高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

摘要

在许多生物学和临床情境中，研究细胞过程在其天然微环境中的动态演变具有显著优势。本文介绍了低成本光纤显微镜的组装及其应用，该显微镜可实现实时成像，适用于细胞培养、动物实验以及临床患者研究。

摘要

许多生物学和临床研究需要在细胞水平分辨率下对形态和功能进行纵向观察与分析。传统上，这些研究通过平行开展多个实验实现，即在不同时间点依次取出单独的样本，利用光学显微镜进行评估。目前已开发出多种活体成像技术，其中共聚焦显微镜、多光子显微镜和二次谐波显微镜均已证明可用于此类成像研究。 原位 ¹然而，这些系统所需的基础设施复杂且昂贵，涉及扫描激光系统和复杂的光源。本文介绍一种高分辨率显微内窥镜的设计与组装方案，该设备可在一天内使用市售组件以低于5,000美元的成本完成构建。该平台在图像分辨率、视场范围和工作波长方面具有灵活性，我们描述了如何轻松调整这些参数以满足终端用户的特定需求。

我们及其他研究者已探索了高分辨率显微内镜（HRME）在 体外 细胞培养 ^2-5，离体 ⁶ 活体动物组织 ^2,5，以及在人体组织中 体内 ^2,7用户已报告使用多种不同的荧光对比剂，包括原黄素 ^2-4，苯并卟啉衍生物单酸环A（BPD-MA） ⁵和荧光素 ^6,7，所有这些设备均已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的完全批准或临床试验性批准，可用于人体研究。此处所述的高分辨率显微内镜技术可能吸引广泛从事基础科学与临床科学研究的研究人员。该技术提供了一种高效且经济的方法，可作为传统台式显微镜的有效补充，使用户能够进行高分辨率的纵向成像 原位.

方案

1. 微型内窥镜组装

本文所述的高分辨率显微内窥镜（图1a）应被视为一种基础配置，其组装和应用方式可有多种变体。本文详细描述了该平台的一种实现形式，其设计用于以普鲁黄（proflavine）作为荧光对比剂。普鲁黄是一种明亮的细胞核染料，其最大吸收波长和发射波长分别为445 nm和515 nm。若使用其他对比剂，用户需相应地选择合适的激发滤光片、发射滤光片和二向色镜。高分辨率显微内窥镜的多个组件具有通用性，可从多家供应商获取。例如，光学机械定位组件可从Thorlabs、Newport、Linos等公司获得。紧凑型CCD相机可从Point Grey Research、Prosilica和Retiga等公司采购；相机灵敏度的选择应考虑所用荧光染料的亮度以及所需的帧率。高功率发光二极管（LEDs）可从Luxeon、Cree和Nichia等公司获取。光纤束可从住友（Sumitomo）、藤仓（Fujikura）和肖特（Schott）等公司获得。在为特定应用选择组件时，用户应考虑荧光显微镜中荧光染料浓度、光漂白、照明强度、相机灵敏度、增益和曝光时间之间的内在关系。

1. 将6英寸笼杆与1.5英寸笼杆连接，形成一对7.5英寸长的杆件。将这些杆件旋入折叠反射镜单元的一个端面，再将0.5英寸杆件旋入相对的另一端面。通过笼式立方体下方的两个通孔将立方体滑入笼杆上。将2英寸杆件旋入笼式立方体的侧面（图1b）。
2. 使用C接口转SM1适配器将相机连接至笼板，并将笼板固定在0.5英寸笼杆上，使其与折叠反射镜单元端面齐平。
3. 将“管”镜片插入一个3英寸长的镜筒中，并用卡环固定镜片。应选择镜片的焦距，使得光纤束的纤芯投射到相机上时至少被两个像素采样。将发射滤光片放入镜筒内，置于第一个卡环之上，并添加另一个卡环以固定滤光片。注意遵循滤光片制造商标明的滤光片方向。将镜筒旋入笼式立方体靠近CCD相机的一侧。注意在图1c中，为清晰起见，该镜片和滤光片未显示其3英寸镜筒。
4. 将相机连接至计算机并在屏幕上查看图像。将笼式组件对准远处物体，并沿导轨滑动笼式立方体，直至图像清晰聚焦。在此位置锁紧笼式立方体。（这是一种简单方法，用于确保管镜片与无限远校正物镜组合时可形成清晰聚焦图像。）
5. 将二向色镜插入支架中，并以45°角放置于笼式立方体内。
6. 通过RMS转SM1螺纹适配器和可调镜筒，将物镜旋入笼式立方体与管镜筒支架相对的端面。可使用z轴位移器替代可调镜筒以方便调焦。将SMA接头旋入笼板，并将该笼板安装在杆件上，位置大致位于物镜的工作距离处。
7. 将LED安装在笼板上，并滑动至2英寸杆件末端。在0.5英寸镜筒中加入一个透镜，使得当该镜筒旋入笼式立方体侧面时，LED的像能够充满物镜的后孔径。这种（科勒照明）配置可确保光纤束近端面被均匀照明。将激发滤光片加入0.5英寸镜筒中，并用卡环固定（图1c）。
8. 将SMA接头连接至光纤束。将带SMA接头的光纤束旋入安装在笼杆上的SMA插座中。将光纤束远端对准宽带光源（荧光灯照明即可满足要求），并在CCD相机上观察光纤束近端面的图像。通过旋入或旋出笼式立方体来调节物镜位置，直至光纤束图像清晰聚焦。各个纤芯应清晰可见（图2）。

2. GRIN 透镜组装

通过在光纤束的远端末端附加一个微透镜或透镜组件，可以提高微内窥镜的空间分辨率。这些光学元件的配置方式使得光纤束末端不再直接接触组织，而是将末端成像到组织表面并实现缩小成像，从而提高由光纤束中导光核心所决定的空间采样频率。缩小倍数的程度对应于空间分辨率的提升，同时也会相应地减小视场范围。梯度折射率（GRIN）透镜元件与光纤兼容，可从GrinTech、NSG、Schott等公司获得，并可直接键合至光纤束的远端末端。

1. 根据您的应用需求选择合适放大倍数和工作距离的GRIN透镜。确保透镜的直径大于您计划使用的光纤束的直径。我们建议在低倍显微镜或体视显微镜下，将光纤束和GRIN透镜分别安装在独立的三轴手动位移台上，以便在粘接前进行精确对准。
2. 在透镜或光纤束端面滴加一滴光学胶（例如Norland紫外固化胶）。使用手动位移装置使两个部件接触，并按照制造商推荐的剂量对界面进行紫外光照射。
3. 为保护GRIN透镜及粘接界面，可使用一段短铝质毛细管（Small Parts Inc.）包裹接头。将毛细管套接在接头处，并用环氧树脂固定。可使用热缩管完成组件封装。

3. 微型内窥镜成像

1. 将对比剂应用于待成像的细胞或组织。使用普鲁黄（0.01% w/v 溶于 PBS）时， 体外 培养细胞的成像可通过短时间孵育（< 1 分钟）并彻底冲洗。成像 离体 组织样本或 体内 在局部应用染料后，组织即可进行成像。在这些条件下，普罗黄的摄取几乎瞬间完成，数秒内即可开始成像，且成像效果可持续数分钟。
2. 将光纤束轻轻接触待成像的样品。在对培养细胞成像时 离体 组织样本，我们建议将光纤束的远端固定在稳固的夹具中，并通过XYZ轴上的手动定位平台进行调节，以确保成像过程中的稳定性。

4. 典型结果：

正确组装后，微型内窥镜将作为落射荧光显微镜工作，并通过相干光纤束传递图像。为获得最佳成像效果，应注意确保满足以下三个关键条件：

1. 为了实现系统的完全分辨率，应将光纤束的近端面无散焦地成像到CCD相机上。图2a、2b、2c分别展示了在聚焦不良、轻微散焦和良好聚焦条件下所成像的光纤束局部区域。通过调节物镜相对于光纤束端面的轴向位置，可找到最佳焦距。
2. 光纤束的近端面应在整个直径范围（视场）内实现均匀照明。如实验方案文本（1.7）所述，这可通过配置照明光学系统以实现科勒照明来达成。图2d显示了在该优选配置下对均匀荧光样品进行照明所获得的图像，而图2e则展示了在临界照明条件下的相应结果。在后一种情况下，LED的结构被成像到光纤束端面上，导致这种不希望出现的图案叠加在真实样品结构之上。
3. 光纤束的近端面和远端面均应保持清洁，无划痕和碎裂。图2f展示了附着在光纤束端面上的污染物，以及在光纤周缘5点钟方向存在小碎片形式的损伤。可通过与常规光纤连接器相同的方式，使用镜头纸和异丙醇或标准光纤清洁工具对光纤束端面进行清洁以去除污染物。若光纤束任一端出现划痕或碎裂，或沿长度方向发生断裂，可采用标准的手动或机械抛光技术将端面抛光至平整。我们建议先使用12–15 μm研磨纸进行初步粗抛，再用0.5–1.0 μm研磨纸进行最终抛光。

图3a展示了1483个细胞的成像 体外，使用原黄素标记并在样本上轻柔放置裸露的光纤束后。图3b展示了将一个2.5倍GRIN透镜粘接在光纤束末端后，空间分辨率的提升以及视场范围的缩小。视频1展示了 体内 小鼠模型乳腺脂肪垫成像。此处，将外径为0.5 mm（视场为330 μm）的光纤束经21号针头插入并推进至组织内。脂肪细胞清晰可见，且以每秒15帧的速度采集的图像中可明显观察到由心动周期引起的运动。图3c展示了对一名健康人类志愿者口腔黏膜的成像，此次使用的是外径为1.5 mm（视场为1.4 mm）的较大光纤束。所有示例中均采用普鲁黄作为细胞核标记的荧光对比剂。

图1. 高分辨率显微内窥镜（HRME）的组装。（a）HRME系统的示意图。（b）主要光机械支撑结构的组装。（c）光学元件、照明LED和CCD相机的安装。（d）HRME系统的实物照片，封装于一个10英寸×8英寸×2.5英寸的外壳中。

图 2. HRME 的设置。使用光纤束成像的示例：(a) 焦点不佳，(b) 接近良好焦点，(c) 理想焦点。(d) 在科勒（均匀）照明下，对光纤束远端尖端的均匀荧光目标进行成像。(e) 在临界照明下对均匀荧光目标进行成像，光源结构在物体上清晰可见。(f) 松散的组织和细胞可能附着在光纤束端面，且其周边区域也容易受到轻微损伤。

图3. 使用HRME成像。（a）1483个细胞 体外，使用0.01%（w/v）吖啶黄染色后，以裸光纤束（IGN-08/30）成像。（b）与（a）相同的1483细胞培养样本，使用带2.5倍GRIN透镜的光纤束成像。（c）正常人口腔黏膜图像 体内，局部应用0.01%（w/v）普罗黄后。

视频 1. 通过将外径为 450 μm 的光纤束插入已穿入组织的 21 号针头腔内，对小鼠乳腺脂肪垫进行成像。在插入成像光纤之前，通过同一针头向成像部位输送 0.01%（w/v）的普鲁黄溶液。点击此处观看视频

讨论

高分辨率显微内镜技术为生物医学基础研究和临床研究领域的研究人员提供了一种灵活、可靠且经济高效的方法，用于观察细胞精细结构 原位我们已描述了一种成像系统的组装方案，并展示了其在细胞培养中的应用。 体外，以及动物和人体组织中 体内尽管本文展示的成像结果使用了吖啶黄作为荧光对比剂，但其他研究团队已展示了该系统的不同版本，其LED照明波长和滤光片经过选择，以匹配其他染料的激发/发射光谱。 ^5-7.

分辨率和视场最初由光纤束的纤芯间距和成像直径决定。我们使用的光纤束纤芯间距约为 4 μm，成像直径分别为 330 μm（视频 1）、720 μm（图 2、图 3a,b）和 1400 μm（图 3c）。较小的光纤束可通过更细规格的针头，且显著比大尺寸光纤更柔韧。我们及其他研究者⁸在某些情况下观察到光纤束本身会产生自发荧光信号。当使用紫外波长激发荧光探针，或在红光光谱范围内收集发射光时，应关注光纤束自发荧光对整体检测信号的贡献。

尽管迄今为止报道的大多数高分辨率显微内窥镜工作均采用裸光纤束，但在远端尖端键合梯度折射率（GRIN）透镜可提供额外的放大效果。GRIN透镜是一种提高空间分辨率的简单且经济的方法，但其易于产生光学像差且数值孔径（NA）有限的问题已广为人知。如果GRIN透镜的性能无法满足特定应用需求，可采用混合型GRIN/球面透镜物镜⁹或微型物镜组件^10-11。

本文所述的高分辨率显微内窥镜本质上是一种宽场落射荧光显微镜，因此无法实现光学切片（如共聚焦或非线性显微镜中的效果）。根据我们的经验，使用455 nm激发光并以局部涂抹的普鲁黄作为对比剂时，所收集的光信号主要来自相当于数个细胞层深度的组织区域。

本方案旨在使读者能够在实验台上组装高分辨率显微内窥镜，设备占用空间紧凑，仅为10英寸×8英寸。如需要，可将系统置于箱体内，并通过电池组为电子元件（LED和相机）供电（图1d）。许多紧凑型相机可通过主机计算机的IEEE-1394（Firewire）和USB端口供电。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCD 相机	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 – 其他荧光染料可能需要不同部件
激发滤光片	Semrock	452/45	选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 – 其他荧光染料可能需要不同部件
发射滤光片	Semrock	550/88	选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 – 其他荧光染料可能需要不同部件
二向色镜	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 – 其他荧光染料可能需要不同部件
物镜	Thorlabs Inc.	RMS 10X
管镜	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	选择适当的焦距以实现 CCD 所需的放大倍率
聚光镜	Thorlabs Inc.	ACL2520
笼式立方体组件	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
笼杆和连接板	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
折叠反射镜组件	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
透镜套管	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (或 SM1Z)
转接头 / 耦合器	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA 接头	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED 驱动器	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
光纤束	住友贝克利特公司（Sumitomo Bakelite Co., Ltd.）	IGN-08/30	可提供更大或更小的光纤束（住友 / 藤仓）