从小鼠胚胎肾脏生肾区分离和培养细胞

摘要

本文介绍一种从小鼠胚胎肾脏中分离和培养前体细胞微环境的方法，可用于研究调控发育中肾脏干细胞/前体细胞的信号通路。这些培养的细胞易于接受小分子化合物和重组蛋白处理，更重要的是还可进行病毒转导，从而实现对候选通路的高效调控。

摘要

肾脏的胚胎发育已被广泛研究，既作为器官发生过程中上皮-间充质相互作用的模型，也用于深入了解先天性肾脏疾病的起源。近年来，在再生医学这一新兴领域中，研究人员开始探索如何引导幼稚的胚胎干细胞向肾源性命运分化。小鼠的遗传学研究已鉴定出多个肾脏发育所必需的信号通路，近期还建立了该器官基因转录的全局图谱。 http://www.gudmap.org/，提供了大量参与重要发育功能的候选调控因子。啮齿类动物肾脏的器官发生可通过器官培养进行研究，许多研究报告采用这种方法分析外源添加候选蛋白或利用siRNA或吗啉寡核苷酸敲低候选基因表达后的结果。然而，器官培养在研究发育中肾脏干细胞/祖细胞分化与自我更新相关信号通路方面的应用受到限制，原因是培养的器官含有致密的细胞外基质，阻碍了大分子物质和病毒颗粒的扩散。为了研究影响肾脏干细胞/祖细胞微环境的细胞信号事件，我们建立了一种原代细胞体系，可重建发育中肾脏的生肾区或祖细胞微环境 离体 从分化的上皮诱导因子中分离出来。通过有限的酶消化法，可在胚胎发育第17.5天（E17.5）选择性地从发育中的肾脏释放生肾区细胞。经过滤后，这些细胞可在优化条件下以不规则单层形式进行培养。标志基因分析表明，这些培养物包含具有生肾区特征的多种细胞类型。 体内，并且在培养期间维持适当的标志基因表达。这些细胞易于接受小分子化合物和重组蛋白处理，更重要的是也易于进行病毒转导，从而极大地方便了对候选干细胞/祖细胞调控因子作用的研究。诸如增殖、细胞死亡等基础细胞生物学参数，以及肾单位干细胞/祖细胞特征性分子标志物的表达变化 体内 可作为成功的实验结果加以利用。我们实验室目前利用这一新型原代细胞技术开展的后续工作，旨在揭示调控肾单位干细胞/前体细胞自我更新与分化平衡的基本机制。

方案

1. 准备肾脏消化所需的试剂

1. 从8个E17.5胚胎肾脏中提取生肾区细胞（NZCs）需要1.5 ml含0.25% Collagenase A（w/v）和1% Pancreatin消化液（w/v）。由于Pancreatin在室温下溶解约需2小时，因此应在实验前根据预计处理的最大胚胎肾数量提前配制足量的消化液。配制消化液时，首先将25 mg Collagenase A加入10 ml杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，置于透明15 ml无菌离心管内。必须确保所用DPBS不含钙或镁离子，否则将干扰酶消化过程。将溶液置于旋转混合仪上混匀10分钟，使Collagenase A充分溶解。随后向已溶解的Collagenase A溶液中加入100 mg Pancreatin，并在旋转混合仪上继续混合至少2小时。 alternatively，Collagenase A/Pancreatin消化液也可在旋转混合仪上过夜混合 4° C建议佩戴口罩，因为胶原酶A和胰蛋白酶在称量过程中易分散到空气中，可能刺激鼻腔通道。
2. 在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中配制 5% 胎牛血清（FBS）（v/v）溶液，颠倒混匀。每 8 个肾脏需准备 1 ml。
3. 通过向无血清角质形成细胞培养基中添加1%谷氨酰胺（v/v）和1%青霉素-链霉素（PenStrep）（v/v）来制备培养基。
4. 用浓度为每平方厘米5 mg的人类纤连蛋白溶液包被无菌平底聚苯乙烯组织培养板（96、48、24 或 6 孔）

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种从胚胎肾脏的生肾区分离并培养细胞的方法。该方法是在先前发表的一项研究基础上发展而来的，该研究探讨了BMP7处理对生肾区细胞的影响（Blank et al., 2009）。在最初的研究中，进行了一系列实验以鉴定生肾区细胞（NZC）群体中所包含的细胞类型。简而言之，利用皮质间充质（Foxd1^+/lacZ）（Hatini et al., 1996）、集合管（Hoxb7^+/cre;R26^rEYFP）（Srinivas et al., 2001; Yu et al., 2002）和帽状间充质（Bmp7^+/lacZ）（Godin et al., 1998）的遗传报告小鼠对NZCs进行纯化，结果显示，收获的NZCs中约35%为皮质间充质细胞，52%为帽状间充质细胞，而集合管污染少于0.04%。利用Bmp7^+/cre;R26

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钟表匠’s 镊子 #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	需要 2 对
胶原酶 A	Roche Group	10 103 578 001	佩戴口罩
猪胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	P8096	佩戴口罩
含 Ca、Mg 的 DPBS	Lonza Inc.	17-513F	含 Mg & Ca
胎牛血清 (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	不含添加的生长因子
L-谷氨酰胺 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513	使用浓度为 1% v/v
青霉素-链霉素溶液（10,000 U 青霉素/mL，10 mg 链霉素/mL）	Sigma-Aldrich	P4333	使用浓度为 1% v/v
纤连蛋白	BD Biosciences	356008	以粉末形式提供
24 孔培养板	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
不含 Mg & Ca 的 DPBS	Lonza Inc.	17-512F
5 mL 聚苯乙烯管	BD Biosciences	352235
DNase（1 U/μl）	Invitrogen	18068-015	每 1.5 ml 加入 4 μl
40 微米细胞筛	BD Biosciences	352235	带盖和收集管
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	使用浓度为 4% w/v
Triton X-100	VWR international	VW3929-2	使用浓度为 0.3% v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	以粉末形式提供
驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	使用浓度为 5% v/v
兔抗 PAX2 抗体	Invitrogen	71-6000	稀释比例为 1:100
兔抗-β-半乳糖苷酶抗体	MP Biomedicals	559762	稀释比例为 1:200
Oregon Green 488 鬼笔环肽	Invitrogen	O7466	稀释比例为 1:200
驴抗兔 Alexa Fluor 568 抗体	Invitrogen	A10042	稀释比例为 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	稀释比例为 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
甘油	EMD Millipore	GX0185-6	与 H2O 按 50% 混合
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	使用 "柱上 DNase" 操作流程
移液管，3 ml	BD Biosciences	357575