利用生物发光成像评估工程化心肌组织（EHT）植入后的免疫反应

摘要

本视频演示了 在体 利用生物发光成像研究大鼠植入工程化心肌组织（EHT）后的免疫反应

摘要

过去几十年中，人们已探索了多种心脏组织工程技术，包括使用天然或生物人工支架材料的支架策略、将心肌细胞包埋于纤维蛋白或胶原等水凝胶中，以及心肌细胞单层的堆叠¹。这些方法旨在恢复受损的心脏功能（例如心肌梗死后），或作为实验模型（例如用于预测性毒理学、物质筛选或疾病建模）。如今，利用活体生物发光成像（BLI）技术，已可精确监测工程化心肌组织（EHT）植入后的细胞存活情况²。本文描述了利用一种全身性表达萤火虫荧光素酶的转基因大鼠品系（ROSA/luciferase-LEW Tg；³）制备基于纤维蛋白的EHT的方法。将EHT植入不同大鼠品系的大网膜中，以评估受体机体在EHT植入后的免疫反应。通过BLI与酶联免疫斑点技术（ELISPOT）所得结果的比较，证实了BLI在评估免疫反应方面的可用性。

方案

1. EHT 的生成与培养条件

基于纤维蛋白的工程化心脏组织（EHT）的制备方法如先前文献所述⁴。简言之，为生成可用于移植的基于纤维蛋白的EHT，配制一种主混合液，其中包含从新生ROSA/luciferase-LEW转基因大鼠心脏中分离的细胞、牛纤维蛋白原和Matrigel。使用置于6孔培养板中的聚四氟乙烯（Teflon）间隔物制备琼脂糖铸造模具。琼脂糖凝固后，移除间隔物，并将带有硅胶支柱的支架架置于培养板上，使支柱伸入模具内。为生成EHT，将主混合液与计算量的凝血酶短暂混合后，用移液器加入模具中。纤维蛋白原聚合后，将带有附着于支柱上的EHT的硅胶支架轻轻从琼脂糖模具中取出，转移至新的6孔细胞培养板中，并在37°C、7% CO₂的细胞培养孵育箱中，使用定制的细胞培养基进行维持培养。

EHT 在细胞培养条件下培养至第10天。在此期间，新生大鼠心肌细胞开始沿硅胶柱之间的受力方向伸长、相互连接并排列整齐。在植入时，可观察到细胞出现自发的协调性收缩，并使硅胶柱发生偏转。

2. EHT 植入

为研究同种异体免疫反应，在免疫功能健全的布朗-挪威（BN）大鼠或免疫缺陷型裸鼠中进行了EHT移植。体重为100–150 g的BN大鼠和裸鼠购自德国查尔斯河公司（Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld），在常规条件下饲养，自由摄取标准大鼠饲料和水。免疫缺陷型大鼠饲养于无菌垫料和笼具中，并使用灭菌水。动物实验程序已通过德国伦理审查委员会的审查和批准。所有手术器械在使用前均经过灭菌处理。

植入手术的操作步骤如下：

使用诱导室通过异氟烷（2.5-3%）对大鼠进行麻醉。在下吹式工作台或非循环通风橱中操作可减少人体接触异氟烷。手术过程中需维持动物体温。

1. 剃除腹部区域毛发，并涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。
2. 将大鼠仰卧放置，并在其鼻口部覆盖面罩以维持麻醉状态。
3. 使用聚维酮碘（Betadine）和80%乙醇对腹部区域进行消毒。擦拭时应从清洁区域向污染区域进行，即从剃毛区域中心向外周有毛区域移动。
4. 通过夹捏后肢足部检查反射，确认大鼠已充分麻醉。
5. 对动物进行铺巾，行腹正中切口，分两步分别切开皮肤和肌肉层以进入腹腔。皮肤与肌肉切开之间使用热珠灭菌法进行器械灭菌。
6. 将肠管置于预热的、用生理盐水湿润且无粉的手套中，将手套包裹肠管以防止水分流失。
7. 清除脂肪组织，暴露脾脏。
8. 用镊子观察并展开大网膜。
9. 小心地将EHT从支撑的硅胶柱上剪下，并转移至大网膜上。
10. 将大网膜包裹EHT，并使用两根7-0 Prolene单缝线（Ethicon, Norderstedt, Germany）固定。
11. 随后将肠管复位回腹腔内。
12. 用预热的无菌生理盐水冲洗腹腔。
13. 使用6-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合腹壁肌肉层。
14. 使用5-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合皮肤。
15. 在大鼠仍处于麻醉状态时，皮下注射5 mg/kg的卡洛芬（Carprofen）。
16. 为为此类手术提供充分镇痛，术后3天内需在饮水中添加镇痛药（如美洛昔康，Metamizol），剂量为每100 ml水含50 mg Metamizol。

3. 移植后EHT的生物发光成像

IVIS 生物成像平台（Xenogen，Alameda，CA，USA）用于非侵入性生物发光成像 体内 使用 IVIS Living Image（Xenogen）软件包分析结果。术后2小时开始每日进行成像。

使用诱导室以异氟烷（2.5 - 3%）对大鼠进行麻醉。

1. 使用聚维酮碘广泛消毒腹部和胸部区域，随后使用80%乙醇，重复此步骤三次。
2. 腹腔注射d-荧光素（Xenogen；375 mg/kg体重）。
3. 将麻醉后的大鼠放入IVIS成像室（每次最多可同时分析4只大鼠）。
4. 在感兴趣区域（ROI）内，于基线水平（移植后120分钟）以及第1、2、3、5、7、10天和第2、3、4周，以光子/秒/平方厘米/球面度（photons/sec/cm²/steradian）为单位评估EHT内luc+细胞的信号强度。注意记录信号峰值（通常出现在d-荧光素注射后约20分钟）。

创建一个图表（Excel），显示信号强度随时间的变化。

4. BLI 结果与 ELISPOT 的相关性分析

细胞的 体内 在EHT移植后，研究了免疫功能健全的BN大鼠和免疫缺陷的裸鼠的免疫反应。移植后第5天采集受体动物的脾脏，以分离受体脾细胞。ELISpot实验采用丝裂霉素抑制的EHT（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）作为刺激物，与5 x10⁵⁶ 以受体脾细胞作为反应细胞，按照制造商说明书（BD Biosciences）使用包被IFN-γ和IL-4抗体的板分别检测TH1和TH2型免疫应答。与免疫缺陷模型相比，免疫功能健全模型中IFN-γ和IL-4斑点数显著升高（IFN-γ：p = 0.001；IL-4：p = 0.023；Student t检验）。

5. 代表性结果：

图1. BLI结果与ELISpot的相关性 a) 在EHT植入后，研究了免疫功能健全的Brown Norway大鼠与免疫缺陷裸鼠体内的细胞免疫应答。EHT植入5天后收集受体脾细胞，采用丝裂霉素处理的EHT作为刺激细胞，5×10⁶个受体脾细胞作为反应细胞，通过ELISpot法检测IFNγ和IL-4的表达。Th1和Th2应答在免疫功能健全模型中显著高于免疫缺陷模型，分别表现为IFNγ和IL-4的产生增加。b) 将Luc+ EHT移植至免疫功能健全的BN大鼠或免疫缺陷裸鼠的大网膜中，通过生物发光成像（BLI）对细胞存活情况进行纵向监测。图中显示了排斥移植EHT的动物比例。所有BN大鼠均迅速排斥了EHT移植物，而在T细胞缺陷型大鼠中，细胞得以存活。

讨论

在将EHT技术应用于临床心脏修复之前，需在实验模型中评估一些基础性问题，例如细胞和基质成分的免疫原性以及移植后移植物的存活情况。 体内 生物发光成像是一种用于监测细胞移植后存活情况的有用新技术。通过改进已有方案，我们成功制备了含有荧光素酶阳性（luc+）心肌细胞的基于纤维蛋白的工程化心肌组织 ⁴将这些EHT植入受体大鼠的大网膜中。通过腹腔注射特异性底物（d-Luciferin），可利用IVIS生物成像平台（Xenogen）检测产生的信号。在植入后120分钟（基线）测得的信号强度，单位为光子/秒/平方厘米。²/steridian 作为移植心外膜组织片（EHT）内细胞数量的替代参数。每日测量可实现对移植物存活情况的无创性纵向评估。在排斥反应模型中，信号强度随时间下降的程度与不同大鼠品系急性排斥反应的强度和动力学特征相关。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk 大鼠（NBPR 大鼠编号 0299，http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/） <李>牛纤维蛋白原（储存液：200 mg/ml 加抑肽酶 5 μg/ml 纤维蛋白原，溶于 0.9% NaCl，Sigma F4753<李>Matrigel（BD Bioscience 356235） DMEM（Biochrome F0415） <李>马血清（Gibco 26050）<李>青霉素/链霉素（Gibco 15140）<李>胰岛素（Sigma-Aldrich I9278）<李>抑肽酶（Sigma Aldrich A1153）<李>D-荧光素（Biosynth L-8220）<李>酶联免疫斑点（ELISpot）检测板（Hassa Laborbedarf，S2EM004M99）