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高压灭菌器
组装和高压灭菌管流系统和生物反应器组件（生物反应器本身和硅胶塞盖），在图1和图2的指示。鼻饲管，有一个男性一端连接器和一个对方开放。三是通过气体交换的硅胶帽插入短管段。
1。缝纫机的PGA网
- 剪下的PGA网格1.1厘米X〜8厘米表（依赖于生物反应器的大小）。
- 用蒸馏水（dH20）和空气干燥，使用前清洁硅胶管（3毫米内径）。
- 使用敌克松6.0缝合缝周围的清洁硅胶管，三个单针手术节开始的PGA网状。
2。美国PGA支架的表面处理
- 1M氢氧化钠浸在PGA支架为1 - 2分钟，并记录治疗时间和使用的同时为所有美国PGA支架。
- dH2O浴冲洗2分钟，3次美国PGA支架。
- 八PGA支架与彼此之间在卫生署2浴浸Kimwipes干。
- 组织培养罩下干的PGA支架鼓风机上15分钟的干燥空气。
3。缝纫针及涤纶武器
- 使用普理灵4.0缝合，缝到每个PGA 2 - 3mm的重叠网格的月底涤纶袖口（1厘米）的小块。注意:要小心，不要穿刺硅胶管（图3）。
- 使用相同的缝合围绕涤纶袖口缝三针。请一定要留在普理灵缝合步骤5.1（图3）自由端足够的缝合。
4。生物反应器大会（生物反应器培养开始前一天）
- 20-30分钟，浸泡在70％的乙醇浴缝制的网格，硅胶管，手术器械，和一个细铁丝。
- 打开包含至少30分钟，组装前高压灭菌器生物反应器和浸入70％乙醇浴袋。确保用乙醇冲洗彻底的生物反应器。所有生物反应器组件70％的乙醇暴露除了杀菌步骤。这一步也消除毒素，这是不会被删除蒸压和血管细胞有害。
- 将硅胶管通过用细线拉侧武器。
- 利用生物反应器乙醇浴（保持淹没在乙醇网）。修复生物反应器内的PGA支架紧固涤纶袖口紧缩和压制的普理灵缝合（图3），在燃烧的玻璃嘴唇。
- 生物反应器侧臂的一端连接通过硅胶管接头。
- 拉出硅胶管的另一端有足够的张力和其余两个连接器插入硅胶管。硅胶管插入连接器时，紧紧！
- 重新安装的生物反应器转化为乙醇浴，并用乙醇冲洗，轻轻拉侧臂连接。
- 翻转生物反应器，并允许浸泡10分钟。
- 右侧翻转生物反应器和一个额外的10分钟的浸泡。
- 漏极所有乙醇。
- 持有多余的乙醇滴从管的两端设置了三个大的中心菜系列和生物反应器中的Petri菜（10厘米）。
- 冲洗水使用一个5毫升或10ml吸管组织培养生物反应器和PGA网状。硅胶管冲洗组织到养殖水体。
- 彻底所有多余的水排入培养皿上的生物反应器的两侧。
- 干的生物反应器在引擎盖一夜之间与风机和紫外线关。
- 其他注意事项:确保无菌搅拌棒是在生物反应器。确保"悬停"在生物反应器从这个角度提出，以避免污染。削减大量的封口膜条，浸泡在一个小70％的乙醇浴（大培养皿中行之有效的）。
5。第1天:生物反应器的安装
- 无菌培养皿放在开放的每一个生物反应器，以防止污染物PGA支架内。
- 组装流系统，生物反应器，在图4和封口膜所有的连接关节表示。
- 先用酒精擦拭擦拭连接器。
- 第三，生物反应器中未使用的ARM将注射口。
- 删除海象油管和配合生理盐水稀释的蓝色端尽可能靠近Y型路口设置。拉管钳到位，以确保没有液体转移到这部分管
- 取下输液袋，及附加海象管（红色），远远输液袋。确保用酒精擦拭插入端口擦拭第一。
- 附加海象流系统的一面（通过白色端管）。
- 插入流系统3路阀。
- 卸下压力传感器及连接三路阀。
- 将压力传感器在袋中间开口的另一端。
- 连接通过Y型路口的生物反应器流系统。使用的60毫升注射器中添加1％fungizone350毫升（混合的PBS495毫升5毫升fungizone）输液袋。
- 挤压输液袋，以调整停止旋塞，让流动的PBS冲洗流动系统。注:生物反应器内检查，以确保有没有漏水。
- 在中等和种子到每个PGA scafffold1.25毫升重新挂起8 × 10 6校董会（约一融合T75）。确保细胞悬液均匀滴落到PGA的网底侧到PGA网状涤纶交界处以及。
- 用RIM的生物反应器与酒精擦拭通过旋转生物反应器侧身避免徘徊。
- 硅胶塞盖总成（图2）
- 剥离高压灭菌袋仔细，确保不暴露底部的盖子。
- 在男性的连接器，将鼻饲管注射口。
- 将聚四氟乙烯0.20微米的过滤器，每3个航空口岸。
- 要小心不暴露/在此过程中，触摸盖子底部。
- 封口膜的注射口。
- 玻璃生物反应器插入硅胶塞盖和确保生物反应器内的喂食管不接触种子PGA支架。封口膜周围的盖子。
- 放在培养箱内流系统（在其一侧）的生物反应器，旋转生物反应器为25-30分钟，每5分钟。
- 生物反应器室填写400毫升4-10文化中所述的媒体（见表1）。这种培养基是"优化"猪工程动脉。
6。 6-7日:打开泵，并一次投料
- 成长的种子棚架静态通过6-7天的硅胶管抽水没有任何搏动。有没有在这段时间中改变或补充维生素C的需要。
- 确保有PBS或流系统管扭结打开泵前没有泄漏。
- 打开泵的流量系统，确保调整泵设置压力读数约270/-30mmHg。
- 记录压力，每天整个文化，并保持在270/-30mmHg的压力。压力传感器可以连接到电脑上阅读和监控压力。
一次投料
- 进样口和PTFE过滤器组装到两种介质的变化和中浪费deposal目的喂养盖。
- 坚定地泵上的鼻饲管，一端插入喂养喂养盖生物反应器和另一端的端口。确保乙醇抹布擦拭注射口。
- 使用双定向的Masterflex泵泵出中等200毫升。然后使用一个新的鼻饲管泵入新鲜培养基200毫升生物反应器。总是以一个非常缓慢的速度，尤其是当泵送介质的生物反应器的回。
- 变更中和补充抗坏血酸2x/week。若要添加抗坏血酸，使用30ml注射器中等25毫升和地方组织罩在它放在一边。溶解在PBS的5毫升抗坏血酸25毫克，并通过一个0.22微米的过滤器过滤。首先鼻饲管注入无菌抗坏血酸，并加回较早时取出25毫升中等。表1给出了培养基配方。
7。代表性的成果:
图1。流系统的组装连接器和油管如上图所示 。
图2。以上显示的是硅胶塞盖大会。
图3。生物反应器的组装原理图如上图所示。，在生物反应器涤纶袖口内到与蓝色缝合节的玻璃武器固定。
图4。上面所示的连接管和生物反应器的流系统 。L/S18管会的Masterflex泵由泵，从而推动流。压力传感器将测量之前进入上游的生物反应器的压力。
图5。收获工程血管的图像 。工程船只会出现不透明和脉动条件下培养8周后达到了约250微米的壁厚。
图6。苏木和曙红染色工程船的横截面。A和B是8周脉冲和非脉冲船只分别。C和D 4周非脉冲和脉冲的船只，分别为。 L表示血管的管腔侧。鳞栏是100微米。
图7。马森工程船的横截面为胶原蛋白的三色渍（蓝色）。A和B是8周的非脉冲和脉冲的船只，分别。 C和D 4周非脉冲和脉冲的船只，分别为。请注意，4周的脉冲船只超过其非脉冲胶原。白色箭头指向其余的船只PGA的片段。鳞栏是100微米。
图8。免疫组织化学染色。校董会标记在牛工程动脉平滑肌α-肌动蛋白，调宁蛋白- 1，和平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）是早期，中期和后期的SMC收缩标记，分别。到12周的文化结束，在血管的细胞墙表达SMα-肌动蛋白和适量调宁蛋白- 1和SMMHC。鳞栏是20微米。
| 组件 | 金额 |
| DMEM（修改二甲醚/低） | 500毫升 |
| 胎牛血清（胎牛血清）热灭活 | 100毫升 |
| HEPES 1.0 M | 5毫升 |
| 维生素C（PBS或DMEM培养液溶解） | 25毫克 |
| 脯氨酸/甘氨酸/丙氨酸25 mg/25 mg/10毫克（在5毫升的PBS溶解） | 5毫升 |
| 硫酸铜4 1.5微克（第1毫升的PBS溶解） | 1毫升 |
| 在10000个单位/毫升青霉素G | 5毫升 |
| PDGF - BB（血小板衍生生长因子- BB）在10ng/ml | 5μg |
| 碱性成纤维细胞生长因子（碱性成纤维细胞生长因子）在10ng/ml | 5μg |
表1。 "4-10"中的组件是在上面的表格所示。PDGF - BB和碱性成纤维细胞生长因子的异常，所有其他组件都通过一个0.2微米的过滤器在使用前的过滤。