重组逆转录病毒的制备及B细胞感染

摘要

本文描述了一种在脾脏B淋巴细胞的ex vivo培养体系中对基因结构与功能进行高效分析的系统。该方法利用无辅助的嗜生态型包装细胞系进行重组逆转录病毒的生产，可在原代淋巴细胞中实现目的基因的稳定且可遗传的表达，从而诱导经历类别转换重组的B细胞产生表面抗体。

摘要

在真核细胞中进行基因的转基因表达是一种强大的反向遗传学方法，该方法通过异源表达系统调控目的基因的表达，从而便于分析其产生的表型。该方法可用于表达生物体中通常不存在的基因、表达基因产物的突变形式，或过表达基因产物的显性负性形式。该方法在造血系统研究中尤其有用，因为转录调控是B细胞发育与分化过程中的主要调控机制¹，相关综述见^2-4。

小鼠遗传学是研究人类基因和疾病的一种强大工具。对小鼠和人类基因组的比较分析显示，超过90%的基因组存在同线性保守⁵。此外，用于小鼠模型的许多技术也可应用于人类基因的研究，例如基因敲除和等位基因替换⁶。然而，构建转基因小鼠需要大量财力和技术资源。目前已有多个项目致力于建立基因敲除小鼠品系库（KOMP、EUCOMM、NorCOMM）或诱变小鼠品系库（RIKEN），这些工作需要大规模的协作与投入⁷。因此，在转向小鼠模型之前，最好首先在原代细胞的细胞培养模型中研究目标基因的表型。

逆转录病毒DNA倾向于整合到宿主DNA的转录单元内部或附近，或CpG岛区域，从而在避免转录沉默的同时，实现所包装目的基因的稳定且可遗传的表达⁸⁹。随后，这些基因在高效逆转录病毒启动子的调控下进行转录，从而实现高效的转录和蛋白质表达。因此，只要细胞处于有丝分裂的活跃状态，逆转录病毒表达系统即可用于那些难以转染的细胞。由于病毒的结构基因存在于包装细胞系中，用于克隆目的基因的表达载体不包含任何病毒结构基因，这不仅消除了病毒回复突变的可能性，也提高了操作病毒上清液的安全性，因为不会产生具有感染性的病毒颗粒¹⁰。

本文介绍了一种重组逆转录病毒的制备及其后续感染脾B细胞的实验方案。分离得到的脾细胞经培养后，使用Th细胞来源的淋巴因子和抗CD40抗体进行刺激，可诱导B细胞大量增殖与分化¹¹。该方案适用于研究B细胞发育与分化后期阶段的生物学事件，因为B细胞取自脾脏，处于造血初始事件之后、但尚未接受抗原刺激以诱导浆细胞分化的阶段。

方案

1. 脾脏B淋巴细胞的分离与刺激

1. 采集 2 至 3 月龄的 AID 缺陷型小鼠的脾脏¹²。脾脏的分离操作需在无菌条件下进行，器官暂时保存于含 15% 胎牛血清（FBS）的冷磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 将脾脏转移至无菌细胞培养操作台，加入 5 mL 含 2.5% FBS 的 PBS 进行匀浆。将匀浆液转移至 15 mL 离心管中。
3. 在 4°C 条件下，以 1000 rpm 离心 10 分钟，使匀浆后的脾组织样品中的细胞沉淀。
4. 离心后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 10 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，室温孵育 7 分钟，以去除红细胞污染。
5. 以 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于含 2.5% FBS 的 10 mL PBS 中。
6. 取 100 μL 细胞悬液，用台盼蓝染色后按 1:1000 稀释，使用标准血细胞计数板进行细胞计数，排除死细胞。每只脾脏可获得约 2000 万至 3000 万个细胞。
7. 以 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于含 2 mM EDTA 的 0.5% BSA/PBS 溶液中，浓度为每 90 μL 含 10⁷ 个细胞。
9. 向细胞中加入包被抗 CD43 抗体的磁珠，以特异性结合非 B 细胞。每 90 μL（10⁷ 个细....

讨论

如图1所示，此处所述的脾脏B细胞逆转录病毒转导是一种在B淋巴细胞研究中具有实用价值的遗传学方法，因为淋巴细胞生成过程中的许多发育事件均由转录调控所控制^{1, 2}。在B细胞成熟的后期阶段，通过CD40L的刺激对于诱导B细胞生长、进入细胞周期以及增殖至关重要^{11, 20}。如图2所示，B细胞可在体外通过抗CD40抗体和IL4刺激而发生显著增殖；逆转录病毒载体是用于过表达可能在B细胞发育这些阶段发挥作用的蛋白的有效工具。在图2所示的示例中，我们证明了无法进行类别转换重组（CSR）（此处为向IgG1转换）的AID缺陷型B细胞，可通过逆转录病毒导入小鼠AID基因而恢复该功能。该方法使我们能够追踪已发生CSR的GFP阳性细胞（见图1）（即IgG1+GFP+细胞）。

与小鼠模型相比，该方法具有优势，因为脾脏收获后不到一周即可完成，而建立转基因小鼠则需要更长时间。分析类型可根据研究者的具体应用进行调整；本文展示了通过流式细胞术分析类别转换重组的方法，如图2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FCS	Atlanta Biologicals	S11550
RPMI	Invitrogen	22400
PBS	Invitrogen	20012
红细胞（RBC）裂解缓冲液	Sigma-Aldrich	R7757
CD43 磁珠	Miltenyi Biotec
B细胞完全培养基	多种	多种组分	RPMI、15% FCS、1% 非必需氨基酸、1% 丙酮酸钠、1% HEPES、1% 青霉素-链霉素、50μM β-巯基–乙醇
IL-4
抗-CD40 抗体	BD Biosciences	553787
polybrene	Sigma-Aldrich	107689
氯喹二磷酸盐	Sigma-Aldrich	C6628	使用浓度为 100 mM
Ph–nix Eco 细胞（小鼠来源）	Orbigen	RVC-10002
PE-Cy5-α-小鼠-CD45R (B220)	eBioscience	15-0452-81
PE-α-小鼠-IgG1	BD Biosciences	A85-1