本文介绍了一种分离和培养小鼠肺内皮细胞的实验方案。该方法包括肺组织的机械法和酶解法解离，以及利用与磁珠偶联的抗PECAM-1和抗ICAM-2抗体进行的两步纯化过程，最终获得主要来源于微血管的高纯度内皮细胞群体。
本文内容
摘要
摘要
内皮细胞在血管生物学的许多研究领域中提供了重要的研究模型。自首次分离以来 1人脐静脉内皮细胞（HUVECs）因其获取方便、易于培养，已成为研究中最广泛使用的内皮细胞。然而，对于聚焦于血管生成、通透性或其他相关过程的研究而言，微血管内皮细胞（ECs）是更为符合生理条件的模型。 2此外，从基因敲除小鼠中分离的内皮细胞为蛋白质功能分析提供了有用的工具 离体目前已报道了多种分离和培养不同来源微血管内皮细胞的方法 3-7，但在许多实验室中，内皮细胞（ECs）的稳定分离与纯化培养仍是一个主要的技术难题。本文提供了一种可靠且相对简便的小鼠肺微血管内皮细胞（MLECs）分离与培养的分步操作方案。该方法首先将6至8日龄幼鼠的肺组织剪碎，用胶原酶/分散酶（C/D）溶液消化，并通过机械法分散成单细胞悬液。随后，利用与Dynabeads磁珠偶联的抗PECAM-1抗体，通过磁性粒子浓缩器（MPC）对MLECs进行阳性筛选，从而从细胞悬液中富集纯化。所得纯化细胞在明胶包被的组织培养（TC）皿中进行培养，直至形成融合单层。此时，进一步使用与抗ICAM-2抗体偶联的Dynabeads对细胞进行二次纯化。本方案获得的MLECs在相差显微镜下呈现典型的铺路石样形态，其内皮细胞表型通过抗VE-cadherin抗体的流式细胞术（FACS）分析得以确认 8 和抗 VEGFR2 9 抗体和VE-钙黏蛋白的免疫荧光染色。在我们操作中，该两步分离方法能够稳定且可靠地获得纯度较高的MLEC群体，并可进一步进行培养。该方法将使研究人员能够充分利用日益增多的基因敲除和转基因小鼠模型，直接进行相关研究 体内 结果研究 体外 在分离的MLECs上进行的实验，有助于揭示所观察到的血管表型的分子机制 体内.
方案
1. 准备抗 PECAM-1 抗体偶联磁珠（Dynabeads）
- 通过涡旋混合将50 mg BSA加入50 ml PBS中，配制0.1% BSA/PBS溶液，直至BSA完全溶解。用0.22 μm注射器滤器过滤除菌，4°C保存。
- 在超净台内，将200 μl充分重悬的羊抗大鼠IgG Dynabeads转移至1.5 ml离心管中并洗涤磁珠：将离心管置于磁极板（MPC）上静置约1 min，使磁珠沉降。吸除上清液，取下离心管，加入1 ml无菌0.1% BSA/PBS重悬磁珠，上下吹打混匀。
- 重复步骤2的洗涤操作三次，共洗涤四次。
- 将离心管从磁极板上取下，加入500 μl 0.1% BSA/PBS重悬磁珠。
- 向管中加入10 μl大鼠抗小鼠PECAM-1（CD-31）抗体。
- 在4°C冰箱内旋转孵育过夜，或室温孵育2小时。
- 按步骤1.2所述方法，用无菌0.1% BSA/PBS洗涤磁珠四次。
- 将离心管从磁极板上取下，加入200 μl 0.1% BSA/PBS重悬磁珠。标记后的抗PECAM-1抗体偶联Dynabeads可在4°C保存最多1个月。
2. 从新生小鼠中分离肺微血管内皮细胞
在进行组织纯化方案之前，必须获得IACUC委员会对该操作的批准。
- 准备以下试剂：
- 15 ml 浓度为 1 mg/ml 的 C/D 溶液（溶于 DMEM 中），使用 0.22 μm 注射器滤器过滤，并预热至 37°C。
- 50 ml 锥形管中加入 15 ml DMEM，置于冰上保存
- 分离培养基（IM）：含 20% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基
- 2% 明胶溶液：将 2 g 牛皮明胶溶于 100 ml 去离子水中，15 分钟高压灭菌后于 4°C 保存。使用前加热至 37°C 使其液化，用于包被组织培养瓶。
- 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉三只出生 6–8 天的幼鼠。确认麻醉生效后，依次进行解剖操作：将幼鼠固定于解剖板上，用 70% 乙醇浸湿皮肤，使用无菌解剖剪去除胸部区域的皮肤。剪开胸腔以暴露肺组织。
- 在无菌条件下逐个切除肺叶，注意避免损伤支气管及肺周围可见的结缔组织。将所有肺组织合并置于冰上预冷的 DMEM 中。处死幼鼠。
- 在组织培养超净台内，将肺叶从 DMEM 中取出，放入 100 mm 组织培养皿中，并吸除多余的 DMEM。
- 使用无菌剪刀将组织充分剪碎（约剪切 100 次），转移至 15 ml 预热的 C/D 溶液中进行酶消化。在旋转仪上 37°C 孵育 45 分钟。
- 在组织培养超净台内，将消化后的组织悬液用附有 14 号套管针头的 20 ml 注射器吸取，并反复吹打至少 12 次，使组织团块分散为单细胞悬液。
- 将组织悬液通过 70 μm 细胞滤筛过滤，并用 15 ml 分离培养基（IM）冲洗滤筛，以终止消化反应。
- 在 400×g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 3 ml 0.1% BSA/PBS 溶液中。
- 将细胞悬液转移至 5 ml 圆底聚苯乙烯管中，每管加入 22.5 μl 抗 PECAM-1 抗体偶联的 Dynabeads。室温下翻转孵育 12 分钟。
- 用 2 ml 2% 明胶溶液包被 T75 培养瓶，吸除多余明胶。在组织培养超净台内静置约 30 分钟，使明胶干燥，备用以接种细胞。
- 磁珠孵育完成后（步骤 2.10），将细胞悬液均等分至三个 Eppendorf 管中，并置于磁力架（MPC）上。
- 待磁珠在磁力架上沉降（约 1 分钟）后，收集上清液，将离心管从磁力架取下，用约 1 ml 0.1% BSA/PBS 洗涤磁珠，然后重新置于磁力架上。
- 重复洗涤四次（共洗涤五次）。
- 每管中用 1 ml 含 EnGS-Mv Life 因子试剂盒和 1× 青霉素/链霉素的 VascuLife 培养基（VL）重悬磁珠，充分混匀。
- 将细胞接种至预先包被的 T75 培养瓶中，每瓶补加 VL 培养基至总体积为 10 ml。
- 次日更换培养基，培养 1 整天后，此后每隔一天更换一半培养基。当细胞融合度 >70–80% 或更高（通常在培养 3–4 天后），可使用抗 ICAM-2 Dynabeads 进行分选。
3. 准备抗ICAM-2抗体偶联的Dynabeads
- 使用抗-ICAM-2 抗体偶联的 Dynabeads 对已通过抗-PECAM-1 抗体偶联 Dynabeads 选育并培养至融合状态的细胞进行进一步纯化。该操作步骤同前述抗-PECAM-1 抗体偶联 Dynabeads 的方法（上述第1条），唯一区别是采用抗小鼠 ICAM-2（CD-102）抗体替代抗-PECAM-1 抗体。
- 抗-ICAM-2 抗体偶联的 Dynabeads 可在 4°C 下保存最多 1 个月。
4. 使用抗ICAM-2 Dynabeads分选小鼠肺内皮细胞
- 用2%明胶包被T75组织培养瓶。
- 吸除含细胞的T75培养瓶中的培养基，并用8 ml PBS洗涤。
- 吸除PBS，加入2 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，使细胞脱落（约5分钟）。轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。
- 待细胞脱落后，加入2 ml IM以抑制胰蛋白酶活性，并刮取培养瓶内表面以使残留的贴壁细胞脱落。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在400×g下离心5分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml 0.1% BSA/PBS中。
- 转移至5 ml聚苯乙烯圆底试管中，加入10 μl抗ICAM-2 Dynabeads磁珠，在室温下翻转孵育12分钟。
- 将细胞悬液均分至两个1.5 ml Eppendorf管中，并置于磁力架（MPC）上。
- 待磁珠吸附1分钟后，吸除上清液。将离心管从磁力架上取下，每管用1 ml 0.1% BSA/PBS重悬细胞，再放回磁力架上。
- 重复洗涤四次（共洗涤5次）。
- 每管加入1 ml VL重悬细胞，并进行细胞计数。
- 以每T25培养瓶25万至35万细胞，或每T75培养瓶75万至100万细胞的密度接种细胞。
- T25培养瓶加培养基至5 ml，T75培养瓶加至10 ml。
- 每隔一天更换一次培养基。通常在培养2-3天、细胞融合度达到约80%时，可用于实验。
5. 代表性结果
通常，在细胞初次制备后的6-7天，可从三只6-8日龄的幼鼠中获得约1.2 - 1.5 × 106个肺微血管内皮细胞。在光学显微镜下，这些细胞呈现典型的“鹅卵石”样形态，并在细胞间连接处显示VE-钙黏蛋白（CD144）染色，这是内皮细胞的特征性表现（图1）。大多数MLEC通过FACS分析证实表达VE-钙黏蛋白和VEGFR2（图2）。通常，我们在初次分离MLEC后的两周内将其用于实验。
图1. 小鼠肺微血管内皮细胞（MLEC）单层融合的显微分析。（A）明场显微图像显示培养细胞呈典型的内皮细胞铺路石样形态。许多细胞核周区域可见均匀的圆形结构，为用于MLEC分离的磁珠。（B）利用共聚焦显微镜显示，内皮细胞特异性的VE-钙黏蛋白定位于细胞间连接处。标尺代表20μm。
图 2. 对培养的小鼠肺内皮细胞（MLEC）进行流式细胞术分析，使用特异性识别内皮细胞特异性标志物 VE-钙粘蛋白（CD144）或 VEGFR2 的抗体进行标记，随后加入藻红蛋白偶联的二抗，以确认分离所得 MLEC 的内皮细胞特性。红线代表同型对照，绿线代表抗-VE-钙粘蛋白或抗-VEGFR2 特异性 IgG。
讨论
微血管内皮细胞已被证明在血管生物学的多个研究领域中是一种有用的模型，并且相较于被广泛研究的脐静脉内皮细胞（HUVECs），其在研究（如血管生成）中被认为具有更高的生理相关性。 3此前有报道称，可从肾脏、心脏、皮肤、视网膜、脑组织、胶质瘤、脂肪组织以及肺脏中获取微血管内皮细胞 2, 4-7, 10, 11然而，目前仍需要一种稳定且可靠的微血管内皮细胞分离方法。本文所述方案是对先前已发表方案的一种改进。 2；该方法与大多数已发表的方案不同之处在于使用幼鼠而非成年动物。这一点对于细胞分离的成功至关重要，因为幼龄动物的细胞具有更高的增殖潜能，其组织来源的培养物通常能获得更多的细胞。出生一周的动物最为理想，但更年轻的幼鼠（如出生4天）也可使用。此外，根据需要也可使用更多或更少数量的幼鼠，因为我们已成功从单只幼鼠中分离出MLEC。然而，在扩大或缩小分离规模时，细胞接种密度必须保持不变，因为这对细胞增殖同样关键。本方案采用两步法纯化MLEC，即先使用与抗-PECAM-1抗体偶联的磁珠，再使用与抗-ICAM-2抗体偶联的磁珠，相比以往报道的单步纯化方法，能更高效地获得高纯度的内皮细胞（EC）培养物。该方法避免了使用繁琐的人工操作技术、梯度离心以及效率较低的流式细胞分选（FACS）来去除成纤维细胞、血细胞和平滑肌细胞等污染细胞。所获得的MLEC细胞群体可用于 体外 血管生成反应、血管通透性及白细胞跨内皮迁移分析，伤口愈合实验以及信号通路的生物化学分析。如有需要，可将MLECs接种于不同表面，例如纤连蛋白或明胶包被的盖玻片用于免疫荧光染色，或接种于电极阵列用于跨内皮电阻（TER）检测。所得结果可直接与观察到的表型进行比较 体内，这在敲除小鼠和转基因小鼠品系数量不断增长的背景下尤为重要。该方法成功实施的关键在于 体外 分析所观察缺陷的细胞机制 体内，已经展示过 12.
披露
动物实验严格按照威斯康星医学院IACUC委员会在方案AUA#00001206下制定的指南和规定进行。
致谢
本研究部分得到了美国心脏协会资助 0950118G 对 M.C-W. 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弹簧剪 | 精细科学工具 | 15032-13 | |
| 镊子 | 精细科学工具 | 11223-20 | |
| 14G 套管针 | 费舍尔科技 | 1482516N | |
| 20 ml 注射器 | BD 生物科学 | 309661 | |
| BSA | 西格玛-奥德里奇 | A7030-100G | |
| 抗大鼠 IgG Dynabeads | 英潍捷基 | 110.35 | |
| 磁性颗粒浓缩器 (MPC) | 英潍捷基 | 123-21D | |
| 抗小鼠 PECAM-1 抗体 (CD-31) | BD 生物科学 | 553369 | |
| 抗小鼠 ICAM-2 抗体 (CD-102) | BD 生物科学 | 553326 | |
| 胶原酶/分散酶 (C/D) | 罗氏集团 | 11097113001 | 可配制 100mg/ml 储存液并保存于 -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| 牛皮明胶 | 西格玛-奥德里奇 | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv 完全试剂盒 (VL) | 生命线细胞技术 | LL0004 | |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | 美迪特科技公司 | 25-052-CI | |
| 细胞滤器 70 μm 尼龙 | BD Falcon | 352350 | |
| 组织培养瓶 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
参考文献
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