我们将演示使用机器人以及手动结合赛默飞世尔科技Matrix多通道移液器进行前体miRNA 96孔板QPCR的设置与分析。
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方法文章
使用定量实时PCR（qPCR）阵列对pre-microRNA和microRNA进行表达谱分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
定量实时聚合酶链式反应（qPCR）已成为分析基因表达水平的一种准确且有价值的工具。相较于其他基因表达谱分析方法，其诸多优势之一在于检测灵敏度更高，且每次实验所需的起始样本量更少。自动化qPCR体系构建技术的发展进一步提升了该方法的可重复性。其操作便捷、快速的特点支持高通量实验，可在单次实验中同时检测大量不同基因的表达情况。结合内置于反应板中的对照，该方法还能有效减少其他技术中常见的实验变量。
我们近期开发了一种基于186对引物的qPCR检测方法，用于前体微小RNA（pre-miRNA）的表达谱分析。微小RNA（miRNA）是一类新型的小分子非编码RNA，能够在转录后水平调控多种mRNA靶标。这类小RNA首先由RNA聚合酶II转录生成初级miRNA（pri-miRNA）转录本，随后被剪切为前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA被转运至细胞质后，由Dicer酶切割发夹结构环区，生成成熟的miRNA。在pre-miRNA和成熟miRNA两个阶段均可观察到miRNA水平的变化，因此对这两种形式的表达谱分析均具有重要意义。目前市场上已有多种针对成熟miRNA的商业化检测试剂盒，但其高昂的成本可能限制研究人员对该技术的应用。本文介绍一种经济高效、可靠稳定的基于SYBR染料的qPCR方法，用于pre-miRNA的表达谱分析。pre-miRNA水平的变化通常能反映成熟miRNA的变化趋势，因而可作为成熟miRNA表达的有效指标。然而，同时检测pre-miRNA和成熟miRNA可能是更优策略，因其可提供互补信息，并有助于揭示miRNA的加工过程。此外，本文所述技术还可拓展应用于其他特定通路或病原体相关基因文库的表达谱分析。
方案
qPCR 前体 miRNA 谱型分析阵列可通过 Tecan Freedom Evo 机器人（A）实现完全自动化操作，或使用 Matrix 电子多通道移液器（B）手动完成。
1) 准备主混合液、引物板和样品。
- 含有186对引物的引物板（共2块，96孔板格式），浓度为0.5 pM，应保存在-80°C。使用前于室温下解冻，涡旋混匀并短暂离心。
- 配制预混液时，将SYBR Green 2× PCR Mix在室温下解冻。每反应使用8 µL预混液和2 µL引物。每反应预混液的组成为：4 µL SYBR Mix、3 µL PCR级水以及10–20 ng的样品DNA或cDNA。
- 每块96孔引物板的实验设置需要四个预混液管。每个板可运行4个样品（单次重复）、2个样品（双重复）或单个样品（四重复）。
- 在4个2 mL Eppendorf离心管中分别加入SYBR Mix、水和样品，配制预混液。每管应包含约100个反应所需的预混液量，以预留移液损耗的余量。涡旋混匀。
A. 使用 Freedom Tecan Evo 机器人建立前体 miRNA 检测体系。
- 启动机器人并加载 Evoware 程序后，用 30 ml 溶液冲洗系统三次，以清除可能影响移液准确性的气泡。
- 设置机器人平台，包括以下组件：
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讨论
qPCR 是一种高灵敏度的检测方法，可用于比较研究中各样本间的基因表达水平，也可用于检测病毒的阳性情况。使用 qPCR 芯片的优势在于能够在短时间内对每个样本运行大量引物（在本例中为 186 对引物）。通过使用如 Tecan Freedom Evo 等移液机器人，可进一步缩短实验准备时间，且机器人的高准确性和一致性能够减少甚至消除移液误差。本文演示了如何使用 Tecan Freedom Evo 设置 microRNA 芯片实验，同时也介绍了一种替代方法——使用 Matrix 电子多通道移液器，适用于不具备移液机器人条件的实验室。此外，qPCR 芯片还具有另一优势：所有基因均可使用在同一块板上运行的一组参考基因进行标准化，从而降低反应次数和实验成本。
如前所述，在设计此类阵列时，有几个关键特征是必需的。由于PCR板上的所有样本将在相同的条件下运行，因此设计在相同温度和设置下发挥作用的引物至关重要，否则某些引物对将无法工作。在设计引物时，应始终通过BLAST搜索检查序列，以确保其与目标基因具有同源性，并且不与其他基因发生交叉。
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DE018304、R01DE018281。K.T. 受 T32 GM07092-34 项目资助，并获得霍华德·休斯医学研究所（HHMI）通过“医学融入研究生教育计划”（Med into Grad Initiative）向北卡罗来纳大学教堂山分校提供的资助。PC 受 T32 CA009156 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix 电子多通道移液器 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | （或任何性能相当的 Thermo Scientific 多通道移液器，能够移取上述体积） |
| Matrix 完整性滤芯吸头，无菌 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | （或与所用多通道移液器匹配的相当规格吸头） |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 预混液 | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 仪器 II 型 | Roche Group | 05015243001 | 384 孔板版本 |
| Lightcycler 480 384 孔白色多孔板 | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 密封箔膜 | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 多孔板分析软件 | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase 去污染剂 | Decon Laboratories | 04-355-31 |
参考文献
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated....
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