视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。视网膜神经节细胞（RGCs）的轴突被完全横断（轴突切断术）后，90%的细胞在轴突切断术后14天内死亡。该模型易于进行实验操作，且具有高度可重复性。
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摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGCs）是一类中枢神经系统神经元，通过视神经将视觉信息从视网膜传递至大脑。 视神经可在眼球眶内被暴露并完全横断（轴突切断），从而切断整个RGC群体的轴突。视神经横断是成年中枢神经系统中神经元凋亡性死亡的一个可重复模型1-4。该模型特别具有吸引力，因为眼球的玻璃体腔可作为向视网膜递送药物的天然胶囊，允许通过眼内注射进行实验干预。化学物质通过玻璃体液扩散，可作用于全部RGC群体。此外，可通过将小干扰RNA（siRNAs）、质粒或病毒载体施加于视神经切断端5-7，或将载体注射至其靶区——上丘8，实现对RGC的选择性转染。这使得研究人员能够在目标神经元群体中研究凋亡机制，而不会对其他旁观神经元或周围胶质细胞产生干扰效应。另一个优势在于损伤后细胞存活率的量化操作简便且准确。视网膜是一种扁平的层状组织，RGC位于最内层，即神经节细胞层。可在轴突切断时将荧光示踪剂（3% Fluorogold）施加于视神经切断端，或在轴突切断前一周将示踪剂注射至上丘（RGC靶区），示踪剂经逆行运输，标记全部RGC群体。由于神经节细胞层为单层结构（单细胞厚度），可在平铺的视网膜组织上直接定量RGC密度，无需采用体视学方法。视神经横断后14天内，约90%的受损RGC会发生凋亡性死亡9-11。RGC凋亡具有特征性的时间进程：轴突切断后3-4天内细胞死亡被延迟，随后细胞迅速退变。这一时间窗口为针对凋亡相关通路的实验干预提供了机会。
方案
1. 手术技术
- 实验应采用无菌技术进行，并遵循您所在机构的动物使用规程。与活体组织接触的仪器和材料（溶液、测试物质、示踪剂、针头等）必须保持无菌，以防止感染，避免对动物福利造成不良影响，并防止对研究结果产生潜在的负面影响。
2. 麻醉
- 使用兽用异氟烷蒸发器系统对大鼠进行麻醉。以0.8 L/min的流速使用医用级氧气汽化异氟烷气体。将动物放入连接的麻醉箱中，并将异氟烷浓度设定为4%，直至动物呼吸减慢并进入镇静状态。
- 随后，将气体通路切换至立体定位仪的气体面罩装置，并将动物固定于立体定位装置中。将异氟烷浓度下调至2%，并持续监测麻醉状态。体型较大的动物（>300 g）可能需要更高的异氟烷浓度。手术过程中应持续监测麻醉深度，并根据情况调整异氟烷剂量。需持续评估呼吸的深度与频率，并每隔5分钟进行足趾夹捏测试，以确认无深部疼痛反应。
- 手术完成后，关闭异氟烷，让动物在从立体定位装置中移出前吸入氧气数分钟。手术期间应通过覆盖手术毯和/或使用温控加热毯维持动物体温。
3. 手术入路
- 用70%乙醇润湿头部顶部的毛发，以便于剪切。使用剪刀或锋利的剪刀去除两眼之间的毛发。用碘伏消毒液（如Proviodine、Betadine等）和70%乙醇交替擦拭切口区域，共清洁三....
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讨论
该手术操作有多种变异方式，本方案中的某些步骤并非必需。实际上，只需牵开覆盖视神经的肌肉即可暴露神经。然而，这种方法会在神经周围形成非常有限的操作空间，使横断过程的关键最终阶段变得更加困难。在某些情况下，需要转染视神经残端的细胞，此时通过牵开所有眼外肌和泪腺来获得更大的操作空间将更为有利。
该方案中最关键的步骤是步骤 4.3–4.6。操作过程中必须避免损伤视神经头部周围的血管系统。为避免损伤眼动脉，应于眼球后方 1.5–2.0 mm 处横断视神经，因为眼动脉在距眼球 1 mm 以内处穿入视神经，并为视网膜内层供血。因此，保持距眼球后方一定距离的操作空间，即可避免对眼动脉造成损伤。正常情况下，视网膜呈透明状，血管结构清晰可辨。若视网膜血液供应受损，视网膜将发生退变，呈现乳白色絮状外观。同时，眼球的玻璃体腔和晶状体通常也会变得混浊，并随时间推移出现眼球缩小。
熟练操作后，一旦完成初始切口，整个手术过程的各个步骤均可在每只眼睛10至15分钟内完成。该手术也可采用眶部外侧入路进行，两种入路均可根据研究人员的偏好灵活调整操作步骤。该模型具.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
PDK 由加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（MOP 86523）支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体定位仪 | Stoelting Co. | ||
| 大鼠用气体麻醉面罩 | Stoelting Co. | ||
| 麻醉系统 | VetEquip | 901806 | |
| 异氟烷（PrAErrane） | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| 手术显微镜 | WPI, Zeiss, Leica | ||
| 氟金（羟基联苯胺双甲磺酸盐，Fluorogold） | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| 明胶海绵（Gelfoam） | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| 人工泪液 PM（Tears Naturale P.M.） | Alcon | ||
| 聚维酮碘（Proviodine） | Medline Industries | MDS093945H | |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 精细尖头杜蒙持针钳 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 显微外科钩 | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| 眼部敷料齿状镊 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| 杜蒙#7b号锐利弯齿状镊 | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| 电凝器 | Fine Science Tools | 18010-00 |
参考文献
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular deter....
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