视神经横断：中枢神经系统中成年神经元凋亡的模型

摘要

视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。视网膜神经节细胞（RGCs）的轴突被完全横断（轴突切断术）后，90%的细胞在轴突切断术后14天内死亡。该模型易于进行实验操作，且具有高度可重复性。

摘要

视网膜神经节细胞（RGCs）是一类中枢神经系统神经元，通过视神经将视觉信息从视网膜传递至大脑。 视神经可在眼球眶内被暴露并完全横断（轴突切断），从而切断整个RGC群体的轴突。视神经横断是成年中枢神经系统中神经元凋亡性死亡的一个可重复模型^1-4。该模型特别具有吸引力，因为眼球的玻璃体腔可作为向视网膜递送药物的天然胶囊，允许通过眼内注射进行实验干预。化学物质通过玻璃体液扩散，可作用于全部RGC群体。此外，可通过将小干扰RNA（siRNAs）、质粒或病毒载体施加于视神经切断端^5-7，或将载体注射至其靶区——上丘⁸，实现对RGC的选择性转染。这使得研究人员能够在目标神经元群体中研究凋亡机制，而不会对其他旁观神经元或周围胶质细胞产生干扰效应。另一个优势在于损伤后细胞存活率的量化操作简便且准确。视网膜是一种扁平的层状组织，RGC位于最内层，即神经节细胞层。可在轴突切断时将荧光示踪剂（3% Fluorogold）施加于视神经切断端，或在轴突切断前一周将示踪剂注射至上丘（RGC靶区），示踪剂经逆行运输，标记全部RGC群体。由于神经节细胞层为单层结构（单细胞厚度），可在平铺的视网膜组织上直接定量RGC密度，无需采用体视学方法。视神经横断后14天内，约90%的受损RGC会发生凋亡性死亡^9-11。RGC凋亡具有特征性的时间进程：轴突切断后3-4天内细胞死亡被延迟，随后细胞迅速退变。这一时间窗口为针对凋亡相关通路的实验干预提供了机会。

方案

1. 手术技术

1. 实验应采用无菌技术进行，并遵循您所在机构的动物使用规程。与活体组织接触的仪器和材料（溶液、测试物质、示踪剂、针头等）必须保持无菌，以防止感染，避免对动物福利造成不良影响，并防止对研究结果产生潜在的负面影响。

2. 麻醉

1. 使用兽用异氟烷蒸发器系统对大鼠进行麻醉。以0.8 L/min的流速使用医用级氧气汽化异氟烷气体。将动物放入连接的麻醉箱中，并将异氟烷浓度设定为4%，直至动物呼吸减慢并进入镇静状态。
2. 随后，将气体通路切换至立体定位仪的气体面罩装置，并将动物固定于立体定位装置中。将异氟烷浓度下调至2%，并持续监测麻醉状态。体型较大的动物（>300 g）可能需要更高的异氟烷浓度。手术过程中应持续监测麻醉深度，并根据情况调整异氟烷剂量。需持续评估呼吸的深度与频率，并每隔5分钟进行足趾夹捏测试，以确认无深部疼痛反应。
3. 手术完成后，关闭异氟烷，让动物在从立体定位装置中移出前吸入氧气数分钟。手术期间应通过覆盖手术毯和/或使用温控加热毯维持动物体温。

3. 手术入路

1. 用70%乙醇润湿头部顶部的毛发，以便于剪切。使用剪刀或锋利的剪刀去除两眼之间的毛发。用碘伏消毒液（如Proviodine、Betadine等）和70%乙醇交替擦拭切口区域，共清洁三次。在整个手术过程中，通过将眼用眼膏（Tears Naturale P.M.）涂抹于角膜上，保持角膜湿润。通过手动开合眼睑，将眼膏均匀涂抹在角膜表面。
2. 使用11号刀片，从眼睛前方约0.5 cm处开始，沿头部中线向后至眼睛后方1 cm处做一纵向切口。用镊子将覆盖在眼睛上的皮肤瓣提起，并用手术刀背轻轻剥离其下方的结缔组织。然后将皮肤瓣向侧方和下方牵拉，并用手术牵开器固定，可将牵开器用胶带固定在立体定位仪底座上。
3. 用锐利镊子牵拉覆盖在眶骨上方的筋膜，同时沿眶骨上缘做切口。这将使覆盖在眼球眶部的筋膜被拉开。可通过用镊子向下按压眶部上方的筋膜，清晰地辨认眶骨上缘的边界。使用电凝设备或手术刀，继续将切口向后延伸至眼眶的后界。以眶上骨作为切口的引导。随后，再将切口向前延伸至眼眶的前界。建议使用小型电凝设备完成眶上部的切开，以防止损伤与静脉窦相通的下方血管而引起出血。
4. 若发生出血，可采取以下多个步骤处理。首先，使用无菌外科棉签或棉签施加压力。若出血持续，用滴管将冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）滴加至出血区域，并持续加压。轻微出血通常在数秒内即可停止。若出血仍持续，使用外科棉签或棉签对组织施加牵引，以确定出血点，并迅速电凝受损血管。止血后，使用冷的无菌PBS清洗手术区域的血液。应定期以该方式清洁手术区域，以便更清晰地观察眼眶内的结构。
5. 切口清洁后，使用镊子和手术刀背清除覆盖在眼球后部眶内容物上的结缔组织。11号手术刀的刀背效果良好，因其尖端较细。此操作可暴露眶腔更深层区域，提供更大的手术操作窗口。操作眼部时建议使用Dumont #7b尖端弯曲带齿镊，其弯曲形状和精细尖端非常适合于眼眶内结构的操作，且带齿设计有助于牢固抓持组织。
6. 接下来，清除位于中线附近的三叉神经眼支周围的结缔组织，并用镊子将其移除。此步骤并非必需，但移除该神经可为后续视神经的操作提供更大的通路窗口。
7. 在神经移除后，用镊子将下方血管牵开并完全电凝。此步骤亦非必需，但电凝该血管可使其向前移动，从而在到达视神经时获得更大的操作空间。
8. 使用尖锐镊子，或镊尖已向内弯曲的镊子，小心挑起并去除覆盖在眼外肌和泪腺上的薄层结缔组织。从眼眶前部向后部方向牵拉眼外肌。用一对镊子夹住肌肉近端，再用另一对弯曲带齿的眼科敷料镊对肌肉施加向外的牵引力。牵引时应确保敷料镊的方向与肌肉走向一致，以防撕裂。以该方式移除眼眶最前部的肌肉（上斜肌）。该肌肉将从眶深部被游离，剩余部分可被牵拉，以使眼球向外旋转。
9. 对位于泪腺叶与哈氏腺之间、靠近眼球背侧表面中线处的下一条肌肉（内直肌）重复步骤3.8的操作。将牵开器用胶带固定，以维持对肌肉的牵引。
10. 轻轻清除覆盖在泪腺表面的任何残留结缔组织，并用镊子将腺体向上提起。切勿压迫或挤压腺体。为牵拉腺体，仅需电凝其后极的一条血管。先将腺体后端向上提起，然后电凝该血管。
11. 随后，将泪腺向前翻转，以打开眼眶后部，使视神经上方的肌肉获得无障碍通路。持续使用无菌PBS保持术区湿润，并用外科棉签或棉签吸干多余液体。
12. 再次使用尖锐镊子，清除围绕眼眶后部肌肉（上睑提肌和上直肌）的薄层结缔组织，并分离其下方的肌束。使用弯曲带齿的眼科敷料镊单独或同步牵拉这些肌肉，牵引方向应与肌纤维走向一致。将剩余的肌肉段与步骤3.8和3.9中已牵拉的肌肉一同固定于牵开器上，并用胶带固定牵开器以维持牵引。此时共有4条肌肉连接至牵开器。此举将使眼球向前并向外旋转，从而暴露包裹视神经的含脂肪鞘膜。

4. 视神经的暴露

1. 使用尖头镊子（精细尖头Dumont镊）向上牵拉包裹视神经脂肪鞘的结缔组织。用小型Vannas弹簧剪进行纵向剪开，必要时扩大切口。切开后，鞘内脂肪将开始向外隆起。随后，从边缘小心向上牵拉，剪除新月形的结缔组织瓣。
2. 用镊子夹住覆盖在视神经上的脂肪，同时用Vannas弹簧剪将其剪除。使用无菌PBS和外科棉签清理组织去除过程中产生的少量血液，保持操作区域清洁。
3. 此时视神经已可见。为暴露神经，需去除包绕神经的脑膜鞘，但不得损伤供应视网膜内层的眼动脉。用镊子轻轻旋转脑膜鞘，观察其血管分布模式，寻找无血管区域，以便在脑膜鞘上做纵向切口。
4. 用精细尖头Dumont镊夹住硬脑膜并向上牵拉。在形成的三角形硬脑膜楔形基底部附近，用Vannas弹簧剪在鞘上做一小切口。将剪刀的下刃插入切口，沿视神经走行方向平行剪开鞘膜，注意避免横向剪切损伤血管。用镊子和剪刀将硬脑膜向视神经两侧翻开。
5. 神经表面仅剩蛛网膜覆盖，该膜极薄且透明。为判断膜是否仍存在，可用尖头镊轻夹神经表面。若蛛网膜存在，则夹住该膜并向上牵拉，形成三角形组织楔。用剪刀尖端做一小切口，操作类似于步骤4.4。随后将剪刀下刃插入并沿蛛网膜纵向剪开。接着，用剪刀和镊子将蛛网膜向视神经两侧翻开。
6. 使用显微外科钩将视神经从脑膜鞘中抬起。将钩尖绕至神经外缘，确保钩始终与神经接触，避免钩住脑膜并意外将其横断。轻柔地将视神经从脑膜鞘中提起，并在钩支撑点后方完全横断神经。横断后的视神经残端将获得一个游离端，便于取出手术钩。
7. 若需对RGCs进行逆行标记以定量分析其存活情况，可在横断的视神经残端上放置一小块浸有3% Fluorogold（或其他逆行示踪剂）的明胶海绵（参见 JoVE方案2261）。

5. 关闭与恢复

1. 解除眼外肌的牵引力，将眼球恢复至中立位置。操作时需确保将明胶海绵推入眼眶内，以便在眼球复位过程中，明胶海绵始终包裹视神经残端。将泪腺和眼外肌复位至其自然解剖位置。
2. 将皮肤瓣复位至中线并缝合伤口。对双眼涂抹眼科眼膏。随后关闭异氟烷气源，让动物吸入纯氧数分钟。将动物置于加热笼内或置于加热灯下的笼中进行恢复。恢复期间笼内不得放置垫料，以避免动物在恢复过程中误吸垫料。
3. 术后动物应单独饲养。术后镇痛药物的使用应遵循所在机构动物护理管理部门的指导原则，并在术后对动物进行密切观察。

6. 代表性结果：

视神经横断会导致90%的受损视网膜神经节细胞（RGCs）在轴突切断后14天内死亡^9-11。RGC死亡的主要机制是凋亡^{9, 12}。正常情况下，RGC的密度约为2500个细胞/mm²。轴突切断后，可通过落射荧光或共聚焦成像观察逆行标记的RGCs。RGC的凋亡在轴突切断后大约延迟4天发生，从而为实验干预提供了时间窗口。在轴突切断并使用Fluorogold进行逆行标记后的第1天，对视网膜平铺标本进行成像时，可清晰观察到视网膜节细胞层中的RGC胞体以及视网膜神经纤维层中的轴突束（图1a）。至轴突切断后14天，大多数RGC已死亡，仅存的少量RGC散在分布于视网膜小胶质细胞之间（图1b）。当RGC发生凋亡时，小胶质细胞会吞噬这些死亡细胞，从而通过跨细胞方式被原本用于标记RGCs的荧光示踪剂所标记^{13, 14}。示踪剂在小胶质细胞吞噬体中的表现与在存活RGCs中的表现不同：小胶质细胞的胞质中含有高度浓缩、极为明亮且相对较大的吞噬体，呈弥散分布（图1c）；而RGCs的染色模式更为弥散，胞质内充满由轴突逆行运输而来的小点状囊泡。这些囊泡体积更小，荧光强度较弱，因此可用于区分存活的RGCs与小胶质细胞。此外，小胶质细胞的胞体明显较小，形态多呈星形或阿米巴样，而RGCs则具有相对较大且呈圆形的胞体。在定量细胞存活率时，RGCs的树突结构也有助于将其与小胶质细胞短而亮的突起区分开来。细胞存活率可在视网膜的不同区域进行量化，并根据相应显微照片的面积推算出细胞密度（细胞/mm²），因为RGCs位于节细胞层的单层结构中。

图1. 视神经切断后，在视神经残端施加示踪剂标记荧光金标记的视网膜神经节细胞（RGCs）的落射荧光显微图像。(A) 轴突切断后1天，RGCs及其轴突束以细小点状方式被示踪剂标记。(B) 轴突切断后14天，90%的RGCs已经死亡，吞噬了死亡细胞的明亮标记的小胶质细胞也被示踪剂标记。(C) 高倍放大图像，显示轴突切断后14天RGCs与小胶质细胞（红色箭头）之间的差异。A和B中的比例尺为50 μm，C中的比例尺为25 μm。

讨论

该手术操作有多种变异方式，本方案中的某些步骤并非必需。实际上，只需牵开覆盖视神经的肌肉即可暴露神经。然而，这种方法会在神经周围形成非常有限的操作空间，使横断过程的关键最终阶段变得更加困难。在某些情况下，需要转染视神经残端的细胞，此时通过牵开所有眼外肌和泪腺来获得更大的操作空间将更为有利。

该方案中最关键的步骤是步骤 4.3–4.6。操作过程中必须避免损伤视神经头部周围的血管系统。为避免损伤眼动脉，应于眼球后方 1.5–2.0 mm 处横断视神经，因为眼动脉在距眼球 1 mm 以内处穿入视神经，并为视网膜内层供血。因此，保持距眼球后方一定距离的操作空间，即可避免对眼动脉造成损伤。正常情况下，视网膜呈透明状，血管结构清晰可辨。若视网膜血液供应受损，视网膜将发生退变，呈现乳白色絮状外观。同时，眼球的玻璃体腔和晶状体通常也会变得混浊，并随时间推移出现眼球缩小。

熟练操作后，一旦完成初始切口，整个手术过程的各个步骤均可在每只眼睛10至15分钟内完成。该手术也可采用眶部外侧入路进行，两种入路均可根据研究人员的偏好灵活调整操作步骤。该模型具...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪	Stoelting Co.
大鼠用气体麻醉面罩	Stoelting Co.
麻醉系统	VetEquip	901806
异氟烷（PrAErrane）	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
手术显微镜	WPI, Zeiss, Leica
氟金（羟基联苯胺双甲磺酸盐，Fluorogold）	Sigma-Aldrich	39286
明胶海绵（Gelfoam）	Pharmacia Corporation (Pfizer)
人工泪液 PM（Tears Naturale P.M.）	Alcon
聚维酮碘（Proviodine）	Medline Industries	MDS093945H
万纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	15000-00
精细尖头杜蒙持针钳	Fine Science Tools	11252-00
显微外科钩	Fine Science Tools	10062-12
眼部敷料齿状镊	Fine Science Tools	11152-10
杜蒙#7b号锐利弯齿状镊	Fine Science Tools	11270-20
电凝器	Fine Science Tools	18010-00