我们提供了一种详细的方案，用于制备从Drosophila胚胎中分离的原代细胞。结合有效的RNAi干扰技术以及其他分子、生物化学和细胞成像方法，可在Drosophila原代细胞中研究多种科学问题。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种从Drosophila原肠胚胚胎中分离并培养原代细胞的方法。简言之，从年轻健康的果蝇中收集大量处于特定发育阶段的胚胎，经消毒后，使用玻璃匀浆器将胚胎物理性地解离为单细胞悬液。将细胞以适当的密度接种于培养板或腔室载玻片中的培养基中后，这些细胞可进一步分化为多种形态上 distinct 的细胞类型，并可通过其特异性细胞标志物进行鉴定。此外，我们还提供了使用双链RNA（dsRNA）处理这些细胞以实现基因敲低的实验条件。在Drosophila原代细胞中高效实现RNA干扰，仅需将细胞置于含有dsRNA的培养基中孵育即可。结合其他分子生物学、生物化学及细胞成像分析手段，该有效的RNAi干扰技术将有助于在Drosophila原代细胞中回答多种科学问题，尤其是与已分化的肌肉细胞和神经元细胞相关的问题。
方案
1. 果蝇培养笼的准备
- 培养 果蝇 （如 Oregon-R 或任何基因型的野生型品系）置于 32 盎司昆虫饲养杯等方便的容器中。
- 将新羽化的果蝇转移至大型胚胎收集笼或果蝇群体饲养笼中。
- 将笼子移至温度约为 ~ 的房间25 °C 在12小时光照与12小时黑暗循环、相对湿度约65%的条件下饲养，以利于获取同步发育的胚胎。
- 用涂有灭活酵母糊的糖蜜平板喂养笼中的果蝇，并保持果蝇的饲养。每天更换一次糖蜜平板（含灭活酵母糊），持续2-3天。
2. 同步胚胎的收集
- 在原代细胞制备当天，用涂有灭活酵母糊的新鲜培养板喂养果蝇，进行1-2小时的预产卵期。
- 在12小时黑暗周期开始前，将预产卵板更换为涂有少量酵母糊的新鲜糖蜜板。弃去预产卵阶段收集的样品，因其含有不同步的较老胚胎。
- 收集1-2小时的胚胎。
- 取出含有相对同步化胚胎群体的培养板，于25°C下保存5-6小时。此时胚胎将处于晚期原肠胚阶段。
3. 胚胎的收集与洗涤
- 用湿润的画笔将胚胎从培养皿上轻轻松动，并通过一组叠放的筛子用微温的自来水彻底冲洗，使胚胎收集在底部最细的筛网中。冲洗数分钟，尽可能去除酵母和果蝇碎片。
- 倾斜筛子，使胚胎聚集于一侧，然后轻轻将胚胎从筛网上冲洗至去壳篮中。
- 转移至组织培养超净台区域，注意避免胚胎干燥。
4. 胚胎匀浆及细胞接种
- 将胚胎浸入50%（体积比）的次氯酸钠溶液中5-10分钟，以进行消毒和去壳膜。用70%（体积比）乙醇将胚胎从篮壁上冲洗下来。或者，在乙醇处理前，先用蒸馏水将次氯酸钠溶液从胚胎上彻底清洗掉。自此步骤起，所有胚胎操作均应在无菌条件下并在组织培养罩内进行。
- 用高压灭菌的蒸馏水彻底冲洗胚胎，以去除残留的次氯酸钠和/或乙醇。
- 在去壳膜过程中，根据胚胎数量，向Dounce匀浆器中加入适量室温M3培养基。胚胎体积与培养基体积的比例不应超过0.5 ml胚胎：40 ml培养基（或约100-200个胚胎/ml）。
- 将冲洗后的胚胎放入无菌烧杯中，加入足量M3培养基以完全浸没胚胎。让胚胎浸泡2-5分钟。
- 拆开去壳膜篮，用无菌纸巾将Nitex筛网吸干。
- 用无菌毛笔将胚胎转移至匀浆器中。
- 使用松动的研杵以短行程轻轻匀浆，研杵不要触碰到管底，直至所有胚胎悬浮；随后，再以轻柔但有力的方式上下匀浆8个完整行程。研杵上下移动时不得旋转。
- 通过倾倒或移液方式将匀浆液转移至无菌的50 ml锥形离心管中，并盖紧管盖。
- 在室温下以40×g离心10分钟，使组织碎片、大细胞团块和卵黄膜沉淀。将含有细胞和卵黄的上清液转移至洁净离心管中，并重复离心5分钟。
- 小心地通过倾倒或移液将上清液转移至另一洁净离心管中，在室温下以360×g离心10分钟以沉淀细胞。弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 ml培养基中（RNAi实验使用无血清培养基）。
- 使用血细胞计数板计数活细胞，以估算细胞密度。同时，重复步骤4.10以沉淀细胞。
- 将细胞重悬至所需浓度。初始建议尝试1~5×106 个细胞/ml的范围，并以1.7至2.5×105 个细胞/cm2 的密度接种。
5. 针对在384孔板中培养的原代细胞的RNAi实验
- 在384孔板的每个孔中加入5 μl dsRNA，终浓度约为每孔250 ng。
- 使用多通道移液器，在含有不同dsRNA的384孔板中，每孔加入10 ml血清-free M3培养基的原代细胞悬液（细胞密度为1~4×10⁶ 个细胞/ml）。或者，可将细胞培养于8孔玻璃腔室载玻片上，用于共聚焦成像。
- 将培养板在室温下以300×g离心1分钟，随后在25°C无血清培养基中培养22小时，或在18°C培养1~2天。
- 向每孔中加入30 ml含血清的培养基。
- 将培养板在室温下以300×g离心1分钟。
- 将培养板置于湿化培养盒中，在25°C继续培养原代细胞5~7天。
- 对细胞进行活体成像或免疫荧光染色后成像。
6. 代表性结果：
在最佳条件下，培养中的细胞形态呈圆形，状态健康。初次接种后，培养物中的细胞碎片较少，融合度达到50%~80%。这些细胞在长期培养后会发生形态学变化。在25°C条件下，细胞通常需要约5至8天才能完全分化。原代培养的质量通常根据目标细胞在培养中分化程度的好坏来判断。例如，原代肌细胞常呈现分支状形态，并发育为含有由一系列肌节组成的条纹状肌原纤维的多核肌管。完全分化的肌管在培养中通常会自发运动。相比之下，分化的原代神经元则以其胞体形成细胞簇，并通过轴突纤维与其他细胞簇相连接。
图1. 原代细胞在接种至培养体系后发生形态学变化
（A）原代细胞刚接种至384孔板中的一个孔后拍摄的明场图像。大多数细胞呈圆形、完整且彼此分离良好。（B）接种后20小时的原代细胞培养明场图像。此时原代细胞已形成细胞簇（大箭头）并可识别出具有分支状形态的肌样结构（长箭头）。（C）接种后5天的原代培养相差图像。此时培养物发育更为成熟，可见神经突起（小箭头）、神经细胞簇（大箭头）和肌样结构（中等长度箭头）。
图2. 在384孔板中培养并用dsRNA处理的原代细胞示例
原代细胞分离自携带Dmef2-Gal4、D42-Gal4和UAS-mito-GFP转基因的胚胎，其中Dmef2-Gal4和D42-Gal4分别驱动肌肉和运动神经元中mito-GFP的表达。这些细胞经靶向lacZ（A-C）或inflated（if）（D-F）的dsRNA处理。在图像中可见表达GFP的原代肌肉细胞和神经元（A, C, D, F）。白色箭头指示神经元突起。鬼笔环肽对肌动蛋白的染色（箭头）显示，经lacZ dsRNA处理的培养物中呈现分支状的肌肉结构（B和C），而经if dsRNA处理的培养物中则呈现圆形收缩的肌肉形态（E和F）。在合并图像（C, F）中，肌肉呈黄色，而红色阴性信号显示神经元及其突起（白色箭头）。
图3. 在人源玻连蛋白包被的盖玻片上培养的原代肌肉细胞的共聚焦显微图像
原代肌肉细胞经免疫荧光染色，使用抗Drosophila Titin（KZ）抗体（合并图中呈红色）和标记肌动蛋白的鬼笔环肽（合并图中呈绿色）。上方图板为野生型对照肌肉，下方图板为sals(CG31374) RNAi肌肉，其肌节缩短。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
Drosophila 细胞原代培养的发育模式可能存在很大差异，这可能是由于原代细胞制备过程中存在多种变量所致。首先，用于产卵的果蝇应选择年轻的（一周龄以内）且健康的个体（无病毒或细菌感染）。必须避免使用未受精或受感染的胚胎，因为这些胚胎无用，且从中获得的细胞无法分化，仅能存活1-2天。其次，在匀浆过程中，应注意不要将过多胚胎加入匀浆器中。若匀浆器中胚胎过多，会导致碎片量增加以及死细胞数量上升，最终影响细胞的分化能力。最后，细胞接种时应保持适当的密度，以确保原代细胞的良好分化。我们发现，若原代细胞初始接种密度过高，神经元和肌细胞的分化均会显著降低。
在进行表型分析时，通常使用384孔板培养原代细胞，以便在较低放大倍数下进行筛选或成像分析。若需获得更高放大倍数和更佳分辨率的图像，可将细胞培养在盖玻片式腔室载片上，随后使用共聚焦显微镜对活细胞或染色后的细胞进行成像。由于大多数原代细胞为贴壁细胞，因此在估算每孔所需的细胞数量和培养基体积时，应以腔室载片孔内可用于细胞生长的面积作为参考依据。此外，盖玻片式腔室载片可包被细胞外基质（ECM）蛋白，如人源纤连蛋白（vitron...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
J.B. 由 Damon Runyon 癌症研究基金会资助，资助编号为 DRG-1716-02。J.Z. 由美国国立卫生研究院（NIH）/国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，资助编号为 F32 GM082174-02。N.P. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Shields 和 Sang M3 培养基 | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| 胎牛血清 | JRH 生物科学 | 12103-500M | |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| 大型胚胎收集笼 | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-454 | |
| #45 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-462 | |
| #120 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce 组织研磨器，Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce 组织研磨器，Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce 组织研磨器，Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar 384 孔板 | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II 带腔室盖玻片 | Fisher Scientific | 171080 |
参考文献
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
