我们提供了一种详细的方案，用于制备从Drosophila胚胎中分离的原代细胞。结合有效的RNAi干扰技术以及其他分子、生物化学和细胞成像方法，可在Drosophila原代细胞中研究多种科学问题。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种从Drosophila原肠胚胚胎中分离并培养原代细胞的方法。简言之，从年轻健康的果蝇中收集大量处于特定发育阶段的胚胎，经消毒后，使用玻璃匀浆器将胚胎物理性地解离为单细胞悬液。将细胞以适当的密度接种于培养板或腔室载玻片中的培养基中后，这些细胞可进一步分化为多种形态上 distinct 的细胞类型，并可通过其特异性细胞标志物进行鉴定。此外，我们还提供了使用双链RNA（dsRNA）处理这些细胞以实现基因敲低的实验条件。在Drosophila原代细胞中高效实现RNA干扰，仅需将细胞置于含有dsRNA的培养基中孵育即可。结合其他分子生物学、生物化学及细胞成像分析手段，该有效的RNAi干扰技术将有助于在Drosophila原代细胞中回答多种科学问题，尤其是与已分化的肌肉细胞和神经元细胞相关的问题。
方案
1. 果蝇培养笼的准备
- 培养 果蝇 （如 Oregon-R 或任何基因型的野生型品系）置于 32 盎司昆虫饲养杯等方便的容器中。
- 将新羽化的果蝇转移至大型胚胎收集笼或果蝇群体饲养笼中。
- 将笼子移至温度约为 ~ 的房间25 °C 在12小时光照与12小时黑暗循环、相对湿度约65%的条件下饲养，以利于获取同步发育的胚胎。
- 用涂有灭活酵母糊的糖蜜平板喂养笼中的果蝇，并保持果蝇的饲养。每天更换一次糖蜜平板（含灭活酵母糊），持续2-3天。
2. 同步胚胎的收集
- 在原代细胞制备当天，用涂有灭活酵母糊的新鲜培养板喂养果蝇，进行1-2小时的预产卵期。
- 在12小时黑暗周期开始前，将预产卵板更换为涂有少量酵母糊的新鲜糖蜜板。弃去预产卵阶段收集的样品，因其含有不同步的较老胚胎。
- 收集1-2小时的胚胎。
- 取出含有相对同步化胚胎群体的培养板，于25°C下保存5-6小时。此时胚胎将处于晚期原肠胚阶段。
3. 胚胎的收集与洗涤
- 用湿润的画笔将胚胎从培养皿上轻轻松动，并通过一组叠放的筛子用微温的自来水彻底冲洗，使胚胎收集在底部最细的筛网中。冲洗数分钟，尽可能去除酵母和果蝇碎片。
- 倾斜筛子，使胚胎聚集于一侧，然后轻轻将胚....
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讨论
Drosophila 细胞原代培养的发育模式可能存在很大差异，这可能是由于原代细胞制备过程中存在多种变量所致。首先，用于产卵的果蝇应选择年轻的（一周龄以内）且健康的个体（无病毒或细菌感染）。必须避免使用未受精或受感染的胚胎，因为这些胚胎无用，且从中获得的细胞无法分化，仅能存活1-2天。其次，在匀浆过程中，应注意不要将过多胚胎加入匀浆器中。若匀浆器中胚胎过多，会导致碎片量增加以及死细胞数量上升，最终影响细胞的分化能力。最后，细胞接种时应保持适当的密度，以确保原代细胞的良好分化。我们发现，若原代细胞初始接种密度过高，神经元和肌细胞的分化均会显著降低。
在进行表型分析时，通常使用384孔板培养原代细胞，以便在较低放大倍数下进行筛选或成像分析。若需获得更高放大倍数和更佳分辨率的图像，可将细胞培养在盖玻片式腔室载片上，随后使用共聚焦显微镜对活细胞或染色后的细胞进行成像。由于大多数原代细胞为贴壁细胞，因此在估算每孔所需的细胞数量和培养基体积时，应以腔室载片孔内可用于细胞生长的面积作为参考依据。此外，盖玻片式腔室载片可包被细胞外基质（ECM）蛋白，如人源纤连蛋白（vitron.......
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致谢
J.B. 由 Damon Runyon 癌症研究基金会资助，资助编号为 DRG-1716-02。J.Z. 由美国国立卫生研究院（NIH）/国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，资助编号为 F32 GM082174-02。N.P. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Shields 和 Sang M3 培养基 | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| 胎牛血清 | JRH 生物科学 | 12103-500M | |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| 大型胚胎收集笼 | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-454 | |
| #45 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-462 | |
| #120 美国标准试验筛 | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce 组织研磨器，Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce 组织研磨器，Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce 组织研磨器，Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar 384 孔板 | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II 带腔室盖玻片 | Fisher Scientific | 171080 |
参考文献
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elong....
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重印与许可
