在接触耳蜗内毛细胞的传入神经树突上进行突触后记录：监测带状突触的多囊泡释放

摘要

在哺乳动物耳蜗内毛细胞带状突触处对听觉神经纤维树突进行全细胞膜片钳记录。

摘要

内毛细胞（IHC）与听觉神经纤维之间的传入突触为记录单个带状突触的突触后电活动提供了一个可进行电生理记录的可及位点^1-4。感觉细胞的带状突触可持续释放神经递质，其释放速率会随着IHC膜电位的分级变化而发生调节⁵。研究表明，带状突触通过多囊泡释放机制运作，即多个囊泡可同时释放，从而诱发不同幅度的兴奋性突触后电流（EPSCs）^{1, 4, 6-11}。目前，突触前带状结构的确切作用以及多囊泡释放的潜在机制仍不十分清楚。

内毛细胞（IHC）由10至20条听觉神经纤维支配，每条纤维通过一个无髓鞘的单一末端与IHC接触，形成一个单一的带状突触。与IHC接触的传入末梢体积较小（直径约为1 μm），使得能够以极高的时间分辨率进行记录。此外，该技术可被改进以同时记录突触前和突触后细胞，从而直接研究突触处的传递函数²。因此，该方法为研究神经递质释放的基本机制提供了手段，从多囊泡释放到感觉细胞中带状结构的神秘功能均可在此框架下探讨。

方案

1. 溶液

1. 溶液可预先配制。细胞外溶液可在 4°C 下保存长达一个月。内液溶液可分装后冷冻保存（-20°C）。实验开始前需确保溶液已恢复至室温。
2. 解剖液和细胞外记录溶液（mM）：5.8 KCl；144 NaCl；0.9 MgCl₂；1.3 CaCl₂；0.7 NaH₂PO₄；5.6 葡萄糖；10 HEPES；1 Na 丙酮酸盐，pH 7.4（用 NaOH 调节），300 mOsm。用于耳蜗内毛细胞（IHC）Ca²⁺ 电流分离时，细胞外溶液可按如下修改：5.8 KCl；114 NaCl；0.9 MgCl₂；1.3 CaCl₂；0.7 NaH₂PO₄；5.6 葡萄糖；10 HEPES；30 TEA Cl；pH 7.4（用 NaOH 调节）；300 mOsm。
3. 可在细胞外溶液中加入 1–2 μM 河豚毒素（TTX），以阻断电压门控钠通道，从而分离兴奋性突触后电流或电位（EPSCs 或 EPSPs）。
4. 细胞内记录溶液（mM）：20 KCl；110 K-甲磺酸盐；5 MgCl₂；0.1 CaCl₂；5 EGTA；5 HEPES；5 Na₂ATP；0.3 Na₂GTP；5 Na₂磷酸肌酸；pH 7.2（用 KOH 调节），290 mOsm；或 135 KCl；3.5 MgCl₂；0.1 CaCl₂；5 EGTA；5 HEPES；4 Na₂ATP；0.2 Na₂GTP；pH 7.2（用 KOH 调节），290 mOsm。用于耳蜗内毛细胞（IHC）Ca²⁺ 电流分离的细胞内溶液：135 CsMeSO3；13 TEA Cl；3.5 MgCl₂；2.5 Na₂ATP；1 EGTA；pH 7.2（用 CsOH 调节）；290 mOsm。该溶液可有效阻断较大的 K⁺ 电导，从而保留 Ca²⁺ 电流。

2. 制备分离组织的支撑架

1. 用于在记录过程中固定标本的改良盖玻片也可预先制备。
2. 在圆形玻璃盖玻片（8–12 mm）边缘处滴加一滴Sylgard（Dow Corning，Midland，MI）。将精细昆虫针（FST，货号26002-10）的粗端置于盖玻片上。用镊子将昆虫针紧压在玻璃表面，并靠近加热丝以固化Sylgard。

3. 制作电极

1. 每次实验当天新鲜制备电极，并将其存放于密闭容器中。每次制备需制作十至二十根电极。
2. 选择电极玻璃管；我们使用1 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管（WPI，Sarasota，FL，型号1B100F-4）。
3. 在多步拉制仪上设计程序，以拉制尖端直径约为2–3 μm的电极（在上述溶液中电阻约为6 MΩ）。我们使用Sutter P-87多步水平拉制仪或Narishige垂直PC-10拉制仪。
4. 小心地用Sylgard涂层覆盖电极杆部，尽可能靠近尖端。这可以降低移液管电容，减少记录噪声。
5. 使用带有加热灯丝的微加工仪（如WPI提供的设备）对电极进行火焰抛光。火焰抛光后的电极外尖端直径应约为1 μm（在上述溶液中电阻为10–15 MΩ）。移液管管壁厚度约为1/3 μm，外径大小应与待记录的传入末梢（afferent bouton）相近。
6. 若需进行同时记录：内毛细胞（IHC）电极应以相同方式制备（相同玻璃管、相同拉制程序），不同之处在于火焰抛光时应保留较大的尖端直径，约为3 μm（电阻为6–8 MΩ）。

4. 实验设置

1. 将细胞外液以及含有目标药物或毒素的测试溶液加入与重力灌流系统相连的腔室中。
2. 设置灌流条件，使灌流液体积约为 2 mL，并以约 1.5 mL min⁻¹ 的流速持续灌流。
3. 若实验过程中需使用局部灌流系统施加不同溶液，则将相应溶液注入储液器中，使溶液流经系统，并确保无气泡存在。

5. 解剖与样品制备

1. 随附的视频展示了对三周龄大鼠（Sprague Dawley，Charles River）耳蜗器官的解剖过程，该阶段的解剖难度高于更早期的出生后阶段。不同年龄大鼠记录的优缺点将在讨论部分进行评述。
2. 通过吸入异氟烷深度麻醉大鼠。当撤退反射消失且角膜反射显著减弱时，实施断头术。这些操作已获得约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会的批准。
3. 从断头的大鼠头部去除吻部和皮肤。将头部沿中线切开并移除脑组织，以暴露颞骨。
4. 取出双侧颞骨，并置于含有标准细胞外溶液的洁净解剖皿中。
5. 去除包裹颞骨的骨质，以暴露耳蜗。用一对镊子牢固地夹住颞骨基部，辨认圆窗和卵圆窗。调整耳蜗方向，使卵圆窗和耳蜗螺旋侧朝上，随后去除耳蜗周围的多余骨质。
6. 去除包裹耳蜗的骨质以暴露感觉上皮，操作时需特别保护将用于实验的顶回部分。使用第二对精细镊子从耳蜗表面逐块剥离骨质，起始位置选择较其余骨质更为透明的区域，此处骨质较薄，易于去除。继续去除顶回周围的骨质。
7. 使用显微解剖剪在顶回下方的蜗轴处剪开。随后将顶回与耳蜗下部各回分离。
8. 如有必要，再次使用显微解剖剪确保顶回完全切断。操作时注意保护顶回组织，避免牵拉或拉伸。使用精细镊子轻柔地将顶回从耳蜗其余部分分离出来。
9. 去除顶回两侧剩余的所有骨质。
10. 小心去除位于毛细胞区域外侧的血管纹（Schematic 1），即一条有光泽的组织条带。注意避免损伤感觉毛细胞，因其易随血管纹一同被撕脱。
11. 使用精细镊子分离位于感觉毛细胞上方的盖膜，即一层有光泽、半透明的膜状结构。
12. 现在用镊子修剪多余组织和骨质，并将标本压平。此步骤十分必要，以确保组织能均匀地置于固定针下。
13. 将标本置于固定在盖玻片上的固定针下（盖玻片事先已准备），注意将固定针远离毛细胞区域放置。
14. 用镊子将盖玻片转移至记录室。在转移过程中，确保耳蜗组织完全被一滴细胞外溶液覆盖。将盖玻片牢固压在记录室的玻璃底面上，以防止记录过程中发生移动。
15. 立即开始灌流细胞外溶液，以提高标本的存活率。

6. 记录

1. 使用10x和40x水浸DIC物镜通过显微镜目镜定位标本，并调整标本方向，使记录电极能够垂直于内毛细胞（IHC）侧壁的方向接近IHC。
2. 如果标本发生卷曲，导致IHC基部区域可视性受限，可使用记录电极将标本外缘轻压至玻璃盖玻片上，注意避免直接压迫IHC本身。
3. * 若使用幼年大鼠，在此阶段可使用清洁移液管（尖端直径约10–20 μm）去除毛细胞上方较厚的支持细胞层，以暴露感觉细胞^{1, 12}。
4. 通过显示器评估组织的健康状况。在显微镜与NC70 Newvicon相机之间使用4X放大镜头可进一步放大图像，使约4800 μm²的区域呈现在显示器上。健康的毛细胞应呈细长形，且静纤毛束完整；当组织退化时，毛细胞会肿胀，变得透明且呈颗粒状。
5. 定位内毛细胞（IHC）基部周围的传入神经末梢（boutons）。这些末梢呈球形或椭球形，直径约1 μm，颜色较浅，具有光泽。大多数末梢位于细胞核水平以下。当组织不健康时，末梢会肿胀至正常大小的约4倍，并变得透明而非有光泽。
6. 用细胞内液填充记录电极，施加正压，并使用显微操作器将电极移至标本处。
7. 用电极在IHC基部水平对标本进行切口。在支持细胞薄层与IHC之间推进电极，利用正压开辟一条通往IHC基部区域的通路。此步骤是成功到达传入神经末梢并避免记录到来自紧密包裹传入末梢的支持细胞信号的“关键”步骤。
8. 小心移出电极，并更换为一支新填充的电极。
9. 持续施加正压以保持电极尖端清洁，将电极经由已创建的通路移至IHC膜表面。正压有助于推开围绕IHC的支持细胞。
10. 在相邻的支持细胞间移动电极，朝向传入神经末梢（如随附视频所示）。另一种方法是沿IHC膜移动电极，直至电极尖端接触末梢。确保电极尖端正对传入神经末梢前方（由于移液管内正压存在，末梢与电极之间仍留有微小间隙）。与支持细胞和IHC膜相比，末梢对电极移动的阻力更大，实验者可通过手感“感知”末梢位置。
11. 上下移动移液管并轻推，确认末梢随之移动。这表明移液管尖端与末梢处于相同的Z平面。
12. 当电极紧贴传入神经末梢时，同时释放正压并施加负压，以形成GΩ封接。在传入末梢上形成GΩ封接的过程与在毛细胞上类似，封接形成可能迅速也可能缓慢。
13. 施加轻柔的负压脉冲，使电极内膜破裂，进入全细胞记录模式。
14. 若所记录细胞为传入神经末梢，在封接形成过程中监测测试方波脉冲时会出现小的电容性瞬变（见图1）。我们估计传入末梢的电容值为0.4–1.8 pF（见^{3, 4}）。若所记录细胞为IHC，则瞬变幅度通常为前者的3–5倍，具体取决于接入电阻。
15. 为确认所记录细胞为传入神经末梢，运行包含超极化与去极化电压阶跃的测试程序。传入纤维与IHC的电流-电压关系（IV曲线）具有细胞类型特异性，如图2所示（IHC常在试图记录传入末梢时被误接）。
16. 监测膜电位；传入纤维的膜电位通常约为-60至-65 mV。
17. 若所记录细胞并非传入神经末梢，应移出电极，并使用新填充的电极重复步骤8–13。每次尝试均需使用新电极。
18. 在整个记录过程中，通过施加电压阶跃监测串联电阻，以确保封接未闭合。若串联电阻升高，可尝试施加轻柔的负压脉冲或将电极轻微后撤。串联电阻通常约为30 MΩ。在分析突触活动时，我们舍弃串联电阻超过50 MΩ的记录。
19. 现在可记录突触活动（见图3）。传入纤维可能表现出自发活动，或需通过去极化毛细胞以激活神经递质释放。使用高钾浓度的细胞外液（例如40 mM）可使毛细胞去极化，通常可激活或增加递质释放频率。
20. 对于IHC与传入神经末梢的同步记录²，操作流程应作如下调整：完成步骤1至5。用适用于Ca²⁺电流分离的细胞内液填充IHC电极，并按步骤6操作。将用于IHC记录的电极置于目标IHC附近的“待命位置”。继续执行步骤6–14进行传入末梢记录。当传入电极进入全细胞模式后，再操作IHC电极。在持续施加正压的前提下，将第二支电极移向对应IHC的侧壁。应观察到IHC侧壁因压力产生凹陷，并确保支持细胞已与IHC分离。步骤12–13也可用于IHC记录。如步骤14所述，与传入纤维相比，更大的电容性瞬变是IHC记录的特征之一，此外还包括其特有的IV关系。建立同步记录后，应留出一定时间（3–5分钟，取决于串联电阻），使细胞内液充分扩散至IHC内。这将导致更大的Ca²⁺电流，原因是较大的K⁺电导被逐渐阻断。
21. 若需进行松封式细胞外记录，在步骤12中，不形成GΩ封接，而是在传入神经末梢上形成约30至50 MΩ的松封接。可通过在释放正压的同时施加较小的负压实现。图5展示了从P21大鼠传入末梢获得的细胞外记录示例。

7. 故障排除

1. 如果能够形成封接，但无法从贴附式记录过渡到全细胞记录，则可能是移液管内径过窄。
2. 如果无法形成高阻封接，则可能是移液管内径过大，导致整个突触小结被吸入电极内部。
3. 如果所有突触事件均较小且大小一致，则记录可能位于传入纤维外部。可通过检测在正膜电位下事件是否发生反转来验证；细胞内记录的兴奋性突触电流（EPSCs）会在正电位下发生反转。
4. 若在封接传入神经末梢时串联电阻持续偏高，可尝试在破膜进入全细胞构型前将移液管稍向后移动。此举有助于防止移液管堵塞和接入电阻过高。
5. 大胆调整移液管位置。可在不破坏传入纤维封接的情况下移动电极，以降低高串联电阻或避免移液管堵塞。在同时进行双记录时，内毛细胞（IHC）通常会被推向突触小结，此时可相应地调整传入纤维移液管的位置。

8. 代表性结果

图1. A-B。在保持电压为 -94 mV 的基础上施加 10 mV 去极化电压指令后，从传入神经纤维（A）和内毛细胞（IHC）（B）记录到的典型瞬态反应。由于移液管直径较窄且接入电阻较高，IHC 的记录（B）在全细胞记录条件下并不理想。此处展示该记录仅用于说明 IHC 与传入神经纤维之间电容性瞬态反应的差异，这有助于在形成全细胞构型时区分细胞类型。IHC 的全细胞电容性瞬态反应幅度通常比传入神经纤维的大约 5 倍。C-D。A 和 B 中瞬态反应在扩展时间尺度下的显示。C。传入神经反应的衰减可用双指数函数拟合。传入末梢的电容值由快速组分估算得出。

图2. 来自传入神经末梢（A）和内毛细胞（IHC）（B）的电流-电压（IV）关系曲线。IV关系记录自-84 mV的保持电位，以10 mV为增量，从-124 mV至+36 mV进行电压阶跃（标称电压）。部分迹线右侧标示了电压值。这些记录在5.8 mM细胞外KCl、室温条件下进行。两图标尺相同：500 pA，200 ms。
A. 出生后第19天（P19）传入神经纤维的IV关系曲线。在大多数电压阶跃期间可见兴奋性突触后电流（EPSCs）；EPSCs的反转电位正于+6 mV。该记录在河豚毒素（TTX）存在下进行，以阻断电压门控Na⁺电流。注意在超极化电压下出现缓慢激活的内向电流（I_h）。该电流在内毛细胞或支持细胞中均不存在，因此可作为所记录细胞为传入神经纤维的良好指标（见³）。B. P19内毛细胞的IV关系曲线。由于移液管直径较窄且接入电阻较高，该记录在表征内毛细胞电流方面并非理想状态，所记录电流也小于预期值。此处展示该记录仅用于说明：当尝试记录传入神经纤维时，内毛细胞与传入神经纤维的IV关系曲线可被明确区分。注意在正电位下出现快速激活的外向K⁺电流（箭头所示），随后为延迟整流型K⁺电流¹³。

图3. 在出生后第21天，于40 mM细胞外K⁺存在条件下记录自传入神经纤维的典型突触电流，以提高内毛细胞（IHC）的释放速率。室温环境下，加入TTX以阻断电压门控Na⁺电流。A. 刻度：200 pA，5 ms，注意兴奋性突触后电流（EPSC）大小和形状的可变性。有关EPSC特征的详细描述，参见⁴。B. A中标记的两个EPSC（#：多相性，o：单相性）在放大尺度下的展示：刻度：100 pA，1 ms。

图 4. 在出生后第10天的大鼠耳蜗离体标本中，同时记录内毛细胞（IHC）及其接触的传入神经末梢的电活动（另见²）。对 IHC 施加去极化电压阶跃可诱发神经递质释放，并在传入神经末梢中激活兴奋性突触后电流（EPSCs）。上部曲线： 用于 IHC 去极化的电压方案。钳制电位：-79 mV，50 ms 阶跃至 -29 mV。中部曲线： 从 IHC 记录到的L型Ca²⁺电流通常表现出轻微的失活现象，并在负电位下即可激活。底部曲线： 传入神经纤维在 IHC 去极化刺激下产生的突触电流。注意在持续50 ms的 IHC 去极化过程中出现的突触衰减现象。

图 5. A. 从出生后第21天的传入末梢记录到的细胞外记录示例。该记录在室温下进行，细胞外K⁺浓度为5.8 mM。此记录的信噪比在来自三周龄大鼠制备样本的记录中具有典型性。B. 从出生后第20天（P20）传入末梢记录到的细胞外事件的平均波形。该波形由10272个事件平均得到。

示意图 1. 大鼠耳蜗一个回旋的横截面视图，显示内毛细胞与外毛细胞、螺旋神经节、血管纹及盖膜之间的解剖关系。

讨论

该实验的关键步骤在于解剖。如果在解剖过程中组织被拉伸或损伤，传入神经纤维将无法存活。来自较年轻大鼠的组织更具弹性，操作容错性更高。我们发现出生后第10至11天的大鼠最易于解剖，且实验成功率较高。耳蜗在出生后经历显著的成熟过程，大鼠大约从出生后第12天开始具备听觉能力¹⁴。因此，在解剖最为容易的年龄段，突触可能尚未完全成熟⁴。

本文所述的大鼠解剖方法基本上也适用于小鼠，主要区别在于小鼠耳蜗的尺寸更小。该技术可用于研究转基因修饰小鼠中带状突触的特性¹⁵。对该技术的进一步改进包括：在细胞内溶液中添加荧光染料以标记神经纤维³；对突触前内毛细胞与突触后传入神经末梢进行成对记录，从而确定突触前与突触后细胞之间的传递函数²；以及在传入神经末梢处进行封接较松的细胞外记录，以避免细胞完整性受损。相比全细胞记录构型，细胞外记录构型更容易实现，且实验持续时间通常更长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气浮台	TMC
带xy平移台的直立式Gibraltar载物台	Burleigh
Axioscope FS2直立显微镜，微分干涉差（DIC）光学系统，绿色滤光片	Carl Zeiss, Inc.
带控制器的新维康摄像机	Dage
监视器	Dage
Multiclamp 700B（或类似型号）	Molecular Devices
Digidata 1322A（或类似型号）	Molecular Devices
MP285显微操作器	Sutter Instrument Co.
六通道阀式局部灌流系统（配合手工制作的灌流移液管使用）	Warner Instruments
配备采集软件（PClamp）的计算机	Molecular Devices
以上为用于记录传入神经末梢电生理信号的实验装置配置。