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社会互动行为评估

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DOI：

10.3791/2473

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2011年2月25日

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1Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Toronto Centre for Phenogenomics, Mount Sinai Hospital, 3Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 4Department of Psychology, University of Toronto, 5Department of Psychiatry, University of Toronto

本文内容

摘要

本文详细描述了利用克劳利（Crawley）的社会性及社会新颖性偏好测试对小鼠社会行为进行检测的实验方案。我们介绍了该方法的优势及其可能的应用，并包括了对正确解读实验结果至关重要的关键细节。

摘要

社会互动是许多物种生物学中基本且具有适应性的组成部分。社会识别对于定义社会的网络和关系的结构与稳定性至关重要。对于小鼠等动物而言，识别同种个体可能对维持社会等级和配偶选择具有重要意义1。

多种神经精神疾病均表现出社会行为和社会识别能力的障碍，包括抑郁症、自闭症谱系障碍、双相情感障碍、强迫症以及精神分裂症。对人类以及动物模型（例如黑腹果蝇 Drosophila melanogaster、秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans、小家鼠 Mus musculus、挪威大鼠 Rattus norvegicus）的研究已鉴定出参与调控社会行为的基因2。为评估动物模型中的社交能力，研究人员已开发出多种行为学检测方法（详见文献3综述）。结合动物模型与适当的社会行为检测手段开展整合性研究，有望推动针对社会性精神病理障碍的更有效治疗方法的开发。

被称为Crawley社会性及社会新奇偏好范式的三箱实验已被成功用于研究多种近交系和突变小鼠品系的社会亲和力与社会记忆（例如4-7）。该实验的基本原理基于受试小鼠在两个实验阶段中自由选择进入三箱装置的任意一个隔室，并与一个或两个陌生小鼠进行间接接触。为了量化实验小鼠的社会倾向，主要任务是测量：a）与陌生同种个体共处的时间；b）对陌生同种个体相对于熟悉同种个体的偏好程度。因此，该实验设计可分别评估社会行为中两个关键但可区分的方面，即社会亲和力/动机以及社会记忆与新奇性识别。“社会性”在此定义为小鼠倾向于与另一只小鼠共处，而非独自待在另一个相同但空置的隔室中7。“社会新奇偏好”则定义为小鼠倾向于与先前未接触过的个体共处，而非与已熟悉的个体共处7。该实验可提供可靠的结果，但这些结果必须经过仔细分析、解释，并通过其他独立的社会性行为测试加以支持或验证。除了特定研究应用外，Crawley社会性测试还可作为突变小鼠一般行为筛查中的重要组成部分。

方案

1. 仪器与房间设置：

  1. Crawley 社交性与社交新颖性偏好实验的装置由一个矩形三室箱组成。每个室的尺寸为 19 × 45 cm，隔板由透明有机玻璃（Plexiglas）制成，中间留有开口，允许实验动物自由进入各个 chamber。
  2. 使用两个相同的、带可拆卸盖子的金属丝网杯状容器，其大小足以容纳一只小鼠。将这两个容器垂直放置在装置内，分别位于两侧 chamber 中，用于容纳未经接触的陌生小鼠。每个容器由金属丝构成，允许容器内外空气流通，但网孔足够小，以防止容器内动物与外部动物发生直接身体接触。
  3. 行为学测试应在上午 9:00 至下午 6:00 之间进行。
  4. 实验房间的常规照明强度为 650 lux。
  5. 使用 Observer 6.0（Noldus）软件（或功能相当的替代软件）来监测和记录第 4.3 节中提到的观察及后续参数。
  6. 每次试验结束后，需先用 70% 乙醇清洁所有 chamber（在不同小鼠之间），再用 Clidox 1:5:1 清洁（在不同笼具之间），以分别避免嗅觉线索干扰并确保充分消毒。
  7. 进行观察的人员必须距离装置至少 2 米。

2. 动物准备：

  1. 每笼饲养3至5只小鼠，饲养环境为12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为上午7:00） 随意摄取 根据当地动物护理委员会的指导方针和规程中规定标准与要求，提供食物和饮水。
  2. 在首次试验开始前30分钟，将所有装有小鼠的笼子转移至行为学实验房间。
  3. 本实验需要两类小鼠，一类作为对照，即未经处理或“未熟悉化”的动物，另一类为测试对象。对照小鼠应选择与受试小鼠背景相同（通常为C57BL6）、年龄相近（通常为8–12周龄）、性别和体重相似，且此前无任何接触（非同窝仔鼠）的小鼠。每次实验需准备两只对照小鼠，分别用于第I阶段和第II阶段。不同试验之间可重复使用相同的对照小鼠。

3. 习惯化（适应）：

  1. 使用分隔用的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）墙将右侧和左侧隔室隔开。
  2. 将空的金属丝 containment 杯放置在右侧和左侧腔室的中央（每个位置各一个）。
  3. 将实验小鼠置于中央腔室的中心位置以进行适应。
  4. 适应环境 5 分钟。

4. 测试的社会亲和力方面（第一阶段）：

  1. 将一只对照小鼠（“陌生小鼠1”）放入位于一侧腔室内的金属丝笼中。在不同实验轮次中，系统性地交替“陌生小鼠1”放置于左侧或右侧腔室的位置。
  2. 移除各隔室之间的隔板，使实验小鼠可自由进入三个腔室中的任意一个进行探索。
  3. 立即开始监测并记录以下参数：
    1. 持续时间以及
    2. 实验小鼠与放置或未放置“陌生小鼠1”的金属丝笼之间发生的直接（主动）接触次数，分别针对每个腔室进行记录。当实验小鼠身体接触金属丝笼，或其身体伸展至笼周围3–5 cm范围内时，记为一次主动接触；
    3. 持续时间以及
    4. 实验小鼠在每个隔室内的其他行为次数，包括行走、自我理毛、静止不动超过5秒（“僵直”），以及跳跃、重复性行为等异常行为；
    5. 持续时间以及
    6. 进入每个隔室的次数。当小鼠的头部和四只脚均进入某一腔室时，视为已进入该腔室。
  4. 第I阶段实验时长为10分钟。

5. 测试的社会新颖性/偏好阶段（第二阶段）：

  1. 在另一侧腔室（即第一阶段中为空的腔室）内，放置第二只对照小鼠（“陌生小鼠2”）于一个相同的金属丝 containment cup 中。监测与4.3节中所述相同的参数，区分受试小鼠在陌生小鼠1与陌生小鼠2存在时的行为差异。
  2. 第二阶段的持续时间为10分钟。

6. 统计学分析：

  1. 使用 Origin 6.0 程序（或合适的替代软件），根据记录的数据分析以下参数：
    1. 实验小鼠与空容器杯之间，以及实验小鼠与容纳“陌生鼠1”（Stranger 1）的容器杯之间的总接触次数；
    2. 实验小鼠与空容器杯之间，以及实验小鼠与容纳“陌生鼠1”（Stranger 1）的容器杯之间的总接触持续时间（在第 I 阶段）；或实验小鼠与容纳“陌生鼠1”（Stranger 1）的容器杯之间，以及与容纳“陌生鼠2”（Stranger 2）的容器杯之间的总接触持续时间（在第 II 阶段）；
    3. 每次接触的平均持续时间；
    4. 其他行为的总次数和持续时间（如静止不动、自我理毛、行走等）；
    5. 实验小鼠在每个区域所花费的总时间。
  2. 通过比较以下各组，分析上述各项参数之间的显著性差异：
    1. 野生型（WT）实验小鼠对“空”容器杯与“陌生鼠1”（Stranger 1）的比较；
    2. 实验小鼠（如基因敲除、转基因或药物处理小鼠等）对“空”容器杯与“陌生鼠1”（Stranger 1）的比较；
    3. 野生型（WT）实验小鼠对“陌生鼠1”（Stranger 1）与“陌生鼠2”（Stranger 2）的比较；
    4. 实验小鼠（如基因敲除、转基因或药物处理小鼠等）对“陌生鼠1”（Stranger 1）与“陌生鼠2”（Stranger 2）的比较。
  3. 将上述各参数的数据集分别以第 I 阶段：野生型（WT）与实验小鼠；第 II 阶段：野生型（WT）与实验小鼠的形式呈现，如图 1(A 和 B) 及图 2(A 和 B) 所示。

还应考虑其他有助于标准化该测试的参数，例如识别小鼠特定行为模式（如嗅探、理毛、摩擦、打斗、骑跨）的先前经验，这些行为在很大程度上依赖于主观的个人观察。在测试期间负责记录行为参数的人员应不了解基因型或处理条件，相关信息应在之后解码。

7. 典型结果：

社交互动测试的两个步骤示例如图1和图2所示。测试的第一阶段可用于评估受试小鼠的社会亲和性及社交动机。在此阶段中，陌生小鼠被置于一个圆形金属丝杯内，该杯允许鼻部接触，但可防止小鼠之间发生打斗。这些条件确保了社交接近行为由受试小鼠主动发起，且仅为探究性行为，不涉及直接的身体接触。受试小鼠可选择在放置陌生小鼠的围栏杯周围停留更长时间，或通过移动至放置空杯的区域来避免任何接触。除靠近陌生小鼠的时间长短外，还可使用其他参数，如个体接触次数，进行进一步分析。

通常，野生型动物在陌生鼠1所在区域停留的时间显著长于在空杯所在区域的时间（图1A），表明其具有正常的社交能力、社交动机和亲和性。例如，在GSK-3α基因敲除小鼠中，动物在空杯区域与在含有陌生鼠1的杯子区域所花费的时间之间无显著差异（图1B），表明该动物模型的社交能力受损6。

测试的第二阶段旨在评估社交新颖性与社交记忆。在此部分，实验小鼠可自由选择与此前已接触过的陌生小鼠（Stranger 1）或一只新的陌生小鼠（Stranger 2）进行互动。通常情况下，野生型动物能够记住此前与 Stranger 1 的接触经历，在本阶段更倾向于花费更多时间与新出现的小鼠（Stranger 2）互动，表明其具有完整的社交记忆以及对新奇经历的偏好（图 2A）。

与野生型小鼠不同，GSK-3α突变型动物在第二阶段（图2B）中对新引入小鼠（陌生鼠2）所在区域并未表现出优于已熟悉小鼠（陌生鼠1）所在区域的偏好。该实验中基因敲除小鼠表现出的无差别行为提示其社交动机及对新奇性的反应降低。

比较野生型与基因敲除型在空笼和陌生小鼠环境中的停留时间；行为学研究结果。
图1. 第I阶段：社会亲和性与社交行为。在含有陌生小鼠的区域（“陌生侧”）与相对区域（“空侧”）中小鼠停留时间的平均值（±标准误）。与野生型雄性小鼠（A）不同，基因敲除型（KO）动物（B）未表现出对社交接近的偏好，在两个区域中停留时间相近。***p ≤ 0.0001，见于野生型组。

条形图比较野生型和基因敲除小鼠在“陌生小鼠测试”第二阶段的社会互动持续时间。
图 2. 第二阶段：社会记忆与新颖性偏好。小鼠在社会性阶段的陌生小鼠（“陌生小鼠1”）所在区域以及另一侧新陌生小鼠（“陌生小鼠2”）所在区域的平均停留时间（±标准误）。与野生型（WT）雄性小鼠（A）不同，基因敲除（KO）小鼠（B）未表现出对社会新颖性的偏好，在两个区域的停留时间相同。***WT组中 p ≤ 0.0001。

讨论

Mus musculus 是一种社会性物种，会进行高水平的相互社交活动、群居筑巢、交配和育幼行为、领地标记以及攻击性行为8-10。目前已开发出多种用于检测小鼠社交行为的实验方法（详见综述3）。本文介绍一种广泛使用的小鼠社交性评估实验。克劳利（Crawley）社交性与社交新颖性偏好测试最初由克劳利及其同事建立7, 11。三箱实验范式具有多项优势，可在相似操作流程下提高对社交性、社交亲和性、社交记忆及偏好的检测数据可靠性。该测试的主要特点在于实验设计：将一只实验动物此前未接触过的陌生小鼠置于金属网杯下方，使其无法自由移动。这种方法可防止直接身体接触，避免打斗和/或攻击行为的发生，但仍允许感官交互（嗅觉、视觉、听觉、味觉）。在此条件下，实验小鼠可自主发起或终止互动，在整个测试过程中始终拥有选择权：在第一阶段可选择接近陌生小鼠或空容器；在第二阶段可选择接近熟悉小鼠（陌生者1）或新来的陌生小鼠（陌生者2）。例如，在单箱社交互动测试中，实验小鼠与陌生个体同处一个空间，由于双方均可自由活动，前述主动的身体接触往往占主导地位且无法避免。而三箱装置远大于典型的单箱设备，使实验小鼠能够选择靠近或远离陌生小鼠。因此，克劳利社交性测试的应激水平较低，主要来源于将实验小鼠置于新环境所带来的影响，这使得该测试可在不同时间点重复进行，例如在同一组小鼠的不同年龄阶段（幼年期与成年期）进行比较。通过比较年轻组动物与其同批但年龄较大的群体，可以追踪并区分社交识别能力受损与社交记忆和/或认知功能障碍，这些差异可在第二阶段观察到，并与年龄相关的生理变化相关联。

该检测相对耗时（每只小鼠约40分钟），这是其缺点。然而，可对多个特定参数进行监测并记录（手动和/或视频），从而实现可靠的分析。例如，一些额外的参数，如静止不动（freezing）和/或自我理毛行为，可能提示焦虑程度增加以及社交行为动机降低。通过使用相同的实验方案，可在次日用同一只“陌生小鼠1”（Stranger 1）对小鼠进行重测，以排除社交焦虑的影响。其他参数（如甩尾、啃咬放置“陌生小鼠1”的金属丝笼）有助于区分对新动物表现出的攻击性行为与异常友好的行为。观察到的焦虑表现可能源于小鼠对实验环境适应不良、实验室内光照过强、小鼠健康状况差，或由基因修饰和/或新奇恐惧（neophobia，见于某些基因敲除模型）所致。此外，习惯化能力受损可能提示认知功能障碍，并可能影响第二阶段实验的结果。在对小鼠进行本实验之前，应对动物进行一般健康状况和神经系统筛查，包括体温和体重测量、被毛检查，以及以下一系列反射检查：触须反射（Whisker）、翻正反射（Righting）、耳弹反射（Ear-Twitch）、抓握反射（Reaching）和钥匙叮当反射（Key Jangling）（详见12-15）。其他行为学检测有助于区分特定反应。接触次数增加和/或主动接触总时长增加可能与特定小鼠品系的多动行为相关，可通过旷场实验（open field test）检测运动活性加以验证。接触时长减少和/或接触次数减少可能与抑郁样和/或焦虑样行为相关，可通过强迫游泳实验（FST）、悬尾实验（TST）或高架十字迷宫（EPM）、零迷宫（zero-maze）、明暗箱实验（light/dark tests）分别进行评估（详见6, 13, 15）。

一旦施加了适当的条件并观察到显著差异，就需要进行后续实验以验证研究结果。嗅觉在啮齿类动物的社会识别中起着关键作用，因为化学诱导的嗅觉缺失或犁鼻器的移除均会阻碍个体识别16, 17。小鼠倾向于嗅探新的气味，随后迅速对其新异性产生习惯化。此时可采用嗅球检测方法来实现这一目的（详见于6, 7）。

三室社交行为测试还存在一些改良和替代性应用方式，例如通过检测雌性受试动物在装有其幼崽的杯子附近停留的时间（反映母性动机），来评估母性行为；此外，还可通过在第1阶段会话中用杯子下的异性（而非“陌生者1”）来评估被测雄性/雌性动物对异性的反应，从而衡量其性动机7, 11。

还可采用其他方法或范式来检测小鼠的社交行为，例如在饲养笼内或新环境中进行社交互动（单室社交互动实验）、居民-入侵者实验、隔板实验、社交趋向实验、相互社交互动等（详见3, 18）。超声波和声波范围内的发声、视觉线索、味觉以及触觉等感官模式也可能参与信息传递和社交联结（综述见19）。

社交能力受损和社会行为失调被认为是多种精神疾病的核心特征。例如，自闭症谱系障碍和精神分裂症均表现出显著的社会认知与社会行为缺陷20，而社会关系的破坏会增加患抑郁症的风险21。因此，本文所述的检测方法可用于上述疾病的动物模型研究。此外，该检测还可用于评估药理学化合物对社交能力的潜在影响（详见文献3, 22-24）。

致谢

OKB 和 JRW 撰写了本文。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）资助项目 MOP 74711（资助给 JRW）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 乙醇（商用酒精）MSH19901
Clidox 1:5:1 基液 活化剂Pharmacal96130F 95130F1 份基液加 5 份水加 1 份活化剂

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