C. elegans 正向丁酮学习、短期和长期关联记忆检测

摘要

本文描述了测试秀丽隐杆线虫（C. elegans）关联学习以及短期和长期关联记忆的方法。这些群体实验利用了线虫向挥发性气味物质趋化的能力，通过将食物与趋化吸引剂丁酮配对，使线虫形成正向关联。增加训练周期的次数可诱导形成长期记忆。

摘要

对经历和所学信息的记忆对于生物体做出有利于其生存的选择至关重要。C. elegans 通过特定神经元对食物和化学气味的感知来导航其环境^{1, 2}，并能够将营养状态与化学气味³、温度⁴以及食物来源的致病性⁵相关联。

本文介绍了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的关联学习以及短期和长期关联记忆的检测方法。我们对一种已有的厌恶性嗅觉学习范式⁶进行了改良，使其产生正向反应；该检测方法包括将约400条线虫饥饿处理后，在AWC神经元感知的挥发性化学吸引物丁酮存在的情况下进行喂养，丁酮浓度选择为仅引起较低趋化指数的水平（类似于Toroyama et al.⁷ 的方法）。随后通过标准的群体趋化性检测1，可在训练后立即或数分钟至数小时后检测线虫对气味物质的趋化吸引力。

经过条件化处理后，野生型动物对丁酮的趋化性增加约0.6个趋化指数单位，即其“学习指数”。这种联合学习依赖于训练过程中食物与丁酮的同时存在。将食物与丁酮配对进行一次条件化处理（“集中训练”）可产生持续约2小时的短期联合记忆。而多次条件化处理并中间间隔休息期（“分散训练”）则可形成长期联合记忆（<40小时），该过程依赖于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）⁶，CREB是一种在多种物种中均必需的长时程记忆相关的转录因子⁸。

本方案还包括用于快速、准确测定趋化性指数的图像分析方法。通过MatLab中的线虫计数软件，采集并分析趋化性实验平板上动物的高对比度图像。该软件采用形态学顶帽变换校正背景不均匀问题⁹。随后使用Otsu方法确定阈值，以区分线虫与背景¹⁰。软件自动去除极小颗粒，通过手动选择去除较大的非线虫区域（如平板边缘或琼脂打孔区域）。接着，软件通过忽略超过指定最大尺寸的区域，并计算剩余区域的中位尺寸，来估算单条线虫的大小。最后，将被识别为线虫占据的总面积除以单条线虫的估算尺寸，从而估计线虫数量。

我们发现，学习能力以及短期和长期记忆可以被区分开来，且这些过程与高等生物共享相似的关键分子。^6,8 我们的检测方法能够快速验证在 C. elegans 中影响学习以及短期或长期记忆的新候选基因或分子，这些发现具有跨物种的相关性。

方案

C. elegans 的关联学习与记忆检测需要提前准备。有关建议的准备时间表，请参见图 1A 所示的时间线。还需注意，物理扰动（如剧烈移液、离心、涡旋）可能会干扰线虫的记忆，而环境中过强的气味（如香水等）可能会干扰其初始趋化行为。

1. 实验动物的准备

1. 采用标准方法，在接种了1 mL OP50 E. coli 的100 mm高生长培养基（HGM）平板上培养线虫（HGM配方见第7.1节）¹¹。
2. 对至少两块成年 gravid 线虫密集生长的HGM平板进行次氯酸盐处理，以获得大量同步化的卵群体。
   注意：为获得最佳产量，建议先对第一代进行漂白以获得高度同步化的群体，然后在第二代成虫发育至第2天时再次漂白，以获取后续步骤所需的卵。
3. 将每块经次氯酸盐处理后获得的卵均匀分配至3–4块接种了1 mL OP50 E. coli 的HGM平板上。
   注意：必须保证线虫在培养过程中有充足的新鲜食物，因为饥饿会影响嗅觉实验的结果。
4. 将线虫在20°C条件下培养约72小时，此时间为线虫发育至年轻成虫阶段所需的时间。

2. 预处理饥饿

1. 再次检查你的 HGM 平板中的成年虫，确保线虫仍有充足的食物，并且每个检测平板中有足够的线虫数量（每平板不少于 200 条）。
2. 用M9缓冲液冲洗HGM平板上的线虫¹¹ 转移到15 mL锥形管中。为在洗涤过程中尽量减少扰动，可将几毫升M9缓冲液轻轻倒入HGM平板上，并轻柔地晃动平板，使线虫从黏附的OP50细菌上脱离。接着倾斜平板，用P1000移液器从平板角落吸取M9缓冲液与线虫的混合液，转移至15 mL锥形管中。若平板上仍有残留线虫，重复此步骤1–2次。
   注意：粗略清洗会将细菌从培养皿上冲下，从而混入含有线虫的离心管中。这些细菌无法完全去除，可能干扰后续检测。 切勿将蠕虫吸取时撞击管壁，因为这可能会损伤线虫并干扰检测。
3. 让蠕虫依靠重力沉降（切勿离心). 用真空法吸除上清液，并加入至少3-4 mL M9缓冲液洗涤。重复此步骤2次，共洗涤3次。
   注意：洗涤过程中进行离心会将残留的细菌沉淀至线虫群体中，可能干扰后续检测。相反，应直接将M9缓冲液轻轻倒入15 mL锥形管中进行后续洗涤。加入M9缓冲液后，沉降至管底的线虫应重新悬浮并混匀。若线虫仍沉降在底部，可轻轻倒置试管以混匀。
4. 第三次洗涤后，取部分线虫群体用于 naïve 趋化性实验（第 5 节）。
   注意：所有洗涤步骤均需迅速操作，因为线虫在M9缓冲液中停留过久会开始饥饿，这会增强其对丁酮的初始趋化性。
5. 向15 mL锥形管中加入3-4 mL M9缓冲液，将线虫在室温下于M9缓冲液中饥饿处理1小时（图1B、C）。

3. 短期联想记忆（密集）训练

短期关联记忆检测流程图见图1B。

1. 在M9缓冲液饥饿期结束时（第2节），取2 μL的10%丁酮（溶于95%乙醇中），划线于已接种500 μL OP50大肠杆菌（E. coli）的60 mm线虫生长培养基（NGM）¹¹平板盖内侧。
   注意：进行短期和长期记忆检测时，合适的起始线虫群体数量应不少于500 μL。每种基因型需要多个训练平板，以在训练期间维持整个群体。操作挥发性化学品时，仅在必要时打开平板盖，其余时间应始终保持关闭状态。
2. 通过真空抽吸去除装有饥饿线虫的15 mL锥形管中的M9缓冲液上清，使用P1000移液器将100–200 μL线虫转移至训练平板。
   注意：应尽可能去除M9液体，以便线虫转移到训练平板后能迅速接触到OP50食物源。线虫易黏附在移液枪头内壁，可通过分次小体积移液来减少损失并提高回收率。
3. 将训练平板在室温下孵育1小时（图1B）。
4. 用约1 mL M9缓冲液将线虫从平板上冲洗至15 mL锥形管中，让线虫自然沉降。重复清洗1–2次，直至管中M9缓冲液澄清。
   注意：采用第2节所述的轻柔清洗方法。可继续使用第2节中使用的同一支15 mL锥形管。
5. 最后一次清洗后，通过真空抽吸去除M9缓冲液上清，并取部分线虫群体进行趋化性检测（第5节），以评估训练后即刻（0分钟时间点）对食物-丁酮关联的单次（集中式）联想学习。
   学习指数（LI）= CI_{0 hr} - CI_Naive。
6. 将剩余的线虫群体转移至接种了500 μL OP50的60 mm NGM平板（维持平板）。每板仍加入100–200 μL线虫，确保有足够的细菌支持群体生长。
   注意：每种基因型所需的维持平板数量至少应等于待检测的短期联想记忆时间点数。
7. 将训练后的平板在室温下孵育0.5、1或2小时（短期联想记忆时间点）（图1B）。
   注意：野生型线虫的短期联想记忆通常在训练后2小时内消失。不同基因型或实验条件下可能需要调整时间点。
8. 为检测食物-丁酮关联的短期联想记忆，在每个时间点后，轻轻将线虫从平板上冲洗至15 mL锥形管中，并用M9缓冲液再清洗1–2次。随后用于趋化性检测（第5节）。学习指数（LI）= CI_{Time point} - CI_Naive。
   注意：采用第2节所述的轻柔清洗方法。每个时间点实验后，未用于趋化性检测的多余线虫应予以弃除。

4. 长时间关联记忆（间隔式）训练

长期关联记忆检测流程见图1C。

1. 按照第3节中的步骤3.1-3.2操作。
2. 将诱导板在室温下孵育30分钟（图1C）。
3. 按照第3节中的步骤3.4操作。
   注意：为了控制在30分钟的时间范围内，可在训练开始约25分钟时开始所有洗涤步骤。
4. 最后一次洗涤后，用真空泵吸除M9上清液，并将线虫转移至未接种细菌的60 mm NGM平板。
   注意：此步骤中每种基因型无需使用多个平板，因为线虫将处于饥饿状态。
5. 在室温下于60 mm NGM平板上饥饿处理30分钟（图1C）。
6. 用M9缓冲液将线虫洗入15 mL锥形管中，让线虫依靠重力自然沉降（切勿离心）。
   注意：尽管此时缓冲液中应无细菌，但离心可能对线虫造成损伤，并可能干扰长期记忆的形成。
7. 重复步骤4.1-4.6数次，直至完成总共7个诱导周期和6个饥饿周期（图1C）。（参见表1中的代表性时间表。）
8. 轻轻将线虫从平板上洗入15 mL锥形管，并再用M9缓冲液洗涤1-2次。
9. 最后一次洗涤后，取部分线虫群体进行趋化性实验（第5节），以检测在诱导后立即测试的7次（间隔式）食物-丁酮关联学习（0小时时间点）。学习指数（LI）= CI_{0 hr} - CI_Naive。
10. 将剩余的线虫群体转移至接种了1 mL OP50的100 mm HGM平板（维持平板）。同样，每板接种100-200 μL线虫，以确保有足够的细菌支持线虫群体。
    注意：每种基因型所需的维持平板数量至少应等于待检测的长期关联记忆时间点数。也可使用100 mm NGM平板作为诱导后培养平板，但必须确保有足够的OP50细菌至少维持线虫群体16小时。
11. 将诱导后的平板在20°C下孵育16、24和40小时（长期关联记忆时间点）（图1C）。
    注意：野生型动物的长期关联记忆在训练后40小时结束。不同基因型或条件下可能需要调整时间点。
12. 为检测食物-丁酮关联的长期关联记忆，在每个时间点后，轻轻将线虫从平板上洗入15 mL锥形管，并再用M9缓冲液洗涤1-2次。使用这些线虫进行趋化性实验（第5节）。学习指数（LI）= CI_{Time point} - CI_Naive。
    注意：采用第2节中描述的轻柔洗涤方法。对于每个时间点，丢弃趋化性实验中未使用的多余线虫。

5. 趋化性实验

1. 制备趋化性检测平板。在平板底部标记 未接种的 底部及培养皿两侧均有菌斑的100 mm NGM平板（图2A）。
   注意：每种基因型至少需进行3次重复实验，以获得具有统计学意义的结果。
2. 点 1 μ1 M NaN₃ 溶液₃ 在气味物质点和对照点（图2B）。
   注意：在开始检测前不要提前超过15分钟将此麻痹剂点样至平板，否则NaN₃ 会从点样位置扩散开，动物在到达气味物或对照点之前就会瘫痪。添加 NaN₃ 时需小心，避免刺破琼脂。₃ 因为线虫会在被刺破的区域钻入。
3. 在蠕虫经过数次M9缓冲液洗涤并沉降到锥形管底部的过程中（第2节），点样1 μ在已点样 NaN₃ 的标记检测板（图 2C）的相应位置，分别加入 95% EtOH 和 10% 丁酮各 1 L（参见第 7.2 节）。
   注意：必须在添加线虫之前点样化学物质（第5.4节）。记录好哪个点样位置含有乙醇或丁酮。处理这些挥发性化学物质时，仅在必要时打开培养皿盖子，并始终保持盖子处于关闭状态。
4. 尽可能从已沉淀的线虫管中移除M9缓冲液。使用带有预切尖端的P20移液器（见第7.3节），加入3次，每次5 μL μ将L3期幼虫（200-400只）转移至标记的检测平板的起始位置（图2D）。
   注意：将剩余的线虫保留在15 mL锥形管中，用于预处理饥饿和记忆实验（第2–4节）。线虫会黏附在移液器吸头内部，因此分批少量地将线虫加入培养板可节约线虫数量，并减少随线虫带入实验板中的液体量。
5. 将KimWipe纸的一角搓成细尖，用其吸除多余的M9缓冲液，从而将线虫转移至检测平板上（图2E）。
   注意：用KimWipe擦拭时需小心，避免刺破琼脂，否则线虫会在起始点处钻入琼脂。在吸去M9缓冲液的过程中，部分线虫可能随缓冲液被吸入KimWipe而丢失。如果采用成像与分析方法计数线虫（第6节），应在释放线虫前将培养板送至成像工作站。在线虫释放后立即拍摄起始点处的图像，可获得该检测培养板上的动物总数。
6. 将趋化性检测板在室温下孵育1小时。
7. 统计起始点、乙醇点和丁酮点处的线虫数量（图2），以及检测平板上线虫的总数。
   注意：通常情况下，被 NaN 使麻痹的线虫₃ 将在斑点周围约1 cm半径范围内出现，呈笔直条带状，大量动物彼此紧密堆积。如果使用成像与分析软件计数线虫（第6节），需拍摄原点、乙醇和丁酮斑点的图像。总线虫数量的图像应在第5.5节中已拍摄。线虫也可进行手动计数。
8. 计算“趋化指数”（Chemotaxis Index, CI）。CI = ([(n_丁酮)-(n_EtOH)]/[(总计-n_起源)].

6. 通过图像分析进行线虫计数

1. 在趋化性分析平板上拍摄线虫的高对比度黑白图像（图3A，相机设置的描述见第7.4节）。为计算趋化性指数，需要在实验结束时获取趋化性分析平板上丁酮（butanone）、乙醇（EtOH）和原点位置的图像，以及线虫总数（实验开始时线虫从M9缓冲液释放后立即拍摄的原点处线虫图像，见第5.5节）。
   注意：通常拍摄覆盖每个位置周围约2 cm半径范围的趋化性分析平板图像，即可捕获每个位置的所有线虫。
2. 确保同一时间点的所有实验重复（例如Naive、0 hr等）的文件均存放在一个命名恰当的文件夹中。
3. 每块趋化性平板的文件必须按以下方式命名：but#.png（丁酮位置，第#次重复）、ori#.png（原点，第#次重复）、eth#.png（乙醇位置，第#次重复）、tot#.png（总数，第#次重复）。（例如，若某时间点进行了两次重复实验，则同一文件夹中应包含以下文件：but1.png、but2.png、eth1.png、eth2.png、ori1.png、ori2.png、tot1.png、tot2.png）
4. 打开Matlab（见第7.5节）。
5. 在Matlab窗口顶部的“Current Directory”行中浏览并选择“count_worms_v0.5.3”文件夹（M文件作为补充信息提供）。
6. 在“Command Window”中输入“count_worms_directory()”，然后按Enter键。
   注意：该命令的默认线虫大小为最小10像素，最大80像素。若需根据特定基因型或发育阶段进行调整，可输入“count_worms_directory ('minsize',10,'maxsize', 80)”并相应修改像素数值。
7. 当系统提示时，选择待分析的图像文件夹。
   注意：每次只能分析一个文件夹中的图像。
8. 正在分析的文件夹中的每张图像将自动弹出，并已设定阈值和选中的颗粒（图3A）。使用矩形工具框选非线虫的颗粒以将其删除。完成当前图像后，按Esc键。
9. 当文件夹中所有图像均检查完毕后，Command Window中将显示四列数据：（1）图像名称（例如but1）；（2）始终为“[1]”；（3）程序针对该图像计算出的单条线虫的平均像素大小；（4）程序计算出的该图像中的线虫数量。
10. 该程序运行完成后，会将两个.csv文件（可用Excel电子表格打开）保存至刚刚分析过的图像文件夹中。“worm_counts_stats”文件提供Command Window中显示的输出列（见第6.9节）。“worm_counts_summary”文件提供五列数据：（1）重复编号；（2）but位置、（3）eth位置、（4）ori位置的线虫数量；以及（5）线虫总数。

7. 材料说明

1. 制备100 mm高的生长培养基（HGM）平板（第1节）：将3 g NaCl、20 g Bactopeptone和30 g Bacto-agar溶解于700 mL蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1 L。高压灭菌后，将琼脂冷却至65°C，加入4 mL浓度为5 mg/mL的胆固醇乙醇溶液，以及各1 mL的1 M CaCl₂、1 M MgSO₄和25 mL的1 M KPO₄（pH = 6.0）。
2. 使用95%乙醇，因为更高浓度的乙醇在纯化过程中可能含有杂质，从而影响实验结果。建议每次进行数次趋化性实验时，重新配制10%丁酮（溶于95%乙醇）的储存液。
3. P20吸头必须剪去几毫米，以形成足够大的孔洞，使线虫能够通过而不受损。P1000吸头本身的孔径已足够大，可允许线虫顺利通过。
4. Murphy实验室的趋化性实验平板成像站（图3B）配备一个Firewire相机，连接变倍镜头并固定在支架上。支架底部设有背光灯，其上为定制的成像平台，平台顶部为玻璃材质（图3C），可从底部照亮趋化性实验平板。“Measurement and Automation”软件（National Instruments）用于图像采集。该成像系统所用材料与先前发表的研究相似¹²，具体试剂与设备见试剂与设备表。

8. 代表性结果：

野生型线虫对10%丁酮的典型初始趋化指数（CI）约为0.2（图4A）⁶。集中训练（1次）或间隔训练（7次）通常可在训练后即刻（0时）使趋化指数提高至0.7–0.8（图4A、C–D），从而获得约0.6的学习指数（LI = 训练后CI - 初始CI）⁶。集中或间隔训练所诱导的学习效应非常显著。当学习指数低于0.5时，通常表明初始趋化实验存在问题，且动物的初始CI值应达到0.3或更高。这种情况通常源于线虫在漂白后至实验开始前的培养过程中处于饥饿状态或培养板上密度过高，或在洗涤后于M9缓冲液中静置时间过长而开始饥饿；环境中的气味也可能导致初始CI升高。饥饿状态的线虫对10%丁酮的初始CI显著升高（图4B）⁶。我们发现，通过改善线虫的饲养与培养条件，通常可解决初始趋化实验中的问题。

这些实验中记忆的持续时间是指训练后趋化指数恢复到 naive 水平所需的时间，此时学习指数等于 0。在野生型动物中，短期关联记忆通常在集中训练后1 小时内开始下降，持续约 2 小时，并且不依赖于转录因子 CREB（图 4C）⁶。长期关联记忆通常在间隔训练后 16 小时才开始显著下降，可持续长达 40 小时，并且依赖于 CREB（图 4D）⁶。在某些情况下，长期关联记忆可能无法达到其完全潜力：（1）线虫在 30 分钟的条件训练期间没有获得足够的 OP50 E. coli；（2）在饥饿期间细菌残留在 M9 缓冲液中；或（3）线虫在实验过程中受到损伤（例如，线虫被移液枪吹打至离心管管壁上）。

对于每种基因型在每个时间点进行4次或更多次趋化性实验时，结果通常具有统计学显著性。每种基因型进行六次重复实验通常可获得非常显著的结果，且工作量仍可控制；然而，初学者可考虑从每种基因型仅进行三次重复开始。通常情况下，对于已熟悉这些学习与记忆实验的研究人员而言，同时处理2至3种基因型或实验条件较为适宜。

在趋化性实验平板上手动计数线虫非常耗时，可能在不同实验或实验人员之间引入变异性，并且在数据分析和解释过程中还可能产生偏差。通过图像分析进行线虫计数（第6节）可实现全实验室范围内的数据采集与分析标准化，平均而言，有经验的实验人员的数据分析时间可缩短至手动计数所需时间的五分之一。将基于人工计数计算的趋化性指数与使用Count_worms软件确定的结果进行比较时，我们发现平均误差为3.07（±1.19）%。

第1天
时间	步骤
9:00	在M9缓冲液中饥饿处理1小时 开始初始趋化性实验
10:00	条件#1（含食物和丁酮的60 mm NGM平板），30分钟 结束初始趋化性实验
10:30	饥饿处理#1（60 mm NGM平板），30分钟
11:00	条件#2，30分钟
11:30	饥饿处理#2，30分钟
12:00	条件#3，30分钟
12:30	饥饿处理#3，30分钟
13:00	条件#4，30分钟
13:30	饥饿处理#4，30分钟
14:00	条件#5，30分钟
14:30	饥饿处理#5，30分钟
15:00	条件#6，30分钟
15:30	饥饿处理#6，30分钟
16:00	条件#7，30分钟
16:30	开始0小时趋化性实验 将剩余线虫转移至维持平板，存放16–40小时
17:30	结束0小时趋化性实验
第2天
时间	步骤
8:30	开始16小时趋化性实验
9:30	结束16小时趋化性实验

表1. 长期关联记忆实验的代表性时间安排。在此示例中，实验于第1天上午9点开始，首先进行1小时的饥饿处理。随后交替进行30分钟的条件处理和饥饿处理，直至线虫完成七次训练。在训练开始前（ naïve 状态）和训练结束时（0小时）分别进行趋化性实验。整个实验从开始到结束共耗时8.5小时。从第2天开始，在训练后16至40小时，对保存在暂存平板上的线虫进行丁酮趋化性测试。

图 1. 短期与长期关联记忆实验流程图。（A）建议的实验前准备时间线，直至进行实验的当天。（B）短期关联记忆实验：饥饿的线虫经过1小时的条件化处理后，立即通过趋化性实验检测1次学习（0分钟）；或在条件化处理后转移至含食物的维持培养板上，分别在0.5、1或2小时后检测。（C）长期关联记忆实验：饥饿的动物在训练期间接受7轮条件化/饥饿训练，之后在训练结束16–40小时后检测学习或长期关联记忆（LTAM）。

图 2. 趋化性实验装置示意图。（A）趋化性实验平板示意图。借助直尺或其他引导工具，在平板上标记出起始点（底部）、丁酮和乙醇（左右）的位置。（B）在丁酮和乙醇的位置各加入 1 μL NaN₃。（C）在平板左侧或右侧的对应位置分别加入 1 μL 的 10% 丁酮和 95% 乙醇。（D）将 200–400 条悬浮于 M9 缓冲液中的线虫加入平板的起始点。（E）将 KimWipe 纸捻成尖头状，用于吸收 M9 缓冲液并将线虫释放到实验平板上。

图3. 利用图像分析进行线虫计数。（A）“count_worms_v0.5.3”软件的图像粒子选择窗口示例。程序自动打开原始高对比度黑白图像（左侧），并弹出带有阈值处理后图像的窗口（中间）。可使用矩形工具高亮并剔除不需要的非线虫“颗粒”，例如检测板上的标记（1）、板边缘（2）或琼脂穿刺孔（3）。（B）Murphy实验室趋化性检测成像工作站的照片。趋化性检测板从底部打光，以生成分析所需的高对比度图像。（C）趋化性成像站中使用的定制成像平台的示意图。

图4. 典型的关联学习与记忆结果。（A）野生型线虫对10%丁酮的初始趋化指数在集中训练（1次）后增加。这种习得的关联需要食物（OP50大肠杆菌）与丁酮的配对。 coli）和丁酮。柱状图上方的数字代表“学习指数”（LI = CI训练后 - CI_幼稚）。(B) 野生型线虫对10%丁酮的天然趋化性在饥饿16小时后显著增强。图A-D改编自Kauffman 等, 2010.⁶ （C）野生型短期关联记忆持续约2小时，且不依赖于转录因子CREB。（D）野生型长期关联记忆持续约40小时，且依赖于CREB。

补充信息

• 点击此处获取“imoverlay.m”文件。
• 点击此处获取“count_worms_image.m”文件。
• 点击此处获取“count_worms_directory.m”文件。
• 点击此处获取“cellwrite.m”文件。

讨论

C. elegans 的嗅觉关联学习与记忆检测方法可区分集中式学习、间隔式学习、短期记忆和长期记忆等不同过程。这些检测依赖于线虫感知环境中食物和化学气味的能力，以及在两者之间建立正向关联的能力^1,26。因此，该检测对起始动物群体的饥饿状态极为敏感，必须格外注意确保线虫在训练前后均处于充分喂养状态。单次集中训练可产生短期关联记忆。与其它生物类似，增加训练次数并采用间隔训练范式，对于在 C. elegans 中获得长期关联记忆至关重要^6,8。或许可对该检测方法进行改进，以生成不同条件刺激与非条件刺激之间关联的长期记忆。

我们的关联学习与记忆检测方法可用于比较野生型与衰老或遗传突变动物的学习和记忆能力。例如，尽管在衰老的野生型线虫中，关联学习能力和长期关联记忆能力均会下降，但胰岛素信号减弱的动物随着年龄增长，其学习能力维持时间更长；而在热量限制的动物中，学习和记忆能力随年龄增长的维持时间更长。⁶ 这些检测方法同样适用于对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行RNA干扰（RNAi）处理或药物干预。例如，用针对daf-2基因的RNAi处理线虫可改善其短期和长期关联记忆；相反，在间隔训练期间使用药物（分别为放线菌素D和环己酰亚胺）阻断基因转录和蛋白质合成，则会破坏长期记忆的形成。⁶

长期记忆是所有动物生存过程中至关重要的一个过程，而对经典条件反射记忆所涉及的分子机制似乎从线虫到哺乳动物都具有高度保守性⁶。利用这些嗅觉检测方法能够区分并检验关联学习、短期记忆和长期记忆的能力，使 C. elegans 成为深入研究记忆机制的优良模型系统，并可能为导致人类学习与记忆丧失的神经退行性过程提供重要见解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
叠氮化钠	Fisher Scientific	S227	用蒸馏水配制 1 M 浓度溶液
190 证明乙醇	Pharmco-AAPER	DSP-CT-18	>95% 乙醇可能含有干扰趋化实验的杂质
2-丁酮 99+%	Acros Organics	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire 面扫描 CMOS 相机	Edmund Scientific	NT56-683
InfiniMite 视频镜头 – Alpha Industrial	Edmund Scientific	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 光纤照明器	Edmund Scientific	NT55-718
8” x 8” 背光源	Schott AG	A08927
标准悬臂支架	Edmund Scientific	NT54-120
3/4” 悬臂支架接头适配器	Edmund Scientific	NT54-124
标准固定式 1/4-20 安装板	Edmund Scientific	NT54-122