利用生物发光成像评估工程化心肌组织（EHT）植入后的免疫反应

摘要

本视频演示了 在体 利用生物发光成像研究大鼠植入工程化心肌组织（EHT）后的免疫反应

摘要

过去几十年中，人们已探索了多种心脏组织工程技术，包括使用天然或生物人工支架材料的支架策略、将心肌细胞包埋于纤维蛋白或胶原等水凝胶中，以及心肌细胞单层的堆叠¹。这些方法旨在恢复受损的心脏功能（例如心肌梗死后），或作为实验模型（例如用于预测性毒理学、物质筛选或疾病建模）。如今，利用活体生物发光成像（BLI）技术，已可精确监测工程化心肌组织（EHT）植入后的细胞存活情况²。本文描述了利用一种全身性表达萤火虫荧光素酶的转基因大鼠品系（ROSA/luciferase-LEW Tg；³）制备基于纤维蛋白的EHT的方法。将EHT植入不同大鼠品系的大网膜中，以评估受体机体在EHT植入后的免疫反应。通过BLI与酶联免疫斑点技术（ELISPOT）所得结果的比较，证实了BLI在评估免疫反应方面的可用性。

方案

1. EHT 的生成与培养条件

基于纤维蛋白的工程化心脏组织（EHT）的制备方法如先前文献所述⁴。简言之，为生成可用于移植的基于纤维蛋白的EHT，配制一种主混合液，其中包含从新生ROSA/luciferase-LEW转基因大鼠心脏中分离的细胞、牛纤维蛋白原和Matrigel。使用置于6孔培养板中的聚四氟乙烯（Teflon）间隔物制备琼脂糖铸造模具。琼脂糖凝固后，移除间隔物，并将带有硅胶支柱的支架架置于培养板上，使支柱伸入模具内。为生成EHT，将主混合液与计算量的凝血酶短暂混合后，用移液器加入模具中。纤维蛋白原聚合后，将带有附着于支柱上的EHT的硅胶支架轻轻从琼脂糖模具中取出，转移至新的6孔细胞培养板中，并在37°C、7% CO₂的细胞培养孵育箱中，使用定制的细胞培养基进行维持培养。

EHT 在细胞培养条件下培养至第10天。在此期间，新生大鼠心肌细胞开始沿硅胶柱之间的受力方向伸长、相互连接并排列整齐。在植入时，可观察到细胞出现自发的协调性收缩，并使硅胶柱发生偏转。

2. EHT 植入

为研究同种异体免疫反应，在免疫功能健全的布朗-挪威（BN）大鼠或免疫缺陷型裸鼠中进行了EHT移植。体重为100–150 g的BN大鼠和裸鼠购自德国查尔斯河公司（Sandhofer Weg 7, D....

讨论

在将EHT技术应用于临床心脏修复之前，需在实验模型中评估一些基础性问题，例如细胞和基质成分的免疫原性以及移植后移植物的存活情况。 体内 生物发光成像是一种用于监测细胞移植后存活情况的有用新技术。通过改进已有方案，我们成功制备了含有荧光素酶阳性（luc+）心肌细胞的基于纤维蛋白的工程化心肌组织 ⁴将这些EHT植入受体大鼠的大网膜中。通过腹腔注射特异性底物（d-Luciferin），可利用IVIS生物成像平台（Xenogen）检测产生的信号。在植入后120分钟（基线）测得的信号强度，单位为光子/秒/平方厘米。²/steridian 作为移植心外膜组织片（EHT）内细胞数量的替代参数。每日测量可实现对移植物存活情况的无创性纵向评估。在排斥反应模型中，信号强度随时间下降的程度与不同大鼠品系急性排斥反应的强度和动力学特征相关。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk 大鼠（NBPR 大鼠编号 0299，http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/） <李>牛纤维蛋白原（储存液：200 mg/ml 加抑肽酶 5 μg/ml 纤维蛋白原，溶于 0.9% NaCl，Sigma F4753<李>Matrigel（BD Bioscience 356235） DMEM（Biochrome F0415） <李>马血清（Gibco 26050）<李>青霉素/链霉素（Gibco 15140）<李>胰岛素（Sigma-Aldrich I9278）<李>抑肽酶（Sigma Aldrich A1153）<李>D-荧光素（Biosynth L-8220）<李>酶联免疫斑点（ELISpot）检测板（Hassa Laborbedarf，S2EM004M99）