我们将演示使用机器人以及手动结合赛默飞世尔科技Matrix多通道移液器进行前体miRNA 96孔板QPCR的设置与分析。
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方法文章
使用定量实时PCR（qPCR）阵列对pre-microRNA和microRNA进行表达谱分析
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
定量实时聚合酶链式反应（qPCR）已成为分析基因表达水平的一种准确且有价值的工具。相较于其他基因表达谱分析方法，其诸多优势之一在于检测灵敏度更高，且每次实验所需的起始样本量更少。自动化qPCR体系构建技术的发展进一步提升了该方法的可重复性。其操作便捷、快速的特点支持高通量实验，可在单次实验中同时检测大量不同基因的表达情况。结合内置于反应板中的对照，该方法还能有效减少其他技术中常见的实验变量。
我们近期开发了一种基于186对引物的qPCR检测方法，用于前体微小RNA（pre-miRNA）的表达谱分析。微小RNA（miRNA）是一类新型的小分子非编码RNA，能够在转录后水平调控多种mRNA靶标。这类小RNA首先由RNA聚合酶II转录生成初级miRNA（pri-miRNA）转录本，随后被剪切为前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA被转运至细胞质后，由Dicer酶切割发夹结构环区，生成成熟的miRNA。在pre-miRNA和成熟miRNA两个阶段均可观察到miRNA水平的变化，因此对这两种形式的表达谱分析均具有重要意义。目前市场上已有多种针对成熟miRNA的商业化检测试剂盒，但其高昂的成本可能限制研究人员对该技术的应用。本文介绍一种经济高效、可靠稳定的基于SYBR染料的qPCR方法，用于pre-miRNA的表达谱分析。pre-miRNA水平的变化通常能反映成熟miRNA的变化趋势，因而可作为成熟miRNA表达的有效指标。然而，同时检测pre-miRNA和成熟miRNA可能是更优策略，因其可提供互补信息，并有助于揭示miRNA的加工过程。此外，本文所述技术还可拓展应用于其他特定通路或病原体相关基因文库的表达谱分析。
方案
qPCR 前体 miRNA 谱型分析阵列可通过 Tecan Freedom Evo 机器人（A）实现完全自动化操作，或使用 Matrix 电子多通道移液器（B）手动完成。
1) 准备主混合液、引物板和样品。
- 含有186对引物的引物板（共2块，96孔板格式），浓度为0.5 pM，应保存在-80°C。使用前于室温下解冻，涡旋混匀并短暂离心。
- 配制预混液时，将SYBR Green 2× PCR Mix在室温下解冻。每反应使用8 µL预混液和2 µL引物。每反应预混液的组成为：4 µL SYBR Mix、3 µL PCR级水以及10–20 ng的样品DNA或cDNA。
- 每块96孔引物板的实验设置需要四个预混液管。每个板可运行4个样品（单次重复）、2个样品（双重复）或单个样品（四重复）。
- 在4个2 mL Eppendorf离心管中分别加入SYBR Mix、水和样品，配制预混液。每管应包含约100个反应所需的预混液量，以预留移液损耗的余量。涡旋混匀。
A. 使用 Freedom Tecan Evo 机器人建立前体 miRNA 检测体系。
- 启动机器人并加载 Evoware 程序后，用 30 ml 溶液冲洗系统三次，以清除可能影响移液准确性的气泡。
- 设置机器人平台，包括以下组件：
- 已标记的 384 孔板
- 96 孔引物板（1）
- 预混液（Master mixes）
- 含有 2% 次氯酸钠的槽
- 装满系统液体的容器
- 空废液容器
- 通过连续两次点击“运行”（Run）开始自动机器人运行程序。
- 程序结束后，取出 384 孔板，用 LightCycler 480 密封箔密封，并短暂离心。将密封后的 384 孔板放入热循环仪（hotel）1 号位置。
- 返回步骤 2.2，使用新的预混液和新的 384 孔板对引物板 2 重复操作。
- 将密封好的板放入热循环仪（hotel）2 号位置。
- 打开新的 Evoware 程序，用于从热循环仪（hotel）加载 LightCycler，并连续两次点击“运行”（Run）。
- Freedom Evo 将自动将每块板加载到 LightCycler 中，并运行以下 SYBR Green I/HRM 扩增与熔解曲线程序：
预变性（1 个循环）：
50°C，5 分钟，升降温速率为 4.8°C/秒
95°C，5 分钟，升降温速率为 4.8°C/秒
扩增（45 个循环）：
95°C，15 秒，升降温速率为 4.8°C/秒
62°C，30 秒，升降温速率为 2.5°C/秒
（此步骤期间进行单次数据采集）
熔解曲线分析：
95°C，5 秒，升降温速率为 4.8°C/秒
60°C，1 分钟，升降温速率为 2.5°C/秒
95°C 持续升温，升降温速率为 0.11°C/秒
每升高 1°C 采集 5 次数据
冷却：
50°C，30 秒，升降温速率为 25°C/秒
- Freedom Evo 将自动将每块板加载到 LightCycler 中，并运行以下 SYBR Green I/HRM 扩增与熔解曲线程序：
B. 使用 Matrix 电子多通道移液器设置前体 miRNA 检测：
- 将主混合液管1中的内容物放入储液槽中。
- 将电子移液器设置为吸取16 μl主混合液，采用2–8 μl的分液步进，随后执行排空步骤。
- 对于主混合液1，将8 μl加入384孔板的每隔一列孔中（设置为384孔板加样头间距），起始于A1孔（即A1、C1、E1等孔）。第二次加入8 μl时，移至第3列（即A3、C3、E3等孔），然后在废液容器上方排空并丢弃加样头。
- 按照此模式继续进行剩余的5个循环，直至到达A23孔。
- 对主混合液2重复上述操作（从A2、C2、E2等孔开始）；主混合液3（从B1、D1、F1等孔开始）；主混合液4（从B2、D2、F2等孔开始）。
- 分装引物板时，将电子移液器设置为吸取2 μl并分配2 μl，随后执行吹出步骤。从96孔引物板第1列（A–H）中吸取2 μl引物，加入384孔板的A1、C1、E1等孔中。在废液容器上方吹出残液并丢弃吸头。依次对A2、C2、E2；B1、D1、F1；以及B2、D2、F2等孔重复上述操作。
- 对96孔引物板的第2至第12行重复上述操作，每个引物列之间间隔2列，直至完成整个384孔板的分装。
- 使用 LightCycler 密封膜封板，并短暂离心。
- 将培养板放入 LightCycler 480 仪器中，并按照以下设置使用 SYBR Green I/HRM 检测模式进行扩增循环：
预变性（1个循环）：
50° 5 分钟，升降温速率为 4.8°/sec
95° 以斜率速率在5分钟内 4.8°/sec
Amp（45个循环）：
95° 15 秒，升降温速率为 4.8°/秒
62° 30 秒，升降温速率为 2.5°/秒
（此步骤中仅进行一次数据采集）
熔解曲线：
95° 5 秒，升降温速率为 4.8°/sec
60° 1 分钟，升降温速率为 2.5°/sec
95° 以 0.11 的斜坡速率持续进行°/sec
每次采集5次 °C
冷却：
50° 30 秒，升降温速率为 25°/秒 - 使用引物板2重复操作，用新配制的预混液将样品分装至新的384孔板中。
成功的秘诀：
设计PCR阵列时的一个重要特征是，所有186对引物具有相同的退火温度，因此整块板可在相同的最佳PCR程序条件下运行。
每次运行样本前，应使用三种对照对每个新阵列进行检测。这些对照包括：
1 次所有引物与水或 0.1x TE 一同运行，以排除引物污染。
1 次交替使用水/TE 和阳性对照运行，以确保无交叉残留。
3 次使用相同的阳性对照进行运行，以确保不同运行之间的可重复性。
主混合液应新鲜配制，且反应板应在 24 小时内完成运行，以获得最佳结果。
去除引物板上的铝箔封膜时应缓慢操作，以降低孔间污染的风险。
当使用带有固定吸头的机器人时，每次移液步骤之间必须用 2% 漂白剂清洗吸头，随后用水冲洗。此步骤可防止并消除交叉残留，避免数据污染并导致结果不明确。
反应板在 Lightcycler 上运行后，不应在 PCR 准备室内再次打开。这有助于防止 PCR 污染。
代表性结果：
qPCR 结果通常由 Lightcycler 分析软件确定的 CT 值表示。一次成功的运行通常会得到样品的一系列 CT 值，阳性样品的 CT 值通常在 20–35 之间。在一次良好的运行中，水样始终具有 CT 值 >40，且CT值超过37的任何样本或特定孔均视为阴性或未检出。通常情况下，样本产生的CT值 <10 也被视为不可靠，因此被排除在进一步分析之外。qPCR 数据有多种分析方法，而本实验中内参对照的引入有助于控制样品加样量的差异。pre-miR 芯片包含 U6 对照引物，该引物常被用作参考基因，以对不同样品的 CT 值进行标准化。该标准化后的值称为 delta CT 值（dCT）。结果通常以原始 CT 值、dCT 值形式绘图，或可进一步分析转化为标准化数值。
图1展示了时间过程实验中四个不同样本的全长前体microRNA阵列的热图分析结果。每个前体microRNA的相对表达水平均被显示，并出现了三个主要的显著聚类。大多数被分析的前体miRNA如预期一样仅发生微小且无显著意义的变化（图1A）。然而，有少量前体microRNA在整个时间过程中显著下调（图1B）或显著上调（图1C）。每个前体microRNA的表达水平均以0小时时间点（样本1）作为基线进行标准化。在某些情况下，您可能会注意到一些聚类的前体microRNA在热图分析中也共同聚集（例如：let-7a，图1B）。根据实验条件的不同，可能出现依赖病毒感染、细胞类型特异性表达的前体microRNA聚类，或受同一分子或信号通路调控的前体miRNA聚类。
我们开发的前体微小RNA（pre-microRNA）检测方法除了包含人类前体miRNA（pre-miRs）外，还包含多种已知的病毒前体微小RNA，以及卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）编码的基因。这些序列可作为阳性或阴性对照，具体取决于所用细胞系及样本的病毒感染状态。图2展示了在KSHV阴性样本中进行四次重复实验所得的平均CT值。重要的是，通过高灵敏度的qPCR芯片检测，该样本中未检测到KSHV LANA。然而，作为内参的U6以及高表达的人类前体微小RNA let-7a均在可检测水平表达。最后，如预期所示，以PCR级水作为阴性对照未扩增出qPCR产物。
qPCR 实验成功的另一个指标是良好的熔解曲线分析，该分析可提示样品中是否存在潜在污染。为了确定熔解温度，PCR 完成后会缓慢加热反应板。随着 DNA 双链的解离，SYBR Green 染料被释放，荧光信号随之下降。该信号下降所对应的温度被绘制成图，即为样品的熔解温度。根据 DNA 序列的不同，各样品之间的熔解温度各不相同，且与水阴性对照的熔解温度也不同；由于阴性对照中不含 DNA，因此不应出现熔解峰。每对引物扩增的 PCR 产物应在相似的温度下熔解。例如，图 3 展示了使用同一样品（双重复）的两对不同引物的熔解曲线分析结果。显然，两对引物的熔解温度不同，但每对引物的重复样品熔解温度完全一致。异常或可能被污染的样品可能表现出多个熔解峰，提示存在两种或以上不同的模板来源。
图 1. 通过基于新型 qPCR 芯片的表达谱分析，揭示前体 microRNA 的表达特征。计算平均 deltaCTU6 值，并将标准化数据导入 ArrayMinerTM 软件，得到三个不同的聚类，以热图形式展示。(A) 显示表达量变化较小的前体 microRNA；表达水平显著降低 (B) 或升高 (C) 的前体 microRNA 也分别列出。蓝色表示表达水平较低，红色表示表达水平升高。
图2. 基于qPCR的pre-microRNA芯片中内参对照的设置。图中显示了3个不同基因及无模板对照的原始CT值。U6作为内参阳性对照，PCR H2O作为阴性对照。let-7a-1-1是一种在多种细胞类型中通常表达的microRNA，而KSHV LANA可根据所用细胞系或组织的病毒感染状态，用作阳性或阴性对照。
图3. 前体miRNA引物的熔解峰分析及无样本污染的验证。熔解曲线通过LightCycler软件中的Tm识别分析获得。同一标本使用两种不同的引物（引物A和引物B）进行双重复运行的结果如图所示。每种引物具有不同的熔解温度，但每个样本仅出现单一峰，表明无样本污染。
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讨论
qPCR 是一种高灵敏度的检测方法，可用于比较研究中各样本间的基因表达水平，也可用于检测病毒的阳性情况。使用 qPCR 芯片的优势在于能够在短时间内对每个样本运行大量引物（在本例中为 186 对引物）。通过使用如 Tecan Freedom Evo 等移液机器人，可进一步缩短实验准备时间，且机器人的高准确性和一致性能够减少甚至消除移液误差。本文演示了如何使用 Tecan Freedom Evo 设置 microRNA 芯片实验，同时也介绍了一种替代方法——使用 Matrix 电子多通道移液器，适用于不具备移液机器人条件的实验室。此外，qPCR 芯片还具有另一优势：所有基因均可使用在同一块板上运行的一组参考基因进行标准化，从而降低反应次数和实验成本。
如前所述，在设计此类阵列时，有几个关键特征是必需的。由于PCR板上的所有样本将在相同的条件下运行，因此设计在相同温度和设置下发挥作用的引物至关重要，否则某些引物对将无法工作。在设计引物时，应始终通过BLAST搜索检查序列，以确保其与目标基因具有同源性，并且不与其他基因发生交叉。
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DE018304、R01DE018281。K.T. 受 T32 GM07092-34 项目资助，并获得霍华德·休斯医学研究所（HHMI）通过“医学融入研究生教育计划”（Med into Grad Initiative）向北卡罗来纳大学教堂山分校提供的资助。PC 受 T32 CA009156 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix 电子多通道移液器 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | （或任何性能相当的 Thermo Scientific 多通道移液器，能够移取上述体积） |
| Matrix 完整性滤芯吸头，无菌 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | （或与所用多通道移液器匹配的相当规格吸头） |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 预混液 | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 仪器 II 型 | Roche Group | 05015243001 | 384 孔板版本 |
| Lightcycler 480 384 孔白色多孔板 | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 密封箔膜 | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 多孔板分析软件 | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase 去污染剂 | Decon Laboratories | 04-355-31 |
参考文献
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
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