三次，每次 5 分钟。
  2. 在室温下用 1% BSA 封闭细胞 30 分钟（每次 10 分钟，共 3 次）。

我们比较了使用血清（来源于与二抗相同的物种）和PBS中的牛血清白蛋白进行封闭的效果。与血清相比，BSA在减少二抗的非特异性结合方面更为有效。我们还比较了不同的封闭时间，包括在4°C过夜封闭，以及在室温下分别进行3次10分钟和3次20分钟的封闭步骤，结果确定室温下3次10分钟的封闭为最佳方案。

  1. 向每张切片加入 50 μL 一抗（用 1% BSA 按 1:500 稀释）。

室温下与一抗孵育60分钟，与4°C过夜孵育相比，可降低背景染色。

  1. 要同时染色不同的标记物，请使用来自不同物种的抗体（例如，本实验中使用小鼠抗-γH2AX和兔抗-甲基化H3K4）。
  2. 在室温下，于摇床上以250 rpm孵育一抗90分钟。

所有孵育步骤均在加湿的染色槽中进行。

  1. 用 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  2. 向每张玻片加入 50 μL（用 1% BSA 按 1:1000 稀释）的二抗。

在同一张切片上对不同标记物进行染色时，应使用针对不同物种（根据一抗来源）且具有不同荧光发射波长的二抗（例如，本实验中使用抗小鼠Alexa 488（绿色）和抗兔Alexa-546（红色））。

  1. 将细胞在室温下于250 rpm的摇床上孵育60分钟。

建议将细胞置于避光湿润的孵育盒中孵育，以避免二抗褪色和干燥。

  1. 用 PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，共清洗三次。
  2. 向每张载玻片上加入 50 μL TOPRO-3（用 PBS 按 1:500 稀释）。
  3. 用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗三次。
  4. 去除载玻片上多余的液体，然后加入抗荧光淬灭剂。

建议在加入抗荧光淬灭剂溶液之前，不要将细胞完全干燥。

  1. 盖上盖玻片，用指甲油封片，于室温避光处静置过夜。

建议使用共聚焦显微镜专用的1.5号盖玻片（厚度为0.16–0.19微米）和透明指甲油。

放置盖玻片时应小心操作，避免产生气泡。

图像采集

  1. 使用蔡司 LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准的 GFP（绿色，488 nm）、PI（红色，543 nm）和远红（蓝色，633 nm）激光获取图像。

使用共聚焦显微镜获取的图像展现出更优的空间分辨率。

由于γH2AX焦点的尺寸可能小于 0.5 μicrons，建议至少以以下参数获取图像 0.5 μicroZ轴方向的步进尺寸。

与更高或更低放大倍数的物镜相比，优先选用63倍油镜物镜。 对于大量细胞的焦点计数成像，建议使用扫描速度为8、图像尺寸为1024 × 1024像素的设置。为了清晰展示不同核蛋白之间的空间关系，推荐使用扫描速度为6、图像尺寸为2048 × 2048像素的设置。

进行多通道成像时，建议采用线扫描采集模式，而非帧扫描。该方法可避免荧光淬灭，并获得更高的分辨率。采用逐通道扫描以防止通道间的信号串扰。

焦点计数

可以使用多种软件包进行图像分析和焦点计数（包括 Metamorph、Image-J 和 Imaris）。此处描述的是使用 Metamorph 进行焦点计数的步骤。

  1. 直接通过文件菜单打开 γH2AX 图像堆栈，或使用构建编号堆栈选项打开。
  2. 转到“处理”菜单并选择“堆栈运算”。
  3. 选择“最大投影”，并选择要包含的层面，然后点击确定。
  4. 将生成的图像保存为 γH2AX Tiff 文件，并打开 TOPRO-3（蓝色）图像。
  5. 转到“区域”并选择一个区域绘制工具，在细胞核周围绘制区域。
  6. 点击 γH2AX Tiff 图像，转到“处理”菜单并选择“形态学滤波器”。
  7. 选择“Top-Hat”，并将 γH2AX 图像选为源图像。
  8. 应用 Top-Hat 滤波器，生成的图像将是一幅噪声较少、焦点强度变异降低的二值图像。

选择Top-Hat值时应谨慎。可通过在应用滤波器前后对图像进行视觉比较，以获得最佳参数值。

  1. 转到处理菜单并选择阈值图像。
  2. 选择包含性阈值，并设定下限和上限阈值。

通常是阈值影响着焦点数量。因此，在选择阈值时必须格外谨慎。最佳方法是：对接受低于 2 Gy γ 辐照的细胞，使用不同的阈值进行焦点计数，然后将计数结果与人工计数（目测）结果进行比较。最优阈值应能最大限度地排除背景干扰，同时最大限度地包含真实的焦点。

  1. 选择 TOPRO-3 图像，进入区域菜单并选择“转移区域”选项。将源图像设为 TOPRO-3，目标图像设为 Top-Hat，然后点击确定。
  2. 当核区域被转移至 Top-Hat 图像后，进入测量菜单并选择“整合形态学分析”。
  3. 在弹出窗口中选择源图像为 Top-Hat，并按面积进行测量。
  4. 选择“测量所有区域”，然后点击“测量”，以获取 Top-Hat 图像中所有对应细胞核内的焦点数量。
  5. 可通过使用日志数据选项，将各区域的焦点数量导出至 MS-Excel 文件中。

图像的三维重建

使用 Metamorph 从图像序列创建三维图像：

  1. 进入堆栈菜单并选择三维重建。
  2. 选择旋转角度（例如 160°, 320°）。
  3. 选择三维重建类型——最大值投影。
  4. 选择旋转平面（水平或垂直）。
  5. 选择 Z 轴校准距离。

建议使用用户指定的Z轴距离（最佳为0.5 μm）。

  1. 单击“确定”以创建三维重建。

线扫描分析

使用 Metamorph 进行线扫描分析：

  1. 打开单平面图像或堆叠文件。
  2. 进入测量工具栏命令，选择线扫描分析。
  3. 在细胞上画一条线，系统将自动显示沿线每种标记物的荧光强度和距离。

为了阐明不同染色质标记物（例如，γH2AX 焦点与组蛋白甲基化）之间的空间关系，最好绘制穿过这些标记物富集区和贫乏区的线条。

代表性数据

本实验中，我们使用了针对γH2AX焦点以及H3K4me的抗体，以评估DNA双链断裂（DSB）在活跃转录的常染色质表观遗传标志物中的空间分布情况。如图1所示，在2 Gy照射后，γH2AX焦点主要形成于H3K4me染色和DNA染料TOPRO-3染色均较弱的区域（染色较强的DNA区域提示为异染色质）。

显示细胞蛋白分布、发射光谱和分析图的荧光显微镜图像。
图1. γH2AX灶点主要在常染色质中响应电离辐射而形成。（A）人红白血病K562细胞在γ射线照射（2 Gy）后1小时的γH2AX灶点（绿色）免疫荧光图像。γH2AX灶点与代表活跃转录的常染色质的H3K4me（红色）进行对比显示。DNA用TOPRO-3染色（蓝色）。合并图像（蓝色、红色和绿色）显示γH2AX灶点被排除在异染色质区域之外。线扫描分析（荧光强度与距离的关系）表明了各标记物在单一平面上的相对分布。（B）上述合并图像三维重建后在不同平面上的切片。

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致谢

感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。本研究由生物医学成像开发有限公司合作研究中心（CRC）资助，该中心根据澳大利亚政府合作研究中心（CRC）计划建立并获得支持。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）以及生物医学成像 CRC 补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）对本研究提供了 invaluable 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
罗斯威尔公园纪念研究所-1640（RPMI-1640）培养基Invitrogen22400071RPMI-1640，pH 7.4 的培养基，添加 10%（v/v）胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、20μg/ml 硫酸庆大霉素、20 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF2442
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7906使用 1% BSA 封闭非特异性抗体结合位点。一抗和二抗均用 1% BSA 进行稀释。
PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）Invitrogen17-517Q
台盼蓝Sigma-AldrichT6146用于区分活细胞与死细胞。
Triton X-100试剂Sigma-AldrichT8787使用 0.1% Triton X-100 对细胞进行透化处理。
多聚甲醛试剂Sigma-Aldrich158127使用 4% 多聚甲醛固定细胞。
小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白-H2AX 抗体一抗EMD Millipore16193一抗稀释比例为 1:500，溶于 1% BSA 中。
组蛋白 H3（单甲基化 K4）一抗AbcamAB8895
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗Invitrogen11029二抗稀释比例为 1:500，溶于 1% BSA 中。
Alexa Fluor 546 山羊抗兔 IgG（H+L）二抗Invitrogen11035
TOPRO3DNA 染料InvitrogenT3605TOPRO3 是一种 DNA 荧光染料，其吸收波长/发射波长为 642/661 nm。若共聚焦显微镜配备 405 nm 激光器，也可使用 DAPI。
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930该甘油基封片剂必须与折射率匹配的油镜配合使用。
多聚赖氨酸载玻片Menzel-Glaser
盖玻片（22×50 mm）盖玻片Menzel-GlaserCS2250100
组织培养瓶，带通气盖培养瓶BD Biosciences353112
Shandon Cytospin 4Thermo Fisher Scientific, Inc.
CytofunnelsShandon, Inc.
滤纸卡Shandon, Inc.353025
玻璃 Coplin 染色缸Grale Scientific P/L1771-OG
染色槽Grale Scientific P/LV1991.99
PAP 笔Zymed Laboratories, Inc.008877
Gammacell 1000 Elite 放射源γ射线辐照仪Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦显微镜共聚焦显微镜配备三种激光器：488 nm、543 nm 和 633 nm。
Metamorph成像分析软件Molecular Devices

参考文献

  1. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  2. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  3. Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
  4. Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
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  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. liakis, G, Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
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