全肝脱细胞与再细胞化

摘要

灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。

摘要

肝脏是一个复杂的器官，需要持续的灌注以输送营养物质和氧气，并清除代谢废物，从而维持其存活¹。迄今为止，采用自下而上的组织工程和微加工技术试图重建或模拟肝脏微结构的努力，由于这一设计难题尚未取得成功。此外，用于构建肝脏组织工程支架的合成生物材料在很大程度上受限于诱导组织再生和修复的能力，主要原因在于缺乏能够诱导正常细胞功能的特异性细胞结合基序²。另一方面，脱细胞化的天然组织（如血管³和皮肤⁴）已在组织工程中获得广泛应用，并为解决部分挑战提供了切实可行的方案。脱细胞化天然基质的优势在于其在一定程度上保留了原有的成分和微结构，从而促进细胞的黏附与重排⁵。

本研究中，我们描述了对肝脏进行灌注脱细胞的方法，以获得保留主要血管结构的完整肝脏生物支架。此外，我们还介绍了利用成年原代肝细胞对这些生物支架进行再细胞化的方法，从而构建出具有功能的肝脏移植物 体外，并具备移植所需的血管通路 体内.

方案

1. 肝脏脱细胞

1. 使用18号导管经门静脉插管灌注并收获大鼠肝脏，保持下腔静脉和上腔静脉开放。将器官置于含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的10 cm培养皿中以保持湿润。
2. 建立一个灌注系统，包括8升储液罐、蠕动泵和气泡捕获装置。
3. 用磷酸盐缓冲盐水填充灌注系统，并持续运行10分钟。将PBS加入10 cm培养皿中，并将磷酸盐缓冲盐水的流速调低至1 mL/min。
4. 小心地将收获的肝脏转移至盛有磷酸盐缓冲盐水的10 cm培养皿中。
5. 继续用PBS灌注过夜。
6. 开始使用含0.01% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）的蒸馏水进行灌注，持续5分钟。
7. 用PBS灌注1小时。
8. 重复步骤1.6和1.7共三次，每次逐步将SDS灌注时间延长至10、15和20分钟。
9. 继续用0.01% (w/v) SDS溶液灌注24小时。
10. 继续用0.1% (w/v) SDS溶液灌注24小时。
11. 用0.2% (w/v) SDS溶液灌注3小时。
12. 用0.5% (w/v) SDS溶液灌注3小时。
13. 用蒸馏水灌注15分钟。
14. 用含1% (w/v) Triton X-100的蒸馏水灌注30分钟，以去除所有结合的核酸。
15. 为清洗脱细胞肝脏基质（DLM），使用PBS灌注2小时。
16. 可选步骤：切....

讨论

灌注脱细胞方法在此描述可产生具有与天然肝脏相同宏观结构和血管微结构的完整肝脏支架。该支架的细胞外基质组成与天然肝脏相似。再细胞化方法可高效地将细胞重新植入支架，且细胞在过程中保持活性和功能 体外 测试了培养周期。通过向再细胞化的肝脏移植物中加入非实质细胞，我们设想该移植物可作为研究多种肝脏功能（如药物代谢、再生与发育）的平台。此外，由于移植物中存在血管结构，可通过与受体动物的血液循环系统连接进行移植，因此该再细胞化移植物具有潜在的临床应用价值。⁶.

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L4390
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S 数字驱动器	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S 标准泵头	Cole-Parmer	EW-07013-81
气泡捕集器	Radnoti Glass Technology Inc.	130149