iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

摘要

RNA结合蛋白在转录本上的空间排布是转录后调控的关键决定因素。因此，我们开发了单核苷酸分辨率的紫外交联免疫沉淀技术（iCLIP），可实现RNA结合蛋白结合位点的精确全基因组定位。

摘要

转录本上RNA结合蛋白（RBPs）的独特组成和空间排列指导着转录后调控的各个方面¹。因此，要从分子水平上理解转录本的调控机制，关键的一步是获取RBPs结合位点的位置信息²。

蛋白质与RNA相互作用可通过生物化学方法进行研究，但这些方法无法在RNA天然的细胞环境中研究其结合情况。早期在细胞环境中研究蛋白质-RNA复合物的尝试采用了亲和纯化或免疫沉淀结合差异显示或微阵列分析（RIP-CHIP）^3-5。这些方法容易鉴定出间接或非生理性的相互作用⁶。为了提高特异性和定位分辨率，研究人员提出了一种称为CLIP（紫外线交联和免疫沉淀）的策略^7,8。CLIP将蛋白质与RNA分子的紫外线交联与严格的纯化流程相结合，包括变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结合高通量测序技术，CLIP已被证明是一种在全基因组范围内研究蛋白质-RNA相互作用的强大工具（称为HITS-CLIP或CLIP-seq）^9,10。最近，又发展出PAR-CLIP技术，该技术利用光反应性核糖核苷类似物进行交联^11,12。

尽管所获得的数据具有很高的特异性，CLIP实验常常产生序列复杂性有限的cDNA文库。这部分是由于共纯化的RNA量有限，以及文库构建过程中所需的两次RNA连接反应效率较低所致。此外，引物延伸实验表明，许多cDNA在交联核苷酸处提前截断¹³。这类截短的cDNA在标准CLIP文库构建流程中会丢失。我们近期开发了iCLIP（单核苷酸分辨率CLIP），通过将一个低效的分子间RNA连接步骤替换为更高效的分子内cDNA环化，从而捕获这些截短的cDNA（图1）¹⁴。重要的是，对截短cDNA进行测序可提供交联位点在核苷酸水平上的精确定位信息。我们已成功应用iCLIP在全基因组范围内研究hnRNP C颗粒的组织结构，并评估其在剪接调控中的作用¹⁴。

方案

1. 组织培养细胞的紫外交联

1. 吸去培养基，向生长在10 cm培养皿中的细胞加入6 ml预冷的PBS（足够进行三次实验）。
2. 移去皿盖，将培养皿置于冰上。在254 nm波长下以150 mJ/cm²剂量照射一次。
3. 使用细胞刮轻轻刮取，收集细胞。
4. 将2 ml细胞悬液分别转移至三个微量离心管中。在4°C下以最大转速离心10秒，使细胞沉淀，随后吸去上清液。
5. 将细胞沉淀在干冰上速冻，并于-80°C保存直至使用。

2. 磁珠准备

1. 每个实验加入 100 μl 蛋白 A Dynabeads（Dynal, 100.02）至新的微量离心管中（若使用小鼠或山羊来源的抗体，则使用蛋白 G Dynabeads）。
2. 用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 7.4；100 mM NaCl；1% NP-40；0.1% SDS；0.5% 脱氧胆酸钠；1/100 蛋白酶抑制剂混合物 III，Calbiochem）洗涤磁珠 2 次。
3. 将磁珠重悬于含 2–10 μg 抗体的 100 μl 裂解缓冲液中。
4. 室温下旋转孵育 30–60 分钟。
5. 用 900 μl 裂解缓冲液洗涤 3 次，最后一次洗涤后保留缓冲液，待准备进行步骤 4.1 时再继续操作。

3. 细胞裂解和部分RNA消化

1. 将细胞沉淀重悬于 1 ml 裂解缓冲液中，并转移至 1.5 ml 微管中。
2. 制备 1/500 稀释度的 RNase I（Ambion, AM2295）。向细胞裂解物中加入 10 μl RNase I 稀释液以及 2 μl Turbo DNase（文库构建使用 1/500 RNase I 稀释液 [低 RNase]；为验证抗体特异性需使用 1/50 稀释液 [高 RNase]）。
3. 将样品在 37°C 下准确孵育 3 分钟，同时以 1,100 rpm 振荡。立即转移至冰上。
4. 在 4°C 下以 22,000 g 离心 20 分钟以澄清裂解物。小心收集上清液（留下约 50 μl 裂解液与沉淀一同保留）。

4. 免疫沉淀

1. 从步骤2.5中取出珠子的洗涤缓冲液，然后加入细胞裂解物（来自步骤3.4）。
2. 在4°C下旋转孵育样品2小时。
3. 弃去上清液，用900 μl高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1 M NaCl；1 mM EDTA；1% NP-40；0.1% SDS；0.5%脱氧胆酸钠）洗涤珠子2次。
4. 用900 μl洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；10 mM MgCl₂；0.2% Tween-20）洗涤2次。

5. RNA 3'末端去磷酸化

1. 弃去上清液，将珠子重悬于20 μl PNK混合液中（15 μl水；4 μl 5x PNK pH 6.5缓冲液[350 mM Tris-HCl, pH 6.5；50 mM MgCl₂，25 mM二硫苏糖醇]；0.5 μl PNK酶；0.5 μl RNasin [Promega]）。
2. 在37°C孵育20分钟。
3. 加入500 μl洗涤缓冲液，用高盐缓冲液洗涤1次。
4. 用洗涤缓冲液洗涤2次。

6. 连接子连接至RNA 3'末端

1. 小心移除上清液，并将磁珠重悬于 20 μl 连接反应体系中（9 μl 水；4 μl 4x 连接缓冲液 [200 mM Tris-HCl; 40 mM MgCl₂; 40 mM 二硫苏糖醇]；1 μl RNA 连接酶 [NEB]；0.5 μl RNasin [Promega]；1.5 μl 预腺苷酰化接头 L3 [20 μM]；4 μl PEG400 [81170, Sigma]）。
2. 在 16°C 下孵育过夜。
3. 加入 500 μl 洗涤缓冲液，随后用 1 ml 高盐缓冲液洗涤两次。
4. 用 1 ml 洗涤缓冲液洗涤两次，并将第二次洗涤后的缓冲液保留 1 ml。

7. RNA 5'端标记

1. 移除上清液，并将珠子重悬于8 μl热PNK混合液中（0.4 μl PNK [NEB]；0.8 μl ³²P-γ-ATP；0.8 μl 10x PNK缓冲液[NEB]；6 μl水）。
2. 在37°C下孵育5分钟。
3. 移除热PNK混合液，并将珠子重悬于20 μl 1x Nupage上样缓冲液（Invitrogen）中。
4. 在70°C的恒温混匀仪中孵育10分钟。
5. 立即置于磁力架上使空珠沉淀，将上清液上样至凝胶（参见步骤8）。

8. SDS-PAGE 和膜转移

1. 根据制造商说明，将样品上样至4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen）。使用0.5 l的1x MOPS电泳缓冲液（Invitrogen）。同时加入5 μl预染蛋白质分子量标记物（例如PAGE ruler plus，Fermentas，SM1811）。
2. 在180 V电压下电泳50分钟。
3. 切下凝胶前缘并作为固体废弃物丢弃（含有游离的放射性ATP）。
4. 使用Novex湿转装置，按照制造商说明将蛋白质-RNA复合物从凝胶转移至硝酸纤维素膜上（Invitrogen，30 V恒压转移1小时）。
5. 转移完成后，用PBS缓冲液冲洗膜，然后用保鲜膜包裹，并于-80°C条件下曝光至富士胶片（在膜旁放置荧光贴纸以便后续对齐胶片与膜；分别曝光30分钟、1小时和过夜）。

9. RNA 提取

1. 使用8.5步骤的放射自显影图作为模板，从低RNase实验中分离蛋白质-RNA复合物。将膜切成若干小片，放入1.5 ml微量离心管中。
2. 向膜片中加入200 μl蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4；50 mM NaCl；10 mM EDTA）和10 μl蛋白酶K（Roche, 03115828001）。在37°C下以1,100 rpm振荡孵育20分钟。
3. 加入200 μl含尿素的蛋白酶K缓冲液（PKurea缓冲液：100 mM Tris-HCl pH 7.4；50 mM NaCl；10 mM EDTA；7 M尿素），在37°C下孵育20分钟。
4. 收集溶液，并与400 μl RNA酚/氯仿溶液（Ambion, 9722）一同加入2 ml Phase Lock Gel Heavy管（713-2536, VWR）中。
5. 在30°C下孵育5分钟，以1,100 rpm振荡。于室温下以13,000 rpm离心5分钟，分离各相。
6. 将水相转移至新管中（注意移液枪头勿接触凝胶层）。加入0.5 μl glycoblue（Ambion, 9510）和40 μl 3 M乙酸钠（pH 5.5），混匀。然后加入1 ml 100%乙醇，再次混匀，并在-20°C下过夜沉淀。

10. 逆转录

1. 在 15,000 rpm 和 4°C 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，并用 0.5 ml 80% 乙醇洗涤沉淀。
2. 将沉淀重悬于 7.25 μl RNA/引物混合液中（6.25 μl 水；0.5 μl Rclip 引物 [0.5 pmol/μl]；0.5 μl dNTP 混合液 [10 mM]）。每个实验或重复应使用含有不同条形码序列的 Rclip 引物（见步骤 14）。
3. 在 70°C 孵育 5 分钟，随后冷却至 25°C。
4. 加入 2.75 μl 反转录（RT）混合液（2 μl 5x RT 缓冲液；0.5 μl 0.1 M DTT；0.25 μl Superscript III 反转录酶 [Invitrogen]）。
5. 在 25°C 孵育 5 分钟，42°C 孵育 20 分钟，50°C 孵育 40 分钟，80°C 孵育 5 分钟，然后冷却至 4°C。
6. 加入 90 μl TE 缓冲液、0.5 μl glycoblue 和 10 μl 乙酸钠（pH 5.5），混匀。再加入 250 μl 100% 乙醇，再次混匀，并于 -20°C 过夜沉淀。

11. cDNA 的凝胶纯化

1. 离心收集并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于6 μl水中。
2. 加入6 μl 2x TBE-尿素上样缓冲液（Invitrogen）。上样前将样品在80°C加热3分钟。
3. 将样品上样至预制的6% TBE-尿素凝胶（Invitrogen），按照制造商说明在180 V下电泳40分钟。同时加载低分子量标记物以用于后续切胶（见下文）。
4. 切取三个条带：120–200 nt（高）、85–120 nt（中）和70–85 nt（低）。利用上层染料和塑料凝胶支架上的标记辅助切割（见图3）。注意Rclip引物和L3序列合计占CLIP序列的52 nt。
5. 加入400 μl TE缓冲液，用1 ml注射器活塞将凝胶切块碾碎成小片。在37°C、1,100 rpm条件下振荡孵育2小时。
6. 将两个1 cm玻璃预滤膜（Whatman, 1823010）放入Costar SpinX离心柱（Corning Incorporated, 8161）中。将样品的液体部分转移至该离心柱中，以13,000 rpm离心1分钟，收集滤液至1.5 ml离心管中。
7. 加入0.5 μl glycoblue和40 μl pH 5.5乙酸钠溶液，混匀样品。再加入1 ml 100%乙醇，再次混匀，并于-20°C过夜沉淀。

12. 将引物连接到 cDNA 的 5'端

1. 离心收集并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于8 μl连接反应体系中（6.5 μl水；0.8 μl 10x CircLigase Buffer II；0.4 μl 50 mM MnCl₂；0.3 μl CircLigase II [Epicentre]），在60°C孵育1小时。
2. 加入30 μl寡核苷酸退火体系（26 μl水；3 μl FastDigest Buffer [Fermentas]；1 μl cut_oligo [10 μM]）。在95°C孵育1分钟，随后每20秒降低1°C，直至温度降至25°C。
3. 加入2 μl BamHI（Fast Fermentas），在37°C孵育30分钟。
4. 加入50 μl TE缓冲液和0.5 μl GlycoBlue，混匀；再加入10 μl乙酸钠（pH 5.5），混匀，随后加入250 μl 100%乙醇。再次混匀后，在-20°C过夜沉淀。

13. PCR 扩增

1. 离心并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于19 μl水中。
2. 配制PCR反应液（19 μl cDNA；1 μl Solexa P5/P3引物混合物，各10 μM；20 μl Accuprime Supermix 1酶[Invitrogen]）。
3. 运行以下PCR程序：94°C 2分钟，[94°C 15秒，65°C 30秒，68°C 30秒]_{25-35个循环}，68°C 3分钟，4°C保存。
4. 取8 μl PCR产物与2 μl 5× TBE上样缓冲液混合，上样至预制的6% TBE凝胶（Invitrogen）。用Sybrgreen I（Invitrogen）染色，并使用凝胶成像系统分析。
5. Rclip引物中的条形码允许在提交高通量测序前对不同样品进行多重混合。提交15 μl文库用于测序，其余部分保存备用。

14. 连接子和引物序列

预腺苷酸化的3'接头DNA：

[我们从 IDT 公司订购 DNA 接头，然后将其分装为 20μM 的储存液。]

15. 代表性结果：

在对iCLIP文库进行测序之前，实验的成功与否可在两个步骤中进行监测：蛋白质-RNA复合物在膜转移后的放射自显影结果（步骤8.5）以及PCR产物的凝胶图像（步骤13.4）。在低RNase处理样品的放射自显影图中，应在目标蛋白质的分子量上方观察到弥散状的放射性信号（图2，样品4）。而对于高RNase处理的样品，该放射性信号则更集中于接近蛋白质分子量的位置（图2，样品3）。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到任何信号（图2，样品1和2）。为进一步验证免疫沉淀的特异性，其他重要的对照实验可选择省略紫外线照射步骤，或使用不表达目标蛋白的细胞¹⁴。

PCR产物的凝胶图像（步骤13.4）应显示与步骤11.4中纯化的cDNA组分（高、中或低分子量）相对应的大小范围（图4，泳道4-6）。请注意，PCR引物P3Solexa和P5Solexa会使cDNA长度额外增加76个核苷酸。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到相应的PCR产物（图4，泳道1-3）。引物二聚体产物的大小约为140个核苷酸。

有关高通量测序及后续生物信息学分析的代表性结果，请参见¹⁴。

图1. iCLIP 实验流程示意图。蛋白质-RNA 复合物通过共价交联固定 体内 使用紫外照射进行交联（步骤1）。目标蛋白与其结合的RNA一同被纯化（步骤2-5）。为了实现逆转录的序列特异性引物结合，在RNA的3'端连接一个RNA接头，同时对5'端进行放射性标记（步骤6和7）。通过SDS-PAGE及膜转移，将交联的蛋白-RNA复合物与游离RNA分离（步骤8）。利用蛋白酶K消化蛋白，从膜上回收RNA，仅在交联核苷酸处保留一段多肽（步骤9）。逆转录（RT）在残留的多肽处发生截断，并引入两个可切割的接头区域及条形码序列（步骤10）。通过大小筛选去除游离的RT引物后进行环化。随后的线性化过程生成适用于PCR扩增的模板（步骤11-15）。最后，高通量测序产生的读段中，条形码序列紧接cDNA的最后一个核苷酸（步骤16）。由于该核苷酸位于交联核苷酸上游一个位置，因此可高分辨率地推断出结合位点。

图2. 通过变性凝胶电泳和膜转移检测交联的hnRNP C-RNA复合物的放射自显影结果。hnRNP C-RNA复合物从细胞提取物中使用针对hnRNP C的抗体（α hnRNP C，样品3和4）进行免疫纯化。RNA使用低（+）或高（++）浓度的RNase进行部分消化。可观察到复合物从蛋白本身大小（40 kDa）向上迁移的条带（样品4）。当使用高浓度RNase时，迁移现象较不明显（样品3）。在免疫沉淀中未使用抗体时，放射性信号消失（样品1和2）。

图3. 用于指导iCLIP cDNA产物切取的6% TBE-尿素凝胶（Invitrogen）示意图。凝胶在180 V电压下电泳40分钟，使cDNA和染料（浅蓝色和深蓝色）在凝胶中形成可重复的迁移模式。使用剃刀沿红线切取高（H）、中（M）和低（L）分子量的cDNA组分。首先从浅蓝色染料的中部开始切割，并紧贴塑料凝胶盒上的标记线之上进行。将中分子量和低分子量组分分开，并在浅蓝色染料上方约1 cm处修整高分子量组分。利用加样孔位置和染料条带作为参考，进行垂直切割以分离不同泳道（本示例中为1-4）。标记物泳道（m）可进行染色并成像，以在切割后验证片段大小。右侧标注了片段大小。

图4. 使用凝胶电泳分析PCR扩增的iCLIP cDNA文库。从膜上回收的RNA（图1）经逆转录后，通过变性凝胶电泳进行片段大小纯化（图2）。回收了三种不同大小的cDNA片段（高[H]：120–200 nt，中[M]：85–120 nt，低[L]：70–85 nt），随后进行环化、重新线性化并进行PCR扩增。由于输入片段大小不同，PCR产物呈现出不同的大小分布。由于PCR引物为cDNA添加了76 nt，因此高、中、低三类片段的预期大小范围分别为196–276 nt、161–196 nt和146–161 nt。在免疫沉淀过程中未使用抗体时，未观察到PCR产物（泳道1–3）。

讨论

由于iCLIP实验方案包含多种酶促反应和纯化步骤，当实验失败时并不总是容易确定问题所在。为了控制所鉴定出的RNA交联位点的特异性，应在整个实验过程及后续的计算分析中设置一个或多个阴性对照。这些对照可包括无抗体样本、未交联的细胞，或来自基因敲除细胞或组织的免疫沉淀样本。理想情况下，这些对照实验不应纯化出任何蛋白-RNA复合物，因此在SDS-PAGE凝胶上应无信号，PCR扩增后也应无可见产物。对这些对照文库进行高通量测序应仅获得极少量的唯一序列。不建议使用基因敲低细胞作为测序对照，因为所获得的序列仍对应于同一种蛋白的交联位点，而该蛋白仅是以较低丰度从敲低细胞中被纯化出来的。

还应采取预防措施，避免受到先前实验PCR产物的污染。最大限度减少此类问题的最佳方法是将PCR前和PCR后操作在空间上分开进行。理想情况下，PCR产物的分析及所有后续步骤均应在独立的房间内完成。此外，实验室每位成员都应使用各自独立的缓冲液和其他试剂，以便更易于识别污染来源。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对于凝胶电泳和膜转移，我们推荐使用 XCell SureLock® Mini-Cell 和 XCell IIâ Blot Module Kit CE 标志（Invitrogen，EI0002），该系统与本实验方案中指定的各种预制小型凝胶兼容。实验中所用所有材料的品牌和货号均在方案中注明。本方案中所用酶的列表如下表所示。
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	若使用小鼠或山羊抗体，请改用 protein G
核糖核酸酶 I（RNase I）	Ambion	AM2295	活性可能因批次不同而变化
T4 RNA 连接酶 I（T4 RNA ligase I）	New England Biolabs	M0204S
多核苷酸激酶（PNK）	New England Biolabs	M0201S
蛋白酶 K（proteinase K）	Roche Group	03115828001
Superscript III 逆转录酶（reverse transcriptase）	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	该 PCR 混合液在我们实验中效果最佳