灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。
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摘要
摘要
肝脏是一个复杂的器官，需要持续的灌注以输送营养物质和氧气，并清除代谢废物，从而维持其存活1。迄今为止，采用自下而上的组织工程和微加工技术试图重建或模拟肝脏微结构的努力，由于这一设计难题尚未取得成功。此外，用于构建肝脏组织工程支架的合成生物材料在很大程度上受限于诱导组织再生和修复的能力，主要原因在于缺乏能够诱导正常细胞功能的特异性细胞结合基序2。另一方面，脱细胞化的天然组织（如血管3和皮肤4）已在组织工程中获得广泛应用，并为解决部分挑战提供了切实可行的方案。脱细胞化天然基质的优势在于其在一定程度上保留了原有的成分和微结构，从而促进细胞的黏附与重排5。
本研究中，我们描述了对肝脏进行灌注脱细胞的方法，以获得保留主要血管结构的完整肝脏生物支架。此外，我们还介绍了利用成年原代肝细胞对这些生物支架进行再细胞化的方法，从而构建出具有功能的肝脏移植物 体外，并具备移植所需的血管通路 体内.
方案
1. 肝脏脱细胞
- 使用18号导管经门静脉插管灌注并收获大鼠肝脏，保持下腔静脉和上腔静脉开放。将器官置于含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的10 cm培养皿中以保持湿润。
- 建立一个灌注系统，包括8升储液罐、蠕动泵和气泡捕获装置。
- 用磷酸盐缓冲盐水填充灌注系统，并持续运行10分钟。将PBS加入10 cm培养皿中，并将磷酸盐缓冲盐水的流速调低至1 mL/min。
- 小心地将收获的肝脏转移至盛有磷酸盐缓冲盐水的10 cm培养皿中。
- 继续用PBS灌注过夜。
- 开始使用含0.01% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）的蒸馏水进行灌注，持续5分钟。
- 用PBS灌注1小时。
- 重复步骤1.6和1.7共三次，每次逐步将SDS灌注时间延长至10、15和20分钟。
- 继续用0.01% (w/v) SDS溶液灌注24小时。
- 继续用0.1% (w/v) SDS溶液灌注24小时。
- 用0.2% (w/v) SDS溶液灌注3小时。
- 用0.5% (w/v) SDS溶液灌注3小时。
- 用蒸馏水灌注15分钟。
- 用含1% (w/v) Triton X-100的蒸馏水灌注30分钟，以去除所有结合的核酸。
- 为清洗脱细胞肝脏基质（DLM），使用PBS灌注2小时。
- 可选步骤：切除除中叶外的所有肝叶。
- 将DLM置于盛有PBS的洁净密封培养皿中，4oC保存直至使用（图1）。
- 对DLM进行灭菌处理：1) 用含0.1% (v/v) 过氧乙酸和4% (v/v) 乙醇的无菌PBS冲洗DLM，并在4oC孵育3小时；2) 用无菌PBS洗涤两次；3) 用含2%青霉素-链霉素、10 µg/mL庆大霉素和2.5 µg/mL两性霉素B的无菌PBS洗涤。将脱细胞肝脏置于相同溶液中，4oC保存，直至用于再细胞化实验。
2. 去细胞化肝脏基质的再细胞化
- 在无菌条件下建立一个灌注系统，该系统包括灌注室、蠕动泵和气泡捕获装置。向灌注系统中加入 200 mL 培养基，例如高糖 DMEM（Sigma）、10% 胎牛血清（Hyclone）、100 U mL-1 青霉素和 100 μg mL-1 链霉素（Invitrogen）。
- 将脱细胞肝脏基质置于灌注室中，并在泵以 5 mL/min 运行的同时，通过门静脉插管将脱细胞肝脏基质连接至灌注系统，以避免产生气泡。
- 使培养基通过脱细胞肝脏基质灌注 30 分钟。
- 从成年大鼠中分离原代肝细胞，细胞活力需至少达到 90%。
- 停止灌注系统的流动，通过气泡捕获装置缓慢注入 5000 万个肝细胞（溶于 1–3 mL 培养基中）至灌注系统内。
- 以 10 mL/min 启动流动，并使培养基循环 10 分钟。
- 重复步骤 2.5 和 2.6，直至总共向脱细胞肝脏基质中引入 2 亿个细胞（图 2）6。
- 当所有细胞均完成灌注后，将灌流液收集至四个 50 mL 离心管中，在 600 rpm 下离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀收集至同一离心管中。通过台盼蓝染色排除法测定细胞数量和活力，以评估接种效率。
3. 体外 脱细胞肝脏移植物的再细胞化培养
- 在无菌条件下建立灌注系统，该系统包括灌注腔室、蠕动泵、氧合器和气泡捕集器（图3）。向灌注系统中加入50 mL培养基，例如Williams' E培养基（Sigma）、5%胎牛血清（Hyclone）、0.5 U/mL肝素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。-1 胰岛素（Eli Lilly），20 ng/mL-1 EGF（Invitrogen），14 ng/mL-1 胰高血糖素（Bedford Laboratories），7.5 μg mL-1 氢化可的松（Pharmacia），100 U/mL-1 青霉素，以及 100 μg mL-1 链霉素（Invitrogen）
- 将重细胞化的肝脏移植物置于灌注 chamber 中，同时在泵以 5 mL/min 运行的条件下，通过门静脉插管将 DLM 与灌注系统连接，以避免产生任何气泡。
- 无菌条件下关闭灌流室并严密密封，以防止培养过程中发生泄漏。
- 将灌注系统转移至37℃的培养箱中oC 且含有 10% CO₂2 并将灌注流速增加至 15 mL/min。
- 将氧合器连接至 95% O₂2 和5% CO2 气体混合罐，并将气体流速设定为0.5升/分钟，以达到约400 mmHg的氧分压。
- 培养可持续长达10天，期间需每日更换培养基。可每日采集培养基样本，以监测移植物的肝功能指标，如白蛋白、尿素和总胆汁酸的分泌情况。培养期结束后，可取再细胞化肝脏移植物样本进行分子和组织学分析。
4. 典型结果：
大鼠肝脏的完全脱细胞过程采用所述方案约需72小时。所得基质保留了天然肝脏100%的纤维状胶原、50%的糖胺聚糖以及仅5%的DNA。表1)6基质的血管结构得以保留，这一点通过腐蚀铸型和扫描电子显微镜分析得到了证实（图4）。6DLM 内部血管微结构的存在使其细胞重悬效率达到 96%，并可实现后续灌注 体外 培养。再细胞化的肝脏移植物可培养长达10天 体外 并通过白蛋白、尿素和总胆汁酸分泌证实具有正常的肝脏功能（图5）6.
图1. 脱细胞过程结束时的脱细胞肝脏基质。（a）完整肝脏；（b）切除后的中叶。
图2. DLM再细胞化的示意图。
图3. 灌流系统设置 体外 脱细胞肝移植物的再细胞化培养。
图4. 脱细胞肝脏基质中保留了微血管结构。腐蚀铸型图像显示：a）正常肝脏，b）脱细胞肝脏，门脉系统（红色）和静脉系统（蓝色）血管结构。脱细胞肝脏基质（DLM）的扫描电子显微镜图像：c）血管，d）含有类似胆管的小血管的横切面（箭头所示）。比例尺：(a,b) 5 mm，(c,d) 20 μm。
图5. 脱细胞肝移植物中肝脏特异性功能的研究 体外 灌注培养。a) 白蛋白分泌（p = 0.5249），b) 尿素生成（p = 0.5271）和 c) 总胆汁酸分泌（p = 0.0114）。通过Friedman检验（α = 0.01）对10天培养期间实验组与对照组之间的差异进行统计分析。误差条表示标准误（n = 3）。
| 新鲜肝脏 | 脱细胞肝脏基质a | p-值 | % 新鲜肝脏 | |
| n = 4 | n = 8 | |||
| 胶原蛋白 | 0.07 ± 0.01 | 0.08 ± 0.03 | 0.56 | 114% |
| （毫克/克肝脏） | ||||
| 糖胺聚糖 | 73.1 ± 6.7 | 34.2 ± 2.9 | 0.004 | 47% |
| （毫克/克肝脏） | ||||
| DNA | 14.9 ± 5.6 | 0.44 ± 0.08 | 3.3 10-5 | 2.9% |
| （毫克/克肝脏） |
表1. 脱细胞肝脏基质与天然肝脏的生化组成对比。
a数值表示为均值 ± 标准误。
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讨论
灌注脱细胞方法在此描述可产生具有与天然肝脏相同宏观结构和血管微结构的完整肝脏支架。该支架的细胞外基质组成与天然肝脏相似。再细胞化方法可高效地将细胞重新植入支架，且细胞在过程中保持活性和功能 体外 测试了培养周期。通过向再细胞化的肝脏移植物中加入非实质细胞，我们设想该移植物可作为研究多种肝脏功能（如药物代谢、再生与发育）的平台。此外，由于移植物中存在血管结构，可通过与受体动物的血液循环系统连接进行移植，因此该再细胞化移植物具有潜在的临床应用价值。6.
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Jack Milwid 对设计工作的贡献 体外 灌注室。本工作由美国国立卫生研究院（US NIH）资助，项目编号R01DK59766和R01DK084053（授予M.Y.），R00DK080942（授予K.U.），美国国家科学基金会（US NSF）CBET-0853569（授予K.U.），以及Shriners儿童医院（授予B.E.U.，项目编号8503）。我们同时感谢Shriners儿童医院提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Masterflex L/S 数字驱动器 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | |
| Masterflex L/S 标准泵头 | Cole-Parmer | EW-07013-81 | |
| 气泡捕集器 | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 |
参考文献
- Kulig, K. M., Vacanti, J. P. Hepatic tissue engineering. Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
- Schechner, J. S. Engraftment of a vascularized human skin equivalent. FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 3/14/2011. Citeable Link.
A correction was made to Decellularization and Recellularization of Whole Livers. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.
