本文介绍一种从小鼠胚胎肾脏中分离和培养前体细胞微环境的方法，可用于研究调控发育中肾脏干细胞/前体细胞的信号通路。这些培养的细胞易于接受小分子化合物和重组蛋白处理，更重要的是还可进行病毒转导，从而实现对候选通路的高效调控。
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摘要
摘要
肾脏的胚胎发育已被广泛研究，既作为器官发生过程中上皮-间充质相互作用的模型，也用于深入了解先天性肾脏疾病的起源。近年来，在再生医学这一新兴领域中，研究人员开始探索如何引导幼稚的胚胎干细胞向肾源性命运分化。小鼠的遗传学研究已鉴定出多个肾脏发育所必需的信号通路，近期还建立了该器官基因转录的全局图谱。 http://www.gudmap.org/，提供了大量参与重要发育功能的候选调控因子。啮齿类动物肾脏的器官发生可通过器官培养进行研究，许多研究报告采用这种方法分析外源添加候选蛋白或利用siRNA或吗啉寡核苷酸敲低候选基因表达后的结果。然而，器官培养在研究发育中肾脏干细胞/祖细胞分化与自我更新相关信号通路方面的应用受到限制，原因是培养的器官含有致密的细胞外基质，阻碍了大分子物质和病毒颗粒的扩散。为了研究影响肾脏干细胞/祖细胞微环境的细胞信号事件，我们建立了一种原代细胞体系，可重建发育中肾脏的生肾区或祖细胞微环境 离体 从分化的上皮诱导因子中分离出来。通过有限的酶消化法，可在胚胎发育第17.5天（E17.5）选择性地从发育中的肾脏释放生肾区细胞。经过滤后，这些细胞可在优化条件下以不规则单层形式进行培养。标志基因分析表明，这些培养物包含具有生肾区特征的多种细胞类型。 体内，并且在培养期间维持适当的标志基因表达。这些细胞易于接受小分子化合物和重组蛋白处理，更重要的是也易于进行病毒转导，从而极大地方便了对候选干细胞/祖细胞调控因子作用的研究。诸如增殖、细胞死亡等基础细胞生物学参数，以及肾单位干细胞/祖细胞特征性分子标志物的表达变化 体内 可作为成功的实验结果加以利用。我们实验室目前利用这一新型原代细胞技术开展的后续工作，旨在揭示调控肾单位干细胞/前体细胞自我更新与分化平衡的基本机制。
方案
1. 准备肾脏消化所需的试剂
- 从8个E17.5胚胎肾脏中提取生肾区细胞（NZCs）需要1.5 ml含0.25% Collagenase A（w/v）和1% Pancreatin消化液（w/v）。由于Pancreatin在室温下溶解约需2小时，因此应在实验前根据预计处理的最大胚胎肾数量提前配制足量的消化液。配制消化液时，首先将25 mg Collagenase A加入10 ml杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，置于透明15 ml无菌离心管内。必须确保所用DPBS不含钙或镁离子，否则将干扰酶消化过程。将溶液置于旋转混合仪上混匀10分钟，使Collagenase A充分溶解。随后向已溶解的Collagenase A溶液中加入100 mg Pancreatin，并在旋转混合仪上继续混合至少2小时。 alternatively，Collagenase A/Pancreatin消化液也可在旋转混合仪上过夜混合 4° C建议佩戴口罩，因为胶原酶A和胰蛋白酶在称量过程中易分散到空气中，可能刺激鼻腔通道。
- 在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中配制 5% 胎牛血清（FBS）（v/v）溶液，颠倒混匀。每 8 个肾脏需准备 1 ml。
- 通过向无血清角质形成细胞培养基中添加1%谷氨酰胺（v/v）和1%青霉素-链霉素（PenStrep）（v/v）来制备培养基。
- 用浓度为每平方厘米5 mg的人类纤连蛋白溶液包被无菌平底聚苯乙烯组织培养板（96、48、24 或 6 孔）2 生长表面。将5 mg纤连蛋白粉末重悬于5 ml无菌H2O。将其用不含钙和镁的无菌DPBS按1:25稀释，每孔加入250 ml至24孔板中。随后将板在室温下与纤连蛋白溶液孵育1小时，接着再孵育1小时于 4° C. 或者，平板可在 4° C然后在超净工作台中吸除溶液，再加入培养基/细胞。
2. 解剖肾脏并去除包膜（在室温下进行）
- 在E17.5时，采用贵机构动物护理与使用委员会批准的方法处死母鼠，取出子宫并置于含有钙和镁的DPBS的培养皿中。在解剖显微镜下，使用钟表匠镊子将每个胚胎从子宫中取出，并对每个胚胎进行断头处理。待整窝胚胎全部取出后，将胚胎转移至另一个干净的培养皿中，加入足量含钙和镁的DPBS，完全浸没胚胎，尽可能留下血液和组织碎片。
- 使用镊子在胚胎脐部水平的腹壁上做环形切口。然后将胚胎仰面放置，用一对镊子固定肩部，用另一对镊子将从肺部至膀胱的内脏器官整体取出。熟练后可一次完成该操作。肾脏应附着于器官团块的背面。若肾脏未随去内脏的器官保留下来，可小心地从背部体壁分离取出。在解剖过程中受损的肾脏应予以丢弃，因其会污染最终培养物并引入不适当的细胞类型。
- 用镊子轻轻将肾脏与其他器官分离，注意保持两侧肾脏相互连接。用一对镊子夹住两肾之间的组织，用另一对镊子夹住附着于其中一个肾脏的肾上腺。肾上腺应附着于肾包膜上。轻轻从肾脏外周剥离肾上腺及其包膜，类似于剥香蕉的动作。剥离时注意不要将肾脏撕成两半，确保不损伤包膜下方的肾组织。仔细去除残留的包膜以及仍附着的输尿管。对另一侧肾脏重复此操作。
- 使用剪口的移液管将肾脏转移至含有5 ml聚苯乙烯管的HBSS中。对每个胚胎重复步骤2.2–2.4。每管可汇集8个肾脏。熟练后，每个胚胎的解剖及包膜去除过程需时2–3分钟。
3. 肾脏的酶消化（除特别注明外，所有步骤均在室温下进行）
- 从含有肾脏的5 ml离心管中用移液器吸除HBSS溶液，注意避免接触肾脏组织。立即向含有肾脏的5 ml离心管中加入1.5 ml Collagenase A/Pancreatin消化液，然后进行下一个样本操作。对每管肾脏重复上述步骤。
- 将含有酶/肾脏消化液的离心管置于预热的旋转混合仪上 37° C 孵育15分钟。在消化结束前2分钟，加入 3 μl 每进行一次消化反应，向一个新鲜的5 ml聚苯乙烯管中加入DNase（1 U/ml）。
- 迅速将消化液从培养箱中取出，加入 75 μl 加入FBS，倒置混匀3次，室温静置2分钟。
- 将1.4 ml细胞悬液转移至含有DNase（1 U/ml）的5 ml聚苯乙烯管中，留下剩余的0.2 ml细胞悬液及肾脏组织。残留的0.2 ml溶液将含有细胞外基质等杂质。
- 将细胞悬液与DNase在预热的旋转混合仪上混合 37° C 孵育10分钟。
- 迅速将细胞悬液从培养箱中取出，分别转移至1.5 ml Eppendorf管中。在微量离心机中以325 g离心5分钟。
- 去除细胞沉淀中的上清液，加入1 ml含5% FBS的HBSS重悬沉淀，上下吹打5至6次。处理下一个样本前，需先盖紧每根离心管管盖。
- 在微型离心机中以325 g离心细胞悬液5分钟。
- 吸除上清液，向每支试管中加入 0.5 ml 含添加剂的无血清角质形成细胞培养基（KSFM），盖好管盖，再处理下一个样本。待所有试管均加入培养基后，用 1 ml 微量移液器轻柔吹打每支试管中的细胞沉淀 5 至 6 次，使细胞充分重悬。将所有细胞悬液合并至一支新的 5 ml 聚苯乙烯试管中。
- 将两个40微米细胞筛帽置于5 ml聚苯乙烯圆底管上，每份样品用KSFM预润湿。使用1 ml移液器将细胞悬液转移通过一个细胞筛帽，避免移液器吸头接触滤膜。收集滤过液，并通过第二个细胞筛帽重复过滤。移除细胞筛帽，换上普通5 ml聚苯乙烯管的管帽。
- 使用血细胞计数板或其他细胞计数装置计数细胞，并将细胞以每平方厘米100,000–200,000个细胞的密度接种至纤维连接蛋白包被的培养板孔中2，根据需要使用含添加剂的KSFM稀释。通常情况下，我们可获得约4.5x106 每10个胚胎窝的细胞数。
- 将细胞置于培养箱中孵育 37° C 5% CO₂湿润培养箱2.
- 让细胞在培养基中恢复并贴壁2-4小时，随后用其他试剂进行刺激。用目标化合物刺激细胞1至48小时。使用Qiagen RNeasy Micro Kit按照制造商说明书纯化RNA用于PCR分析，或按照以下步骤对细胞进行荧光免疫染色。
4. 细胞固定和免疫染色试剂的准备
- 配制 4% PFA：将 4% 多聚甲醛溶于 PBS（v/v）中，在 55°C 下持续搅拌溶解。使用前冷却至室温。该溶液具有毒性，应弃置于指定的废液容器中。
- 配制通透液：将 Triton X-100 加入 PBS 中，配制成 0.3%（v/v）的溶液。
- 用与二抗宿主物种相同的血清在 PBS 中配制 5% 封闭液。例如，若使用驴抗兔 Alexa Fluor 568 检测靶抗原的兔源一抗，则应配制含 5% 驴血清的封闭液。4°C 保存。
- 将适量浓度的一抗加入 5% 封闭液中，配制一抗溶液。
- 使用前立即配制二抗溶液。将荧光标记的二抗按厂家推荐浓度与核复染试剂 DAPI 及其他细胞器标记物（如鬼笔环肽）一同加入 5% 封闭液中。如需保存，应避光置于 4°C 直至使用。
- 用 PBS 配制 50% 甘油溶液（v/v），用于免疫染色细胞的封片保存。也可选用 Vectashield 封片剂。
5. 细胞固定与免疫染色
- 以下方案适用于在24孔板中对NZCs进行固定和染色。所给体积为单个孔的用量。所有步骤中应轻柔使用移液器，以避免细胞脱落，且不建议在孵育步骤中振荡培养板。
- 用1 ml移液器轻轻吸去培养基，并向贴壁培养的细胞中加入0.5 ml的4% PFA。在室温下静置孵育15分钟。
- 吸去4% PFA，每孔加入0.5 ml通透化溶液。在室温下孵育10分钟。
- 去除通透化溶液，每次用0.5 ml PBS轻轻冲洗，共冲洗两次。
- 加入0.5 ml封闭液，在室温下孵育60分钟。
- 吸去封闭液，每孔加入0.225 ml一抗溶液。
- 在室温下孵育2小时，或在4° C下过夜孵育。
- 吸去一抗溶液，每次用0.5 ml PBS轻轻冲洗，共冲洗两次。
- 加入0.225 ml二抗溶液。将培养板置于避光条件下，在室温下孵育60分钟。
- 吸去二抗溶液，每次用0.5 ml PBS轻轻冲洗，共冲洗两次。
- 加入0.3 ml 50%甘油/PBS溶液（v/v），或加入足量Vectashield以覆盖孔底表面。
- 使用落射荧光显微镜观察细胞，或将样品用铝箔包裹后于4° C保存。
6. 代表性结果
图1. NZCs 从 E17.5 胚胎中分离纯化，以每平方厘米 200,000 个细胞的密度接种培养2 并在指定温度下孵育 37° C 共培养24小时。在进行免疫荧光染色前，使用Leica DM IRB倒置显微镜通过相差显微镜观察细胞。（A）培养24小时后NZCs的20倍相差显微图像。（B）细胞经固定后，使用特异性识别肾单位前体细胞的兔抗PAX2抗体（红色）及Alexa Fluor 568标记的驴抗兔二抗进行染色。注意使用DAPI复染的蓝色细胞核。（C）培养24小时后位于中央的一簇肾单位前体细胞的40倍相差显微图像。（D）从LacZ+胚胎中分离的NZCs的40倍图像 Foxd1LacZ 菌株，该菌株在控制下表达β-半乳糖苷酶 Foxd1 启动子 Foxd1 在发育中肾脏的生肾区间质细胞群体中表达。细胞使用F-actin标记物鬼笔环肽（Oregon Green初代偶联物）、核染料DAPI（蓝色）以及兔抗β-半乳糖苷酶抗体（二抗：Alexa Fluor驴抗兔568）进行染色以检测 Foxd1+ 间质细胞（红色）。
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种从胚胎肾脏的生肾区分离并培养细胞的方法。该方法是在先前发表的一项研究基础上发展而来的，该研究探讨了BMP7处理对生肾区细胞的影响（Blank et al., 2009）。在最初的研究中，进行了一系列实验以鉴定生肾区细胞（NZC）群体中所包含的细胞类型。简而言之，利用皮质间充质（Foxd1+/lacZ）（Hatini et al., 1996）、集合管（Hoxb7+/cre;R26rEYFP）（Srinivas et al., 2001; Yu et al., 2002）和帽状间充质（Bmp7+/lacZ）（Godin et al., 1998）的遗传报告小鼠对NZCs进行纯化，结果显示，收获的NZCs中约35%为皮质间充质细胞，52%为帽状间充质细胞，而集合管污染少于0.04%。利用Bmp7+/cre;R26
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了NIDDK（LO）提供的R01 DK078161项目资助，以及美国心脏协会（AB）、瑞典温纳-格伦基金会和瑞典隆德皇家物理学会（UB）提供的博士后奖学金。缅因州医疗中心研究所组织病理学、生物信息学和FACS核心设施（由2P20RR18789-06项目支持）以及MMCR动物设施提供了额外支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钟表匠’s 镊子 #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 需要 2 对 |
| 胶原酶 A | Roche Group | 10 103 578 001 | 佩戴口罩 |
| 猪胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P8096 | 佩戴口罩 |
| 含 Ca、Mg 的 DPBS | Lonza Inc. | 17-513F | 含 Mg & Ca |
| 胎牛血清 (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | 不含添加的生长因子 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513 | 使用浓度为 1% v/v |
| 青霉素-链霉素溶液（10,000 U 青霉素/mL，10 mg 链霉素/mL） | Sigma-Aldrich | P4333 | 使用浓度为 1% v/v |
| 纤连蛋白 | BD Biosciences | 356008 | 以粉末形式提供 |
| 24 孔培养板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| 不含 Mg & Ca 的 DPBS | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5 mL 聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase（1 U/μl） | Invitrogen | 18068-015 | 每 1.5 ml 加入 4 μl |
| 40 微米细胞筛 | BD Biosciences | 352235 | 带盖和收集管 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 使用浓度为 4% w/v |
| Triton X-100 | VWR international | VW3929-2 | 使用浓度为 0.3% v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | 以粉末形式提供 |
| 驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 使用浓度为 5% v/v |
| 兔抗 PAX2 抗体 | Invitrogen | 71-6000 | 稀释比例为 1:100 |
| 兔抗-β-半乳糖苷酶抗体 | MP Biomedicals | 559762 | 稀释比例为 1:200 |
| Oregon Green 488 鬼笔环肽 | Invitrogen | O7466 | 稀释比例为 1:200 |
| 驴抗兔 Alexa Fluor 568 抗体 | Invitrogen | A10042 | 稀释比例为 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 稀释比例为 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 甘油 | EMD Millipore | GX0185-6 | 与 H2O 按 50% 混合 |
| RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen | 74004 | 使用 "柱上 DNase" 操作流程 |
| 移液管，3 ml | BD Biosciences | 357575 |
参考文献
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
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