本文描述了测试秀丽隐杆线虫（C. elegans）关联学习以及短期和长期关联记忆的方法。这些群体实验利用了线虫向挥发性气味物质趋化的能力，通过将食物与趋化吸引剂丁酮配对，使线虫形成正向关联。增加训练周期的次数可诱导形成长期记忆。
本文内容
摘要
摘要
对经历和所学信息的记忆对于生物体做出有利于其生存的选择至关重要。C. elegans 通过特定神经元对食物和化学气味的感知来导航其环境1, 2，并能够将营养状态与化学气味3、温度4以及食物来源的致病性5相关联。
本文介绍了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的关联学习以及短期和长期关联记忆的检测方法。我们对一种已有的厌恶性嗅觉学习范式6进行了改良，使其产生正向反应；该检测方法包括将约400条线虫饥饿处理后，在AWC神经元感知的挥发性化学吸引物丁酮存在的情况下进行喂养，丁酮浓度选择为仅引起较低趋化指数的水平（类似于Toroyama et al.7 的方法）。随后通过标准的群体趋化性检测1，可在训练后立即或数分钟至数小时后检测线虫对气味物质的趋化吸引力。
经过条件化处理后，野生型动物对丁酮的趋化性增加约0.6个趋化指数单位，即其“学习指数”。这种联合学习依赖于训练过程中食物与丁酮的同时存在。将食物与丁酮配对进行一次条件化处理（“集中训练”）可产生持续约2小时的短期联合记忆。而多次条件化处理并中间间隔休息期（“分散训练”）则可形成长期联合记忆（<40小时），该过程依赖于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）6，CREB是一种在多种物种中均必需的长时程记忆相关的转录因子8。
本方案还包括用于快速、准确测定趋化性指数的图像分析方法。通过MatLab中的线虫计数软件，采集并分析趋化性实验平板上动物的高对比度图像。该软件采用形态学顶帽变换校正背景不均匀问题9。随后使用Otsu方法确定阈值，以区分线虫与背景10。软件自动去除极小颗粒，通过手动选择去除较大的非线虫区域（如平板边缘或琼脂打孔区域）。接着，软件通过忽略超过指定最大尺寸的区域，并计算剩余区域的中位尺寸，来估算单条线虫的大小。最后，将被识别为线虫占据的总面积除以单条线虫的估算尺寸，从而估计线虫数量。
我们发现，学习能力以及短期和长期记忆可以被区分开来，且这些过程与高等生物共享相似的关键分子。6,8 我们的检测方法能够快速验证在 C. elegans 中影响学习以及短期或长期记忆的新候选基因或分子，这些发现具有跨物种的相关性。
方案
C. elegans 的关联学习与记忆检测需要提前准备。有关建议的准备时间表，请参见图 1A 所示的时间线。还需注意，线虫的记忆可能受到物理扰动的影响（如剧烈移液、离心、涡旋），而 naïve 化学趋向性可能因环境中过强的气味（如香水等）而受到干扰。
1. 检测前动物的准备
- 采用标准方法，在接种了1 mL OP50 E. coli 的100 mm高生长培养基（HGM）平板上培养线虫（HGM配方见第7.1节）11。
- 对至少两个成年 gravid 线虫密集生长的HGM平板进行次氯酸盐处理，以获得大量同步化的卵群体。
注意：为获得最佳产量，建议先对第一代进行漂白以获得高度同步化的群体，然后对第二代在成虫第2天进行漂白，以获取后续步骤所需的卵。 - 将每份经次氯酸盐处理后获得的卵均匀分配至3–4个接种了1 mL OP50 E. coli 的HGM平板上。
注意：必须保证线虫有充足的新鲜食物，因为饥饿会影响嗅觉实验的结果。 - 将线虫在20°C条件下培养约72小时，此时间为线虫发育至年轻成虫阶段所需的时间。
2. 预处理饥饿
- 再次检查你的 HGM 平板中的年轻成虫，确保线虫仍有充足的食物，以及每个检测平板中的线虫数量足够（每平板 ≥ 200 条线虫）。
- 用M9缓冲液冲洗HGM平板上的线虫11 转移到15 mL锥形管中。为在洗涤过程中尽量减少扰动，可将几毫升M9缓冲液轻轻倒入HGM平板，轻轻旋转平板，使线虫从黏附的OP50细菌上脱离。接着倾斜平板，用P1000移液器从平板角落吸取M9缓冲液/线虫混合液，转移至15 mL锥形管中。若平板上仍有残留线虫，重复此步骤1–2次。
注意：粗略清洗会将细菌从培养板上冲下，从而进入含有线虫的离心管中。这些细菌难以完全去除，可能干扰后续检测。 切勿将蠕虫吸液时撞击管壁，因为这可能会损伤线虫并干扰实验结果。 - 让蠕虫通过重力沉降切勿离心）。用真空抽去上清液，并加入至少3-4 mL M9缓冲液洗涤。重复操作两次，共洗涤3次。
注意：洗涤过程中进行离心会将残留的细菌沉淀至线虫群体中，可能干扰后续实验。相反，应直接将 M9 缓冲液轻轻加入 15 mL 圆锥形离心管中进行后续洗涤。加入 M9 缓冲液后，应使沉降至管底的线虫重新悬浮并混匀。若线虫仍沉降于底部，可轻轻颠倒试管以混匀。 - 第三次洗涤后，取部分线虫群体用于 naive 趋化性实验（第 5 节）。
注意：所有洗涤步骤均需迅速操作，因为若蠕虫在M9缓冲液中停留过久，将开始饥饿，从而增加对丁酮的先天趋化性。 - 向15 mL离心管中加入3-4 mL M9缓冲液，将线虫在室温下于M9缓冲液中饥饿处理1小时（图1B、C）。
3. 短期联想记忆（密集）训练
短期关联记忆检测流程见图1B。
- 在 M9 缓冲液饥饿阶段结束时（第 2 节），用移液器在已接种 500 μL OP50 E. coli 的 60 mm 线虫生长培养基（NGM）11 培养皿盖内侧划线涂抹 2 μL 的 10% 丁酮（溶于 95% EtOH 中）。
注意：进行短期和长期记忆检测时，合适的起始线虫种群数量应 ≥ 500 μL。每种基因型需要多个训练培养皿，以在训练期间维持整个种群。操作挥发性化学品时，仅在必要时打开培养皿盖，其余时间应始终保持关闭。 - 通过真空抽吸去除装有饥饿线虫的 15 mL 离心管中的 M9 缓冲液上清，使用 P1000 移液器将 100–200 μL 线虫转移至训练培养皿中。
注意：应尽可能去除 M9 液体，以便线虫在转移至训练培养皿后能迅速接触到 OP50 食物来源。线虫容易黏附在移液枪头内壁，可通过分次移取较小体积来减少损失并提高回收率。 - 将训练培养皿在室温下孵育 1 小时（图 1B）。
- 用约 1 mL M9 缓冲液将线虫从培养皿上冲洗至 15 mL 离心管中。让线虫依靠重力自然沉降。重复清洗 1–2 次，直至离心管中的 M9 缓冲液变得澄清。
注意：采用第 2 节中描述的轻柔清洗方法。可继续使用第 2 节中使用的同一支 15 mL 离心管。 - 最后一次清洗后，通过真空抽吸去除 M9 缓冲液上清，并取部分线虫用于趋化性检测（第 5 节），以评估训练后立即（0 分钟时间点）对食物-丁酮关联的1 次（集中式）联想学习。
学习指数（LI）= CI0 hr - CINaive。 - 将剩余的线虫种群转移至接种了 500 μL OP50 的 60 mm NGM 培养皿（保存培养皿）。每皿仍加入 100–200 μL 线虫，以确保有足够的细菌支持种群生长。
注意：每种基因型所需的保存培养皿数量至少应等于待检测的短期联想记忆时间点数。 - 将训练后的培养皿在室温下孵育 0.5、1 或 2 小时（短期联想记忆时间点）（图 1B）。
注意：野生型动物的短期联想记忆在训练后 2 小时内消失。不同基因型或实验条件下可能需要调整时间点。 - 为检测食物-丁酮关联的短期联想记忆，在每个时间点后，轻柔地将线虫从培养皿上冲洗至 15 mL 离心管中，并用 M9 缓冲液再清洗 1–2 次。随后用于趋化性检测（第 5 节）。学习指数（LI）= CITime point - CINaive。
注意：采用第 2 节中描述的轻柔清洗方法。每个时间点实验后，丢弃未用于趋化性检测的多余线虫。
4. 长时间关联记忆（间隔式）训练
长期关联记忆检测流程见图1C。
- 按照第3节中的步骤3.1-3.2操作。
- 将诱导板在室温下孵育30分钟（图1C）。
- 按照第3节中的步骤3.4操作。
注意：为了控制在30分钟的时间范围内，可在训练开始约25分钟时开始所有洗涤步骤。 - 最后一次洗涤后，通过真空抽吸去除M9上清液，并将线虫转移至未接种的60 mm NGM平板。
注意：此步骤无需为每种基因型使用多个平板，因为线虫将处于饥饿状态。 - 在室温下于60 mm NGM平板上饥饿处理30分钟（图1C）。
- 用M9缓冲液将线虫洗涤至15 mL离心管中。让线虫依靠重力自然沉降（切勿离心）。
注意：尽管此时缓冲液中应无细菌存在，但离心可能对线虫造成潜在损伤，并可能干扰长期记忆的形成。 - 重复步骤4.1-4.6数次，直至完成总共7个诱导周期和6个饥饿周期（图1C）。（参见表1中的代表性时间表。）
- 轻轻用M9缓冲液将线虫从平板上冲洗至15 mL离心管中，并再重复洗涤1-2次。
- 最后一次洗涤后，取部分线虫群体进行趋化性实验（第5节），以检测诱导结束后立即形成的7次（间隔式）食物-丁酮关联学习（0小时时间点）。学习指数（LI）= CI0 hr - CINaive。
- 将剩余的线虫群体转移至接种了1 mL OP50的大肠杆菌的100 mm HGM平板（保存平板）。同样，每板接种100-200 μL线虫，以确保有足够的细菌维持线虫群体生长。
注意：每种基因型所需的保存平板数量至少应等于待检测的长期关联记忆时间点数量。也可使用100 mm NGM平板作为诱导后培养平板，但必须确保平板上有足够的OP50以支持线虫群体至少存活16小时。 - 将诱导后的平板在20°C下孵育16、24和40小时（长期关联记忆时间点）（图1C）。
注意：野生型动物的长期关联记忆在训练后40小时结束。不同基因型或条件下可能需要调整时间点。 - 为检测食物-丁酮关联的长期关联记忆，在每个时间点后，轻轻将线虫从平板上冲洗至15 mL离心管中，并再用M9缓冲液洗涤1-2次。使用这些线虫进行趋化性实验（第5节）。学习指数（LI）= CI时间点 - CINaive。
注意：采用第2节中描述的轻柔洗涤方法。对于每个时间点，未用于趋化性实验的多余线虫应予以弃除。
5. 趋化性实验
- 准备趋化性检测平板。标记平板底部 未接种的 100 毫米 NGM 平板，在平板底部及两侧均有菌斑（图 2A）。
注意：每种基因型至少需进行3次重复实验，以获得具有统计学意义的结果。 - 斑点 1 μL 1 M NaN₃3 在气味剂点和对照点（图2B）。
注意：在开始检测前不要用这种麻痹剂在平板上点样超过15分钟，否则NaN3 会从斑点处扩散，动物在到达气味物质或对照斑点之前就会瘫痪。添加 NaN 时需小心，避免刺破琼脂。3 因为线虫会在穿刺部位钻入。 - 在蠕虫经过数次 M9 缓冲液洗涤并静置在锥形管中期间（第 2 节），点样 1 μL 95% 乙醇和 10% 丁酮（见第 7.2 节）分别加到已标记的检测板（图 2C）上先前点有 NaN₃ 的相应位置。
注意：必须在添加线虫之前点样化学试剂（第5.4节）。记录好哪个位置点的是乙醇或丁酮。操作这些挥发性化学试剂时，应仅在必要时打开培养皿盖子，其余时间均须保持盖紧。 - 尽可能从装有沉淀蠕虫的离心管中移除M9缓冲液。使用带有预切尖端的P20移液器（参见第7.3节）加入3X 5 μL 将蠕虫（200-400只）转移至标记的测定培养皿的起始位置（图2D）。
注意：将剩余的线虫保留在15 mL锥形管中，用于预处理饥饿和记忆实验（第2–4节）。线虫会黏附在移液器吸头内部，因此将线虫分批少量加入培养板可节约线虫数量，并减少随线虫转移到检测板上的液体量。 - 将KimWipe纸的一角捻成细小尖端，用以吸除多余的M9缓冲液。这将使线虫转移至实验培养板上（图2E）。
注意：用KimWipe擦拭时注意不要刺破琼脂，否则线虫会在原点处钻入琼脂。在吸除M9缓冲液时，部分线虫可能随液体被吸入KimWipe中，导致此步骤中丢失一些线虫。若采用成像与分析方法计数线虫（第6节），应在释放线虫前将培养皿送至成像工作站。在线虫释放后立即拍摄原点处的图像，可获得该实验培养皿中动物的总数。 - 将趋化性实验板在室温下孵育1小时。
- 统计起始点、乙醇点和丁酮点处的线虫数量（图2），以及检测平板上线虫的总数。
注意：通常情况下，被 NaN 使麻痹的线虫3 将在斑点周围约1 cm半径范围内，呈笔直条带状，大量动物紧密堆积在一起。如果使用成像与分析软件计数线虫（第6节），请拍摄原点、乙醇和丁酮斑点的图像。线虫总数的图像应在第5.5节中已拍摄。线虫也可通过人工计数。 - 计算“趋化指数”（Chemotaxis Index, CI）。CI = ([(n丁酮)-(nEtOH)]/[(总计-n起源)].
6. 基于图像分析的线虫计数
- 在趋化性分析平板上拍摄线虫的高对比度黑白图像（图 3A，相机设置的描述见第 7.4 节）。为计算趋化性指数，需要在实验结束时获取趋化性分析平板上丁酮、乙醇和原点位置的图像，以及线虫总数（实验开始时线虫从 M9 缓冲液释放后立即拍摄的原点处线虫图像，见第 5.5 节）。
注意：通常覆盖每个位置周围约 2 cm 半径范围的趋化性分析平板图像即可捕获该位置的所有线虫。 - 确保同一时间点（例如 Naive、0 hr 等）所有重复实验的文件均存放在一个命名恰当的文件夹中。
- 每块趋化性平板的文件必须按如下方式命名：but#.png（丁酮位置，第 # 次重复）、ori#.png（原点，第 # 次重复）、eth#.png（乙醇位置，第 # 次重复）、tot#.png（总数，第 # 次重复）。（例如，若某时间点进行了两次重复实验，则同一文件夹中应包含以下文件：but1.png、but2.png、eth1.png、eth2.png、ori1.png、ori2.png、tot1.png、tot2.png）
- 打开 Matlab（见第 7.5 节）。
- 在 Matlab 窗口顶部的“当前目录”行中浏览并选择“count_worms_v0.5.3”文件夹（M 文件作为补充信息提供）。
- 在“命令窗口”中输入“count_worms_directory()”，然后按 Enter 键。
注意：该命令的默认线虫大小为最小 10 像素，最大 80 像素。若需根据特定基因型或发育阶段进行调整，可输入“count_worms_directory ('minsize',10,'maxsize', 80)”并相应修改像素数值。 - 当系统提示时，选择待分析的图像文件夹。
注意：每次只能分析一个文件夹中的图像。 - 正在分析的文件夹中的每张图像将自动弹出，并已设定阈值和选中的颗粒（图 3A）。使用矩形工具框选非线虫的颗粒以将其删除。完成当前图像后，按 Esc 键。
- 当文件夹中所有图像均检查完毕后，命令窗口将显示四列数据：（1）图像名称（例如 but1）；（2）始终为“[1]”；（3）程序计算出的该图像中单条线虫的平均像素大小；（4）计算出的图像中线虫数量。
- 该程序运行完成后，会将两个 .csv 文件（可作为 Excel 电子表格打开）保存至刚刚分析过的图像文件夹中。“worm_counts_stats”文件提供命令窗口中显示的输出列（第 6.9 节）。“worm_counts_summary”文件提供五列数据：（1）重复编号；（2）丁酮位置、（3）乙醇位置、（4）原点位置的线虫数量；以及（5）线虫总数。
7. 材料说明
- 制备 100 mm 高生长培养基（HGM）平板（第 1 节）：将 3 g NaCl、20 g Bactopeptone 和 30 g Bacto-agar 溶解于 700 mL 蒸馏水中，用蒸馏水定容至 1 L。高压灭菌后，将琼脂冷却至 65°C，加入 4 mL 浓度为 5 mg/mL 的胆固醇乙醇溶液，以及各 1 mL 的 1 M CaCl2、1 M MgSO4 和 25 mL 的 1 M KPO4（pH = 6.0）。
- 使用 95% EtOH，因为更高浓度的 EtOH 在纯化过程中可能含有影响实验结果的杂质。建议每次进行数次趋化性实验时，重新配制 10% 丁酮（溶于 95% EtOH）的储存液。
- P20 吸头必须剪去几毫米，以形成足够大的孔洞，使线虫能够通过而不受损伤。P1000 吸头的孔径已足够大，线虫可顺利通过。
- Murphy 实验室的趋化性实验平板成像系统（图 3B）包含一个连接在悬臂支架上的 Firewire 相机和可变倍率镜头。支架底部设有背光源，位于定制成像平台下方，该平台顶部为玻璃材质（图 3C），可从底部照亮趋化性实验平板。“Measurement and Automation”软件（National Instruments）用于图像采集。该成像系统所用材料与先前发表的研究12类似，具体试剂与设备清单见文末表格。
8. 代表性结果：
野生型线虫对10%丁酮的典型幼稚趋化指数（CI）约为0.2（图4A）6。集中训练（1次）或间隔训练（7次）通常在训练后即刻（时间0）使趋化指数提高至0.7–0.8（图4A、C–D），从而获得学习指数（LI = 训练后CI - 幼稚CI）约0.66。集中或间隔训练所诱导的学习效应非常显著。当学习指数低于0.5时，通常表明幼稚趋化实验存在问题，且动物的幼稚CI应不低于0.3。这种情况通常源于线虫在漂白后至实验开始前的培养过程中处于饥饿状态或培养板上密度过高，或在洗涤后于M9缓冲液中静置时间过长而开始饥饿；环境中的气味分子也可能提高幼稚CI。饥饿状态的线虫对10%丁酮的幼稚CI显著升高（图4B）6。我们发现，通过改善线虫的饲养与培养条件，通常可解决幼稚趋化实验中的问题。
这些实验中记忆的持续时间，是指训练后趋化指数恢复至未训练水平所需的时间，此时学习指数等于0。在野生型动物中，短期关联记忆通常在集中训练后1小时左右开始下降，持续约2小时，且不依赖转录因子CREB（图4C）6。长期关联记忆通常在间隔训练后16小时才开始显著下降，可持续长达40小时，并依赖CREB（图4D）6。在某些情况下，长期关联记忆可能无法达到其充分水平：（1）线虫在30分钟的条件化期间缺乏足够的OP50 E. coli；（2）在饥饿期间细菌仍残留在M9缓冲液中；或（3）实验过程中线虫受到损伤（例如，线虫在移液时撞击管壁）。
对于每种基因型在每个时间点进行4次或更多次趋化性实验时，结果通常具有统计学显著性。每种基因型进行六次重复实验通常可获得非常显著的结果，且工作量适中；然而，初学者可考虑从每种基因型仅进行三次重复开始。通常情况下，对于已熟悉这些学习与记忆实验的研究人员而言，同时处理2至3种基因型或条件较为适宜。
通过手动计数趋化性实验平板上的线虫非常耗时，可能在不同实验或实验人员之间引入变异性，并在数据分析和解释过程中产生偏差。利用图像分析进行线虫计数（第6节）可实现实验室内的数据采集与分析标准化，平均而言，有经验的实验人员的数据分析时间可缩短至手动计数的五分之一。将使用人工计数获得的趋化指数与通过Count_worms软件确定的结果进行比较时，我们发现平均误差为3.07（±1.19）%。
| 第1天 | |
| 时间 | 步骤 |
| 9:00 | 在M9缓冲液中饥饿处理1小时 开始基础趋化性实验 |
| 10:00 | 条件#1（60 mm NGM平板，含食物和丁酮），30分钟 结束基础趋化性实验 |
| 10:30 | 饥饿处理#1（60 mm NGM平板），30分钟 |
| 11:00 | 条件#2，30分钟 |
| 11:30 | 饥饿处理#2，30分钟 |
| 12:00 | 条件#3，30分钟 |
| 12:30 | 饥饿处理#3，30分钟 |
| 1:00 | 条件#4，30分钟 |
| 1:30 | 饥饿处理#4，30分钟 |
| 2:00 | 条件#5，30分钟 |
| 2:30 | 饥饿处理#5，30分钟 |
| 3:00 | 条件#6，30分钟 |
| 3:30 | 饥饿处理#6，30分钟 |
| 4:00 | 条件#7，30分钟 |
| 4:30 | 开始0小时趋化性实验 将剩余线虫转移至维持平板，存放16–40小时 |
| 5:30 | 结束0小时趋化性实验 |
| 第2天 | |
| 时间 | 步骤 |
| 8:30 | 开始16小时趋化性实验 |
| 9:30 | 结束16小时趋化性实验 |
表1. 长期关联记忆实验的代表性时间安排。本示例中，实验于第1天上午9点开始，首先进行1小时的饥饿处理。随后交替进行30分钟的条件刺激和饥饿阶段，直至线虫完成七次训练。在训练开始前（ naïve 状态）和训练结束时（0小时）分别进行趋化性实验。整个实验从开始到结束共持续8.5小时。从第2天起，在保存平板上的线虫将在训练后16至40小时期间检测其对丁酮的趋化性。
图 1. 短期与长期关联记忆检测流程图。（A）建议的实验前准备时间线，直至进行检测当天。（B）短期关联记忆检测：饥饿处理的线虫进行1小时条件化训练后，立即通过趋化性检测测试1次学习（0分钟），或在条件化训练后转移至含食物的维持培养板上，分别放置0.5、1或2小时后再测试。（C）长期关联记忆检测：饥饿处理的线虫接受7轮条件化训练/饥饿循环，在训练结束后16–40小时进行学习或长期关联记忆（LTAM）检测。
图 2. 趋化性实验装置示意图。（A）趋化性实验平板示意图。借助直尺或其他引导工具，在平板上标记起始点（底部）、丁酮（左侧）和乙醇（右侧）的位置。（B）在丁酮和乙醇位置各加入 1 μL NaN3。（C）在平板左侧和右侧的位置分别加入 1 μL 的 10% 丁酮和 95% 乙醇。（D）将 200–400 条悬浮于 M9 缓冲液中的线虫加到平板的起始点。（E）将 KimWipe 纸捻成尖头状，用于吸除 M9 缓冲液并将线虫释放到实验平板上。
图3. 基于图像分析的线虫计数。（A）“count_worms_v0.5.3”程序的图像颗粒选择界面示例。程序自动打开原始高对比度黑白图像（左），随即弹出阈值化处理后的图像窗口（中）。可使用矩形工具高亮并剔除非线虫的干扰“颗粒”，例如实验平板上的标记（1）、平板边缘（2）或琼脂穿刺痕迹（3）。（B）Murphy实验室趋化性实验成像工作站图像。趋化性实验平板从底部照明，以获得分析所需的高对比度图像。（C）趋化性成像工作站中使用的定制成像平台示意图。
图 4. 典型的关联学习与记忆结果。（A）野生型线虫对 10% 丁酮的初始趋化性指数在集中训练（1 次）后升高。这种习得的关联需要食物（OP50 大肠杆菌 coli）与丁酮的配对。柱上方的数值表示“学习指数”（LI = CITrained - CINaive）。（B）当线虫饥饿处理 16 小时后，其对 10% 丁酮的野生型初始趋化性显著增强。图 A-D 改编自 Kauffman et al., 2010。6（C）野生型的短期关联记忆持续约 2 小时，且不依赖转录因子 CREB。（D）野生型的长期关联记忆持续约 40 小时，且依赖 CREB。
补充信息
讨论
C. elegans 的嗅觉关联学习与记忆检测方法可区分集中式学习、间隔式学习、短期记忆和长期记忆等不同过程。这些检测依赖于线虫感知环境中食物和化学气味的能力，以及在两者之间建立正向关联的能力1,26。因此，该检测对起始动物群体的饥饿状态极为敏感，必须格外注意确保线虫在训练前后均处于充分喂养状态。单次集中训练可产生短期关联记忆。与其它生物类似，增加训练次数并采用间隔训练范式，对于在 C. elegans 中获得长期关联记忆至关重要6,8。或许可对该检测方法进行改进，以生成不同条件刺激与非条件刺激之间关联的长期记忆。
我们的关联学习与记忆检测方法可用于比较野生型与衰老或遗传突变动物的学习和记忆能力。例如，尽管在衰老的野生型线虫中，关联学习能力和长期关联记忆能力均会下降，但胰岛素信号减弱的动物随着年龄增长，其学习能力维持时间更长；而在热量限制的动物中，学习和记忆能力随年龄增长的维持时间更长。6 这些检测方法同样适用于对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行RNA干扰（RNAi）处理或药物干预。例如，用针对daf-2基因的RNAi处理线虫可改善其短期和长期关联记忆；相反，在间隔训练期间使用药物（分别为放线菌素D和环己酰亚胺）阻断基因转录和蛋白质合成，则会破坏长期记忆的形成。6
长期记忆是所有动物生存过程中至关重要的一个过程，而对经典条件反射记忆所涉及的分子机制似乎从线虫到哺乳动物都具有高度保守性6。利用这些嗅觉检测方法能够区分并检验关联学习、短期记忆和长期记忆的能力，使 C. elegans 成为深入研究记忆机制的优良模型系统，并可能为导致人类学习与记忆丧失的神经退行性过程提供重要见解。
致谢
我们感谢 W. Ryu 对我们初始成像装置的建议，Z. Gitai 提议使用 ImageJ13 来计数线虫，以及 J. Ashraf 在使用 Google SketchUp 方面提供的帮助。CTM 是生物医学科学 Pew 学者、McKnight 学者和 Keck 学者。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | S227 | 用蒸馏水配制 1 M 浓度溶液 |
| 190 证明乙醇 | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% 乙醇可能含有干扰趋化实验的杂质 |
| 2-丁酮 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire 面扫描 CMOS 相机 | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite 视频镜头 – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 光纤照明器 | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” 背光源 | Schott AG | A08927 | |
| 标准悬臂支架 | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” 悬臂支架接头适配器 | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| 标准固定式 1/4-20 安装板 | Edmund Scientific | NT54-122 |
参考文献
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