本文概述了制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的实验步骤，用于研究与脑衰老及年龄相关性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）相关的突触改变。
本文内容
摘要
摘要
啮齿类动物海马脑片制备可能是研究哺乳动物突触功能和可塑性应用最广泛的工具。海马可从大鼠和小鼠中快速、简便地分离出来，脑片在充氧的人工脑脊液中可维持数小时的活性。此外，基本的电生理技术可轻松应用于海马脑片突触功能的研究，并已提供了一些认知功能障碍的最佳生物标志物。海马脑片尤其适用于研究与学习和记忆相关的突触可塑性机制。海马脑片中突触效能的长时程增强和长时程抑制（LTP 和 LTD）的诱导变化（或缺乏变化）常被用于描述认知障碍动物的神经表型，和/或评估促智化合物的作用机制。本文概述了我们用于制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的步骤，以研究与脑衰老和阿尔茨海默病（AD）相关的突触改变1-3。对于习惯使用年轻大鼠和/或小鼠的研究人员而言，使用老龄大鼠和 AD 模型小鼠可能带来一系列独特的挑战。老龄大鼠的颅骨更厚，结缔组织更坚韧，相比年轻大鼠和小鼠，这可能延缓脑组织的取出和/或解剖过程，从而掩盖或夸大突触功能和可塑性的真实年龄差异。衰老和淀粉样蛋白病理也可能加剧解剖过程中对海马造成的损伤，进而使生理评估所得结论的解释更加复杂。本文讨论了在解剖过程中为尽量减少这些问题所采取的步骤。同时提供了来自大鼠和小鼠“健康”与“不健康”脑片的突触反应示例，以及典型的突触可塑性实验。还讨论了其他方法学因素（如记录液成分、刺激参数）对这些动物模型突触功能的可能影响。尽管本文重点在于老龄大鼠和转基因小鼠的应用，但脑片生理学的新手也能从中获得足够的细节，以利用多种啮齿类动物模型开展自己的研究。
方案
1. 配制冰冷的含氧人工脑脊液（ACSF）
- 制备 2 L “Ca2+-free” ACSF。在2L锥形瓶中，加入约1.5 L无菌或重蒸水H2O，并在搅拌板上开始剧烈搅拌。加入以下人工脑脊液（ACSF）成分（单位：mM）：124 NaCl，2 KCl，1.25 KH2PO4，2 MgSO₄4，26 NaHCO₃3，以及10 g葡萄糖（见表1）。用蒸馏水定容至2 L2O.
- 使用一个水族箱气泵和连接的管路，该管路通入95% O₂2/5% CO₂2 气罐，用空气充分氧合ACSF约20-30分钟。检测pH值，必要时用NaOH或HCl调节至7.4。
- 加入750 mL充氧的Ca2+-自由的ACSF转移至一个单独的锥形瓶中，用封口膜覆盖瓶口，并转移至超低温冰箱（-80°C）中孵育 20–30 分钟。该培养基将用于脑组织分离和急性海马脑片制备*。加入 2 mM CaCl₂。2 至终体积1.25 L的ACSF#中，充分搅拌，并恢复以95% O₂2/5% CO₂2该培养基将用于解剖后脑片的保存，以及电生理记录期间脑片的灌流。
*冰冻的 Ca2+ 使用无血清培养基以减缓代谢并最小化 Ca2+-依赖性兴奋性毒性在解剖过程中的作用。
# 钙离子的变化2+ 衰老和阿尔茨海默病期间的失调可能对Ca²⁺诱导产生重大影响2+依赖性突触可塑性 4-9关于年龄差异对LTD影响的相互矛盾的报道，部分原因可能在于使用了不同Ca²⁺浓度的ACSF2+：在脑片记录期间的 Mg2+ 比例（参见 2,4,10). 钙的重要性2+ 调节与ACSF Ca2+ 衰老研究中的水平在讨论部分中进行了更详细的阐述。 - 尽管Ca2+无 ACSF 冷冻，准备一个用于在电生理记录前和记录期间维持脑切片的孵育室*。我们使用一种定制的大型孵育室，内含四个独立的微型孵育室（见图2）。该大型孵育室中充满无菌、充氧的 H2O₂，微室本质上是突出于水面的小岛。每个微室内，脑片置于网状插槽中，浸于浅层充氧人工脑脊液（ACSF）内。脑片并非完全浸没，而是处于与加湿空气相接触的界面。大室内的绝缘加热元件可实现温度调节。
市面上还可购得多种类型的孵育室（例如 Warner Instruments 公司生产的浸没式“Pre Chamber #BSC-PC”），适用于衰老及转基因小鼠脑片研究。紧急情况下，脑片可在盛有ACSF的小培养皿中维持数小时。在培养皿盖上打一小孔以插入供氧管。注意避免氧气气泡对脑片造成物理扰动。只要将供氧管抬升至略高于ACSF液面处，即可为脑片提供充足氧气（气体弥散应在液面形成凹陷）。
2. 老年（>20月龄大鼠）脑组织取出与海马分离
- 在大型水槽旁准备解剖区域*（见图1和表2）。将小型动物断头器置于水槽中，并摆放用于脑组织取出和海马体解剖的外科器械与材料，包括折叠的纸巾、#11号手术刀片、显微剪刀、骨剪、海马体专用工具（Fine Surgical Tools公司生产的双头解剖铲）、小型手术剪、细双头解剖铲、塑料巴斯德吸管、直径110 mm的Whatman滤纸、装有冰块并带盖的100 mm玻璃培养皿，以及塑料勺。同时在附近准备一个塑料袋，用于丢弃动物尸体。
大脑提取应尽快完成，因此建议在操作前在脑海中预演整个流程，并按使用顺序摆放好所需器械。 - 去除 Ca2+从冷冻箱中取出无钙 ACSF。培养基应部分冻结，而非完全冻结。将约 50 mL ACSF 倒入玻璃烧杯中，用 Parafilm 封口，置于解剖区域旁备用。此培养基用于脑组织取出后的短暂存放。剩余的 Ca2+无血清培养基将用于填充振动切片机中的储液槽以进行切片制备。该培养基可重新充氧，或仅用封口膜覆盖后置于冰箱中 4°C.
- 使用经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方法处死大鼠。我们的动物被置于一个小的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）舱内，舱中逐渐充满100% CO₂2意识丧失通常在五分钟内发生，可通过脚趾夹捏后无反射活动来确认。
- 立即在第一颈椎前方将大鼠断头，并将头部置于折叠的纸巾上。使用#11手术刀，从靠近鼻骨处开始，沿中线向后至枕骨快速切开头皮。务必完全切透皮肌，充分暴露颅骨背侧的骨缝。
- 用眼科剪剪开颅骨骨板。对于幼年大鼠和小鼠，仅使用骨钳即可快速去除颅骨。然而，老年大鼠的颅骨比年轻成年大鼠和小鼠更厚，可能使该操作变得困难。我们发现，预先剪开颅骨可显著促进骨钳去除骨片，减少对脑组织的损伤，并节省宝贵时间。将大鼠头部稳固置于操作台面，将眼科剪下叶的刃口插入枕骨大孔上部，位于颅骨后方。保持下叶紧贴颅骨内表面（避免接触脑组织）*，剪开枕骨骨板，然后沿顶骨骨缝的中线向前剪切，继续向头侧方向剪至前额颅骨骨板。
必须将压力引导至远离脑部的方向，以防止意外损伤。 - 分离枕骨、顶骨和颞骨颅骨骨板与脑组织。继续牢固地将头部固定在操作台面上以保持稳定和施力，将咬骨钳的下钳口滑入左侧顶骨骨板下方，同时保持对颅骨内表面的压力。接着，闭合咬骨钳钳口，并向上及向操作者方向旋转手腕，将顶骨和枕骨骨板从脑组织上剥离。此操作应可暴露左侧大脑半球的大部分背侧表面。如有必要，可使用咬骨钳一并移除左侧额骨骨板。对另一侧大脑半球重复上述操作。骨板移除后，迅速检查是否有硬脑膜附着于颞骨骨板并跨过脑表面被拉伸。用咬骨钳轻轻牵拉去除，或使用剪刀剪除*。随后，将咬骨钳的上钳口插入右侧颞骨骨板与脑组织之间，再次确保压力朝向颅骨、远离脑组织。闭合钳口并扭转，将颞骨骨板从脑组织上分离。操作时应能听到或感觉到“咔嚓”声。对左侧重复此步骤。
硬脑膜可能较难辨认，尤其是当动物经心脏灌注人工脑脊液（ACSF）后。然而，若不移除硬脑膜，在移除颞骨板时，它会像刀片一样刺穿脑组织（极有可能包括海马）。在靠近颞骨板处剪开硬脑膜，可最大程度降低刺伤脑组织的风险。 - 取出脑组织*。迅速移除Ca中的封口膜2+无钙 ACSF“冰沙”中。现在将海马体工具的宽铲头插入脑腹面与颅底骨板之间，直至完全置于脑下方。将铲子左右、前后移动数次，以切断完整的脑神经。随后用海马体工具将脑组织舀出，并浸入 Ca2+-不含 ACSF 的溶液，并用封口膜封住。将脑组织冷却约一分钟。此时可趁机清洁断头台，处理动物尸体，并整理解剖区域。
*对于步骤2.3–2.7，操作速度至关重要。我们力求在30–35秒内完成该过程（从断头至脑组织浸入ACSF）。根据我们的经验，若提取过程超过1分钟，似乎会对海马脑片的健康状态产生不利影响，尤其是对于老年大鼠。在本研究中，采用这些操作步骤时，我们未观察到老年大鼠与年轻大鼠在提取时间上存在差异。 - 取出海马体。将Whatman滤纸置于冰冷的培养皿盖上，用塑料移液管将ACSF滴加至滤纸上使其湿润。用勺子从ACSF中取出脑组织，放置于湿润的Whatman滤纸上。使用解剖刀片切除小脑以及约四分之一的前部额叶。将刀片沿大脑半球间裂插入，完全分离两个半球。将其中一个半球放回ACSF冰浆中，将另一个半球直立放置于解剖台上，使额叶的冠状面朝下。此时应能清晰区分脑干和中脑（呈白色）与覆盖其上的皮层（呈粉红色/灰白色）。在中脑上定位上丘和下丘，它们呈现为两个白色的“隆起”，在此方位下位于脑的“顶部”。用手术剪轻轻固定中脑，将称量勺插入丘脑与新皮层之间的缝隙中。非常轻柔地继续将称量勺向下滑动，并将脑干/中脑/丘脑部分向后拉开，暴露出侧脑室内侧以及海马体的内侧面。使用称量勺的锋利边缘平滑切断穹窿——即位于海马体前部/背侧的一束白色纤维。用剪刀继续轻轻牵拉脑干/中脑/丘脑部分，但不要将其完全从脑的其余部分切断。此时，带有海马体的皮层应已自然向后展开，脱离脑干*。接下来，旋转解剖台，使你所观察的内侧海马体及其上方皮层如同一个矢状切面（不含丘脑）。此时应可见到位于该平面下端、呈浅双曲线形的白色伞纤维。用塑料移液管轻轻向伞纤维下方的间隙中喷射少量ACSF，以帮助分离海马体与皮层。将称量勺轻柔地插入该间隙，使称量勺的长边与海马体的长轴平行。当称量勺完全置于海马体下方后，用剪刀牢固压住脑干/中脑/丘脑部分，并将称量勺向外（远离身体方向）滚动，从而将海马体从脑的其余部分物理分离。一旦海马体被游离，轻柔修剪掉任何残留的皮层、血管和白质。用称量勺从解剖台远端舀取少量ACSF冰浆，将分离出的海马体轻轻置于冰浆旁，并用塑料移液管滴加数毫升ACSF进行润洗。随后取出另一侧半球，重复上述解剖步骤。
*注：原文中的“brainstem*”在上下文中应理解为包括脑干、中脑及丘脑的复合结构，此处按实际解剖操作保留原意。
*可能需要使用剪刀剪除阻碍皮层与脑干分离的额外结缔组织、白质或血管组织。剪刀尖端将非常接近海马体，因此务必进行精确剪切（必须使用锋利的剪刀）。
3. 老年转基因小鼠的脑组织取出与海马体分离
- 按照第2.3节所述方法处死并切除小鼠头部，并在头皮上做正中切口。小鼠的颅骨比大鼠薄得多，这大大简化了脑组织的取出过程。因此无需使用剪刀剪开颅骨。使用钳口较小的骨钳（表2）剥离枕骨、顶骨和颞骨骨板。与大鼠操作相同，去除骨板时需注意动作控制，将骨钳的下钳口牢固地插入颅骨内表面，并远离脑组织方向用力。去除骨板后，使用海马体分离工具的窄端切断残留的脑神经，并将脑组织舀入冰冻的无钙人工脑脊液（Ca2+-free ACSF）中。
- 制备脑切片。由于小鼠脑体积较小，分离海马体的操作比使用大鼠时更具挑战性（尽管仍可完成）。为了简化操作，我们去除小脑以及额叶前端的尖端部分，但不单独分离海马体。相反，使用手术刀片将两侧脑半球物理分离后保持完整，用于后续振动切片机切片（见下文第4节）。
4. 使用振动切片机（Vibratome）将脑组织切成切片并转移至孵育室*
- 用冰预冷的 Ca2+-不含 ACSF，使切片平台和刀片完全浸没。制作大鼠脑片时，用手术刀片切掉每个海马的头端和尾端尖部，以便将海马垂直紧密排列，如同两列柱状结构。最佳排列方式为使每个海马的齿状回相对朝向，而 CA3 区域朝向同一方向。制作小鼠脑片时，将每个半球垂直紧密排列，额叶朝下。将脑组织粘附于固定块上，并转移至振动切片机的切片平台。我们通常制备约 400 μm 厚的脑片用于突触生理学实验；若需进行荧光成像（例如钙离子动态研究），则应制备更薄的脑片（如 250–300 μm）。2+ 水平和瞬变）。使用宽口移液管或画笔#将切片收集并转移至含有冰冻Ca2+无 ACSF
*使用振动切片机可最大限度减少对切片上下表面的损伤，对于需要分析靠近切片表面细胞的研究（例如电压钳和Ca2+ 成像研究）。然而，也有价格较低的替代设备可用于制备细胞外电生理实验所需的切片。我们使用了一种小型重力控制切片机2,11 和一台McIlwain组织切碎机12 成功率较高。该操作中，将海马体置于切片机上，用垂直切片刀进行切片。使用毛笔将切片（每次一片）转移至盛有冰冻无钙人工脑脊液的小型暂存皿中2+-无 ACSF。这种方法的一个问题是，海马组织在切片过程中可能发生移位，导致切片厚度不均。此外，在切片前应尽量去除白质，尤其是血管组织。这些组织容易黏附在毛刷或刀片上，或两者皆黏，从而使脑片转移变得困难，并增加组织拉伸或损伤的风险。
#使用刷子时，应将切片沿刷毛长度方向平放。将切片缠绕在刷子尖端可能导致组织不必要的拉伸。 - 将脑切片转移至孵育 chamber，使其浸没于充氧的 Ca2+-含ACSF中。逐渐将灌流 chamber 的温度从 27° 到 32°C （每5分钟升高1°）。在进行电生理实验前，让脑片孵育1-1.5小时。
5. 诱发并记录CA3-CA1突触反应
- 对于急性脑片中的基础细胞外记录，您的电生理实验系统需要包括：记录室；灌流系统；配备显微镜的 > 4倍放大能力；记录、刺激和接地电极；大尺度与微操纵器；坚固的防震台面及法拉第笼；刺激器；放大器和模数转换器（A/D）；示波器（推荐使用）；以及配备适当采集软件的个人电脑。
Kerr Scientific Instruments 提供了一套出色且经济实惠的电生理学系统（即 Kerr 组织记录系统），可用于开展多种基础脑片电生理学实验。该系统体积小巧，配备便携式刺激器和放大器，可在标准实验台上使用，无需笨重的法拉第屏蔽笼。
当然，脑切片也可用于执行多种复杂的电生理和成像技术，这些技术需要额外的设备和材料。例如，我们的主要电生理工作站配备有具备快速电压钳和电流钳功能的放大器、荧光照明系统以及数字相机。该工作站用于脑切片的细胞外场电位记录，以及脑切片和细胞培养中的膜片钳记录和荧光成像。 3,12,13详见表3中的设备和组件完整清单。 - 使用宽口移液管或小型毛笔将一个或多个脑片转移至记录室*，在给予刺激或开始记录前使其适应环境10–15分钟。在本研究中，脑片浸没于人工脑脊液（ACSF）中，并置于Warner Instruments公司生产的RC-22型记录室内的网格上（见图3）。ACSF通过重力驱动经流量调节器控制流速，并预先加温至 32°C 通过串联的微型加热器加热后进入记录室。使用中央真空管线移除人工脑脊液（ASCF）。
市面上有多种不同型号的浸入式和界面式记录舱可供选择。我们观察到，脑片在界面式记录舱中（即脑片位于加湿空气与人工脑脊液的界面处）表现出更强健的突触反应2,11然而，当脑片浸没在ACSF中时，其反应性通常更为稳定。此外，浸没式孵育 chamber 中的药物灌注效率也更高。 - 放置刺激和记录电极。在刺激器或刺激隔离器开启但输出调至0的情况下，将刺激电极置于CA2区近CA3边界处的辐射层（stratum radiatum）切片上方（见图4）。我们使用绞合的铂铱合金丝向CA3区Schaffer侧支（SC）纤维输送50–100 μS的双相脉冲。采用铂铱合金丝和双相脉冲有助于最小化电极极化。将记录电极缓慢下降至CA1区辐射层，仅穿透切片表面即可。我们的记录电极为置于含ACSF玻璃微电极内的Ag/AgCl丝（尖端电阻约7 MΩ）。将刺激器输出逐渐调至中等水平（我们将刺激隔离器设定为约150 μA）并开始使用采集软件（如 Axon Instruments, Inc. 的 Clampex）施加刺激脉冲并记录活动。以微小间隔缓慢降低刺激电极，直至在 CA1 区记录到刺激伪迹。随后，在持续采集 CA1 区反应的同时，继续以微小间隔缓慢降低刺激电极和记录电极，直至纤维群峰电位（FV）和兴奋性突触后电位（EPSP）的幅度达到最大值（见图 4B）。
- 建立突触强度曲线并研究突触可塑性。为生成突触强度曲线，对Schaffer侧支（SC）施加强度逐步增加的刺激脉冲，并记录CA1区相应的电活动。所使用的刺激强度范围和水平数量可有所变化，但应足以在相对于纤维容积（FV）或兴奋性突触后电位（EPSP）值作图时生成一条S形曲线（图5）。FV幅度可可靠地估计被激活的突触前纤维比例，而EPSP斜率则能无污染地反映单突触CA3-CA1电流。因此，将不同刺激强度下EPSP斜率对FV作图，可反映每单位激活传入纤维所产生的EPSP大小，是评估CA3-CA1突触强度的良好指标。通常情况下，与年轻大鼠及年龄匹配的野生型小鼠相比，老龄大鼠和APP/PS1小鼠的CA1区突触强度显著降低，例如参见文献4,14。
- 显示不良状态迹象的切片（即最大EPSP幅度 < 1 mV）或出现超兴奋性（即出现2个或更多群体峰电位）的脑片将被排除在统计分析之外（见图4C）。我们发现，这些脑片在60分钟内很少表现出稳定的反应，和/或在突触可塑性诱导后表现出高度可变的反应。值得注意的是，“不健康脑片”仅占转移至记录室的所有脑片的约10–20%。此外，根据我们的经验，不同年龄、物种和基因型之间识别出不健康脑片的频率非常相似。
- 在脑片中诱导长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）。LTP 和 LTD 是突触功能在不同突触激活模式下产生的持久性增强（LTP）或减弱（LTD）。这两种过程被广泛认为反映了学习与记忆的关键机制，可作为研究神经功能障碍的细胞机制，或评估改善记忆缺陷和神经退行性病变的药理策略的有效结局指标。16.
对于突触可塑性实验，将所有脑片的刺激强度重置为1 mV*，并以0.033 Hz的频率开始基础刺激。在诱导LTP或LTD之前，EPSP斜率值应至少稳定20分钟。在此期间密切监测EPSP，若斜率波动超过10%，则需重新调整刺激强度并建立新的基线。使用持续1秒的100 Hz刺激串或每隔200 ms给予一次短暂的高频刺激串（约10个脉冲）来诱导LTP。为诱导LTD，以1 Hz的频率施加900次刺激脉冲。在LTP或LTD诱导后，继续记录突触反应至少60分钟。通过比较高频或低频刺激前与刺激后60分钟时的EPSP斜率值，判断是否存在LTP或LTD。
老年大鼠和APP/PS1小鼠通常表现出LTP减弱和LTD增强（见图5），这些变化被认为有助于解释这些动物模型中认知功能受损的现象6,16然而，与APP/PS1小鼠不同，老龄大鼠的LTP/LTD变化在不同实验室之间存在差异。老龄大鼠在受到“强”刺激（即100 Hz）时，通常表现出与成年大鼠相似的LTP水平；但在使用较弱刺激参数（即较低刺激频率或较少刺激脉冲）时，则表现出缺陷（综述见4,6,16此外，包括我们实验室在内的一些研究团队观察到，老龄大鼠的LTD诱导易感性增加2,17-19而其他研究团队则发现，其老龄动物模型中并未出现差异，甚至表现出易感性降低。如下文（见讨论部分）简要讨论的，实验方案中一些细微但关键的差异可能解释了这些不一致的结果。
刺激强度和EPSP幅度可能影响LTP的诱导，或是文献中研究结果不一致的重要原因。这一点将在讨论部分进一步探讨。
6. 代表性结果
我们的研究以及其他团队的研究表明，星形胶质细胞介导的炎症信号改变可能在衰老和阿尔茨海默病（AD）过程中引发和/或加速神经功能障碍13,20,21。近期，我们采用突触强度、长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）作为终点指标，研究了几种新型抗炎试剂在中年APP/PS1小鼠（该模型的描述见22）和老年Fischer 344大鼠中的有效性和作用机制。下述结果均基于本文所述实验方案获得。
本实验室开发的一种新型抗炎性腺相关病毒（AAV）试剂在初步研究中显示，可显著增强中年（16月龄）APP/PS1小鼠的突触强度（p < 0.05），并防止长时程增强（LTP）缺陷（p < 0.05）（每种处理条件下n = 4–6片）。图5A–C展示了来自同一只16月龄APP/PS1小鼠的两个不同脑片的代表性突触强度曲线和LTP实验结果。其中一个脑片取自接受本实验室新型AAV（试剂A）处理的半脑，另一个脑片则接受对照AAV试剂（对照）处理。两个脑片均采用两串1秒长、100 Hz的刺激（串间间隔10秒）诱导LTP。请注意，试剂A处理脑片的突触强度曲线相对于对照脑片左移，提示突触强度更高。此外，与中年APP/PS1小鼠典型的LTP表现一致，对照脑片中的LTP迅速衰减至基线水平（例如23）；相反，经本新型试剂处理的脑片中LTP衰减极少。
在另一项近期研究中，我们观察到经溶剂处理的年老大鼠出现了显著的长时程抑制（LTD）（为LTD前基线水平的85%，p < 0.05）。相比之下，经新型抗炎药物“Drug A”处理的年老大鼠未出现LTD（为LTD前基线水平的97%，无显著性差异）。未观察到药物对突触强度的影响。该数据集的代表性LTD实验结果（每组n = 8–10只大鼠）如图5D–F所示。
图 1. 脑组织解剖所用的工具与材料。 A，纸巾。B，手术刀片。C，Beebee 剪刀。D，咬骨钳（用于大鼠）。E，咬骨钳（用于小鼠/大鼠）。F，塑料勺。G，塑料移液管。H，海马体剥离工具。I，刮匙。J，手术剪。K，玻璃培养皿。
图2. 自制脑片固定室。 A，大室；B，盖子；C，带有带孔硅胶管的H2O储液槽；D，小室；E，ACSF灌流管（聚乙烯）；F，O2输送管；G，温度控制接口；H，带网小室插入件。
图3. RC22浸没式记录室。 A，记录室。B，接地电极。C，吸液针。
图 4. 海马脑片示意图及细胞外波形。 A，用于电生理实验的横切海马脑片示意图。CA = 阿蒙角。DG = 齿状回。SC = 沙弗侧支。S radiatum = 辐射层。B，对 SC（CA3 轴突通路）进行电刺激会引发刺激伪迹，紧随其后的是突触前群体锋电位，即纤维群峰电位（FV）。FV 的幅度与被激活的 SC 纤维数量成正比。兴奋性突触后电位（EPSP）负相斜率直接反映 SC 末梢释放谷氨酸后，CA1 锥体神经元中去极化突触电流的激活情况。C，在“健康”（左图）、“不健康”和“高兴奋性”脑片中，于 CA1 辐射层记录到的代表性重叠细胞外波形，对应九种不同刺激强度（30–500 μA）。每个强度水平平均叠加五个波形。健康脑片在此刺激范围内表现出动态响应，并在较高刺激强度下出现单一正向群体锋电位（反映 CA1 神经元放电）。在 RC22 浸没式记录舱中，最大 EPSP 幅度通常为 1.5 至 3 mV。不健康脑片（中图）常表现出较大的 FV，但最大 EPSP 较小（< 1 mV），且通常表现出较差的可塑性。高兴奋性脑片（右图）在 EPSP 上升支中出现两个或更多再生性群体锋电位。高兴奋性脑片的反应通常不稳定，并且对 LTD/LTP 刺激的反应具有变异性。
图5. 在中年（16月龄）APP/PS1小鼠和老年（22月龄）Fisher 344大鼠的急性脑片上进行的代表性电生理实验。 图A-B显示了来自经对照腺相关病毒（AAV）载体（对照组）或本实验室开发的一种新型AAV试剂（试剂A）处理的APP/PS1小鼠的数据。与对照组脑片相比，经试剂A处理的脑片在EPSP:FV曲线上表现出明显的左移（A），提示突触强度增强。在给予两次持续1秒、100 Hz的刺激后，试剂A处理的脑片表现出显著且稳定的长时程增强（LTP）（B），而对照组脑片的LTP较弱，这是该动物模型的典型特征。图D-F显示了两只分别接受持续（4周）海马内灌注溶剂或一种新型抗炎药物（药物A）的老年大鼠所获得的数据。药物处理对基础突触强度影响相对较小（D）。然而，药物A在抑制长时程抑制（LTD）的诱导方面效果显著（E）。图C和F显示了在LTP/LTD刺激前（pre）和刺激后60分钟（post）从单个脑片记录到的代表性EPSP波形。注意：未显示刺激伪迹。
讨论
本方案中概述的步骤将有助于确保在老年大鼠中进行脑组织解剖的速度和效率至少与年轻成年大鼠相当。我们还提供了足够的细节，以便初学者能够自行建立长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的脑片研究。如果您的研究目标之一是进一步探索衰老和阿尔茨海默病（AD）对突触功能和可塑性的改变，那么上文提及的至少还有两个方法学问题值得进一步考虑。首先，已有多个实验室表明，Ca2+记录用人工脑脊液（ACSF）中的 Mg²⁺ 比例可显著影响海马脑片中突触可塑性的诱导2,10,24,25在哺乳动物脑脊液中，Ca2+Mg2+ 比值约为1（例如参见 26）。然而，ACSF Ca2+：在突触功能和可塑性的脑片研究中，通常使用接近2的Mg2+浓度比例。早期研究中，这种做法可能是为了优化长时程增强（LTP）的诱导，随后便成为所有可塑性研究中的常规操作。然而，在衰老和阿尔茨海默病（AD）研究中，这种做法可能存在问题，原因是已明确报道的神经元Ca2+ 调控。具体而言，Ca2+ 内流和/或 Ca2+诱导的 Ca2+-在神经元激活期间，衰老大鼠和/或阿尔茨海默病模型小鼠的释放升高3,27-31LTD的诱导对ACSF中Ca浓度的微小变化特别敏感2+ 水平。我们的方案使用 2 mM Ca2+ 且含有2 mM Mg2+的条件通常会导致老年动物出现LTD，而年轻成年动物则不会2，而使用 Ca 的研究2+：Mg2+ 比值接近2时，在无年龄差异的情况下，已在成年个体中观察到显著的长时程抑制（LTD）2,10 或与老年大鼠LTD减弱同时发生32这些观察结果强调了在考虑ACSF Ca时需格外谨慎2+ 以及在比较 Ca 时的 Mg2+ 水平2+依赖性可塑性在老年与年轻成年动物中的表现。
第二个方法学问题涉及长时程增强（LTP）对突触后去极化的高度依赖性33，以及突触强度在衰老或不同基因型之间可能存在的差异。在典型的LTP实验中，通常将基础状态和LTP诱导的刺激强度调整至产生半最大（或四分之三最大）兴奋性突触后电位（EPSP）幅度。潜在的问题在于，老年大鼠和APP/PS1小鼠通常与其年轻个体和/或野生型对照相比表现出突触强度降低，这意味着老年大鼠和APP/PS1小鼠的基础EPSP值也较小。较小的EPSP可能导致LTP刺激期间去极化程度降低，从而减少诱导LTP的概率33。由于这一潜在的混杂因素，难以确定这些动物存在的是信号传递能力缺陷、可塑性缺陷，还是两者兼有。也就是说，在老年动物和/或APP/PS1小鼠中，LTP的诱导机制本身可能是功能完整的（无可塑性缺陷），但在这些条件下受到的刺激不足（传递能力缺陷）。这一区分至关重要，因为信号传递机制与可塑性机制对特定药理学处理的反应可能截然不同。为尽量减少传递能力下降对LTP诱导的影响，我们在进行LTP刺激前，将所有脑片的EPSP幅度标准化至相同水平（例如1 mV）。其他策略也可能有效（例如在LTP刺激期间使用电压钳或电流钳技术使各组间的膜电位保持一致），在研究这些动物模型的LTP时应予以考虑。
披露
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AG027297、肯塔基脊髓与头部损伤研究信托基金的资助、以及克莱伯格基金会的捐赠支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| KH2PO4（单碱基） | Sigma-Aldrich | P5379-100G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| CaCl2（二水合物） | Sigma-Aldrich | C3306-250G | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | |
| C6H12O6（葡萄糖） | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| 表1. 所需试剂 | |||
| 锥形瓶 | Fisher Scientific | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
| 水族箱气泡发生器 | 用于培养基的氧合。大多数宠物商店均有售 | ||
| 50 mL 玻璃烧杯 | Fisher Scientific | 02-540G | 用于在ACSF中保存脑组织 |
| Parafilm封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 小型动物断头器 | World Precision Instruments, Inc. | DCAP-M | |
| 平铺纸巾 | |||
| #11 Feather手术刀片 | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| Beebee骨剪 | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Lempert咬骨钳 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8321 | 适用于大鼠 |
| Friedman-Pearson咬骨钳 | Fine Science Tools | 16020-14 | 适用于小鼠或大鼠 |
| 海马体取材工具 | Fine Science Tools | 10099-15 | |
| 勺子 | 塑料茶匙即可 | ||
| 刮刀 | Fisher Scientific | 21-401-25A | 刮刀 |
| 手术虹膜剪 | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | 13-711-43 | |
| 110 mm Whatman滤纸 | Fisher Scientific | 09-805E | Whatman货号 1001-110 |
| 玻璃培养皿 | Fisher Scientific | ||
| Leica VT1000P 手动振动切片机 | 振动切片机 | VT1000P | |
| 0.1 mm FA-10 Feather S刀片 | Ted Pella, Inc. | 121-9 | 0.1 mm FA-10 Feather S刀片 |
| 硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管（带橡胶吸头） | Fisher Scientific | 13-678-20A | 用于转移脑片：尖端折断并经热抛光以形成较大开口 |
| 35 mm 聚苯乙烯培养皿 | Corning | 430588 | 用于解剖后收集脑片 |
| 表2. 解剖所需工具和材料 | |||
| 孵育室 | 定制 | ||
| P-97 水平移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | ||
| 防振台 | Technical Manufacturing Corp. | ||
| 法拉第笼 | 定制 | ||
| 带底部侧臂的Pyrex抽滤瓶 | Corning | 1220-1L | |
| 带调节器的重力控制式静脉输液装置 | Baxter Internationl Inc. | 2C8891 | |
| 中央真空管线 | 大多数现代实验室均配备 | ||
| 95% O2 / 5% CO2 气体混合物 | Scott-Gross Co. | ||
| TygonTM 实验室管路（用于O2/CO2输送） | Fisher Scientific | 无毒、不氧化，有多种规格可选 | |
| Eclipse E600FN 显微镜 | Nikon Instruments | 配备10倍和40倍物镜、近红外滤光片以及GFP、DS-Red2滤光片 | |
| Cool Snap ES 数字相机 | Photometrics | Cool Snap ES 数字相机 | |
| X-Cite 荧光照明系统 | EXFO | X-Cite 荧光照明系统 | |
| 显微镜平台 | Siskiyou, Inc. | 定制组装 | |
| RC-22 浸入式记录室 | Warner Instruments | 64-0228 | 需搭配P-1平台和载物台适配器（Warner产品编号64-0277） |
| TC2BIP 2/3通道温度控制器 | Cell Microcontrols | ||
| 四轴手动微型操纵器 | Siskiyou, Inc. | ||
| 铂铱合金丝（0.002英寸） | World Precision Instruments, Inc. | PTT0203 | |
| A365 刺激隔离器 | World Precision Instruments, Inc. | A365 Stimulus Isolator | |
| Multiclamp 700b 放大器 | Axon Instruments | ||
| Digidata 1322A 模数转换器 | Axon Instruments | ||
| PClamp软件 | Axon Instruments | ||
| 个人计算机（Pentium 4） | Dell | ||
| 表3. 电生理实验设备和材料 |
参考文献
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