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方法文章

使用脉动生物反应器构建基于生物材料的血管移植物

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DOI：

10.3791/2646

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2011年6月14日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

我们课题组开发了一种生物反应器培养系统，可模拟心血管系统的生理脉动应力，用于再生可植入的小直径血管移植物。

摘要

人们已投入大量努力来开发和推进功能性小直径动脉旁路移植的再生方法。在生理环境中，动脉血管的正常发育和功能维持需要机械和化学刺激的共同作用1,2。

我们课题组开发的生物反应器培养系统旨在精确控制的化学-力学环境中支持血管再生，该环境模拟了天然血管的生理条件。我们的生物反应器组装与维护流程较为简便，且具有高度可重复性3,4。将平滑肌细胞（SMCs）接种于管状聚乙醇酸（PGA）网状支架上，该支架套在弹性硅胶管表面，并在生物反应器中进行培养，可选择施加脉动刺激，培养时间最长可达12周。我们的生物反应器具有四个主要特点，使其区别于以往的一些系统：1）不同于仅模拟天然血管生化环境的其他培养系统，本生物反应器还能通过对培养中的血管施加周期性径向应变，构建出符合生理条件的脉动环境；2）可在统一控制的化学环境中，同时对多个组织工程血管施加不同的力学条件进行培养；3）该生物反应器便于在组织工程血管的管腔侧均匀涂覆单层内皮细胞（EC），适用于动物植入模型；4）本生物反应器还可培养直径范围从1 mm至3 mm不等的组织工程血管，避免了为每种特定直径单独定制生物反应器的繁琐工作。

在我们的生物反应器中培养的工程化血管在组织学上在一定程度上类似于天然血管。血管壁中的细胞表达成熟的平滑肌细胞收缩标志物，例如平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）3。大量胶原蛋白沉积于细胞外基质中，赋予工程化血管最终的机械强度5。生化分析还表明，工程化血管的胶原含量与天然动脉相当6。重要的是，该脉动式生物反应器持续再生出具有适宜力学性能的血管，使其能够在动物模型中成功进行植入实验3,7。此外，该生物反应器还可进一步改造，以实现利用非线性光学显微镜（NLOM）无创地实时评估和追踪胶原重塑的动态过程8。综上所述，该生物反应器应可作为研究调控功能性小直径血管移植物再生的基本机制的优良平台。

方案

高压灭菌

按照图1和图2所示，组装流控系统及生物反应器组件（生物反应器本体及硅胶塞盖）的管路，并进行高压灭菌。进样管一端为公接头，另一端为开口。三段短管穿过硅胶塞，用于气体交换。

1. 缝合PGA网片

  1. 将PGA网片裁剪成1.1 cm × ~8 cm的片状（具体尺寸取决于生物反应器大小）。
  2. 用蒸馏水（dH20）清洗硅胶管（内径3 mm），并在使用前晾干。
  3. 使用Dexon 6.0缝线将PGA网片缝合到洁净的硅胶管周围，起始处打三个外科结，随后进行单针缝合。

2. PGA 支架表面处理

  1. 将PGA支架浸入1M NaOH中1-2分钟，并记录处理时间，所有PGA支架均采用相同的处理时间。
  2. 将PGA支架在去离子水（dH2O）中浸泡清洗，每次2分钟，重复3次。
  3. 每次在去离子水（dH2O）中浸泡后，用Kimwipes轻轻吸干PGA支架。
  4. 将PGA支架置于超净台中，开启吹风机吹干15分钟，使其自然风干。

3. 缝合涤纶血管分支

  1. 使用 Prolene 4.0 缝线将 Dacron 套管（1 cm）的小段缝合到 PGA 网格的每一端，重叠 2–3 mm。注意：小心不要刺穿硅胶管（图 3）。
  2. 使用相同的缝线在 Dacron 套管的自由端周围缝合三个缝线。确保 Prolene 缝线的自由端留有足够的长度，以用于步骤 5.1（图 3）。

4. 生物反应器的组装（开始生物反应器培养的前一天）

  1. 将缝合好的网片、硅胶管、手术器械和细金属丝浸入70%乙醇溶液中浸泡20-30分钟。
  2. 打开含有生物反应器的高压灭菌袋，并将其浸入70%乙醇溶液中至少30分钟，然后再进行组装。确保用乙醇充分冲洗生物反应器。所有生物反应器组件接触70%乙醇是额外的消毒步骤，该步骤还可去除内毒素——内毒素无法通过高压灭菌去除，且对血管细胞有害。
  3. 使用细金属丝将硅胶管穿过侧臂，牵引其通过。
  4. 将生物反应器从乙醇溶液中取出（保持网片仍浸在乙醇中）。通过拧紧并系牢聚丙烯缝线，将涤纶套环固定在扩大的玻璃边缘上，从而将PGA支架固定在生物反应器内部（图3）。
  5. 通过硅胶管将生物反应器侧臂的一端连接至接头。
  6. 拉紧硅胶管的另一端，并将剩余的两个接头插入硅胶管中。插入接头时务必牢牢握住硅胶管！
  7. 将生物反应器重新放入乙醇溶液中，并通过轻轻拔出侧臂上的接头，用乙醇冲洗。
  8. 将生物反应器翻转，静置浸泡10分钟。
  9. 将生物反应器正放，再继续浸泡10分钟。
  10. 排尽所有乙醇。
  11. 依次放置三个大培养皿（10 cm），将生物反应器置于中间的培养皿中，以承接管端滴下的多余乙醇。
  12. 使用5 ml或10 ml移液器，用组织培养用水冲洗生物反应器和PGA网片。同时将组织培养用水冲洗入硅胶管中。
  13. 将所有多余的水彻底排入生物反应器两侧的培养皿中。
  14. 在超净台中开启吹风机、关闭紫外灯，将生物反应器过夜干燥。
  15. 附加说明：确保生物反应器内已放入无菌搅拌子。从此步骤开始，避免在生物反应器上方悬停操作，以防污染。准备大量Parafilm封口膜条，并将其浸入小体积的70%乙醇溶液中（大培养皿效果良好）。

5. 第1天：生物反应器设置

  1. 在每个生物反应器的开口处放置一个无菌培养皿，以保护内部的PGA支架免受污染物侵染。
  2. 按照图4所示将流动系统连接至生物反应器，并用Parafilm密封所有连接接头。
    1. 首先用酒精棉片擦拭连接器。
    2. 将注射端口连接到生物反应器第三个未使用的端口上。
    3. 取下海象管，并尽可能靠近Y型连接处结扎生理盐水稀释装置的蓝色端。将管夹推至适当位置，确保液体不会流入该段管道。
    4. 取下输液袋，将海象管（红色）连接至输液袋远端。连接前务必先用酒精棉片擦拭插入端口。
    5. 将海象管通过白色端连接至流动系统的一侧。
    6. 在流动系统中插入三通旋塞阀。
    7. 取下压力传感器，并将其连接至三通旋塞阀。
    8. 将压力传感器的另一端连接至输液袋中间的开口。
  3. 通过Y型连接处将生物反应器连接至流动系统。使用60 ml注射器向输液袋中加入350 ml的1%两性霉素B溶液（将5 ml两性霉素B与495 ml PBS混合）。
  4. 挤压输液袋，调节旋塞阀使PBS流经整个系统以进行冲洗。注意：检查生物反应器内部，确保无泄漏现象。
  5. 将8×106个平滑肌细胞（约一个融合的T75培养瓶）重悬于1.25 ml培养基中，并接种至每个PGA支架上。确保细胞悬液均匀滴加在PGA网片与涤纶接合处以及PGA网片的底面。
  6. 通过将生物反应器侧向旋转的方式，用酒精棉片擦拭其边缘，避免悬空操作。
  7. 硅胶塞盖组件（图2）
    1. 小心地向后剥离灭菌袋，注意不要暴露盖子的底部。
    2. 将注射端口连接至进样管的公接头处。
    3. 在三个通气孔上分别安装PTFE 0.20 μm滤器。
    4. 在此过程中注意不要暴露或触碰盖子的底部。
    5. 用Parafilm包裹注射端口。
  8. 将硅胶塞盖插入玻璃生物反应器中，并确保反应器内部的进样管不接触已接种细胞的PGA支架。在盖子周围用Parafilm密封。
  9. 将带有流动系统的生物反应器放入培养箱中（侧放），并每隔5分钟旋转一次，持续25–30分钟。
  10. 按照（表1）所述，向生物反应器腔室中加入400 ml的4-10培养基。该培养基是为猪源性组织工程动脉“优化”的。

6. 第6-7天：启动泵系统及首次喂食

  1. 将接种后的支架在硅胶管路中静态培养6-7天，期间无需脉动泵送。此阶段无需更换培养基或添加维生素C。
  2. 开启泵之前，确保PBS无泄漏，且灌注系统管路无扭曲或弯折。
  3. 启动灌注系统的泵，并调节泵的设置，使压力读数约为270/-30 mmHg。
  4. 在培养期间每日记录压力，并维持压力在270/-30 mmHg。可将压力传感器连接至计算机，以读取和监测压力。

首次喂食

  1. 将注射口和聚四氟乙烯（PTFE）滤器组装到进料盖上，用于换液和废液排放。
  2. 将进料管牢固地安装在泵上，并将一端插入生物反应器的进料口，另一端插入进料盖。务必用乙醇擦拭纸擦拭注射口。
  3. 使用双向 Masterflex 泵抽出 200 ml 培养基，然后使用新的进料管将 200 ml 新鲜培养基泵入生物反应器中。开始时务必使用极慢的速度，尤其是在将培养基泵回生物反应器时。
  4. 每周两次更换培养基并补充抗坏血酸。添加抗坏血酸时，使用 30 ml 注射器取出 25 ml 培养基，置于组织培养罩内备用。将 25 mg 抗坏血酸溶解于 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过 0.22 μm 滤器过滤。先将无菌的抗坏血酸溶液注入进料管，再将之前取出的 25 ml 培养基加回。培养基配方见表 1。

7. 代表性结果：

带有Y型连接器、粗连接头和Masterflex Pharmed® L/S18管路的管路流动系统示意图。
图1. 上图显示了流动系统组装所用的管路和连接件。

带有进料管、硅胶塞和气体交换管路的发酵装置示意图。
图 2. 上方所示为硅胶塞盖组件。

生物反应器组装示意图，包含硅胶管、涤纶套管、气体交换滤膜和流动系统。
图3. 上方显示生物反应器组装的示意图。 在生物反应器内部，涤纶套管通过蓝色缝合结固定在玻璃臂上。

流动系统示意图；生物反应器、泵、压力传感器用于连续细胞培养过程。
图4. 上方所示为连接至管路和生物反应器的流动系统。 L/S18管路将由Masterflex泵驱动，从而推动流体流动。压力传感器将测量流体进入生物反应器前上游位置的压力。

含有细菌培养物的培养皿，用于生长分析的微生物实验装置。
图 5. 收获的工程化血管图像。 工程化血管在脉动条件下培养 8 周后呈不透明状，管壁厚度约为 250μm。

组织学，染色组织样本，显微镜图像，细胞结构比较，显示比例尺。
图6. 工程化血管的苏木精和伊红染色横切面。 A和B分别为8周未受脉动和受脉动的血管。C和D分别为4周未受脉动和受脉动的血管。L表示血管的管腔侧。比例尺为100μm。

组织学分析，Masson三色染色，心脏组织切片，纤维化检查。
图7. 工程化血管横切面的Masson三色染色显示胶原蛋白（蓝色）。 A和B分别为培养8周的非脉动和脉动血管。C和D分别为培养4周的非脉动和脉动血管。请注意，4周脉动血管中的胶原蛋白含量高于其非脉动对应样本。白色箭头指示血管中残留的PGA碎片。比例尺为100μm。

平滑肌染色比较，SMa肌动蛋白、Calponin-1、SMMHC，显微图像。
图8. 牛源性工程化动脉中平滑肌细胞标志物的免疫化学染色。 平滑肌α-肌动蛋白、calponin-1 和平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）分别为早期、中期和晚期平滑肌细胞收缩标志物。经过12周培养后，血管壁中的细胞表达平滑肌α-肌动蛋白以及中等量的calponin-1和SMMHC。比例尺为20μm。

组分用量
DMEM(DME/low modified) 500 ml
FBS（胎牛血清）热灭活100 ml
HEPES 1.0 M 5ml
维生素C（溶于PBS或DMEM中）25 mg
脯氨酸/甘氨酸/丙氨酸 25 mg/25 mg/10 mg（溶于5ml PBS中）5ml
CuSO4 1.5 μg（溶于1 ml PBS中）1ml
青霉素G，10,000 单位/ml 5ml
PDGF-BB（血小板源性生长因子-BB），10ng/ml5μg
bFGF（碱性成纤维细胞生长因子），10ng/ml5μg

表1. “4-10”培养基的成分如上表所示。 除PDGF-BB和bFGF外，所有其他组分在使用前均需通过0.2μm滤器过滤。

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讨论

工程化血管的质量在很大程度上取决于组织培养中所用平滑肌细胞（SMCs）的质量。平滑肌细胞表型的关键特征包括收缩性形态、低传代次数以及在生物反应器内增殖的能力。我们建议，在将细胞接种至聚合物支架时，传代次数不应超过P3代。此外，使用前必须确认平滑肌细胞来源无支原体污染。我们观察到，支原体污染的细胞会导致生物反应器培养中细胞增殖能力显著下降以及胶原基质沉积减少。

每年需要超过 400,000 根冠状动脉移植物用于旁路手术，导致对小直径（<6 mm）血管移植物的高需求12。最终目标是构建能够模拟天然组织生理功能的小直径功能性血管。我们的脉动生物反应器系统是一种有前景的方法，可用于构建能够修复和替代病变动脉的功能性动脉移植物。在化学和机械条件可控的环境中，该生物反应器使我们能够构建具有强缝合保持力和优异机械性能的可植入小直径血管。该脉动生物反应器系统可用于利用牛3、猪6,7和人细胞9重建不同尺寸和规格的动脉，从而使该系统具有广泛的适用性和多功能性。此外，我们已对生物反应器进行改进，以实现对血管细胞...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助项目R01 EB-008836和R01 HL083895（均授予L.E.N.）支持。我们感谢大学玻璃仪器吹制师Daryl Smith为我们的研究制作了生物反应器。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清（FBS），经热灭活HycloneSH30071
DMEMGIBCO, by Life Technologies11885
rhFGF-basicR&D Systems234-FSE
rrPDGF-BBR&D Systems520-BB
青霉素 GSigma-AldrichPENNA
硫酸铜(II)Sigma-AldrichC8027
甘氨酸Sigma-AldrichC8790
L-丙氨酸Sigma-AldrichA7469-25G
L-脯氨酸Sigma-AldrichP5607-25G
抗坏血酸Sigma-AldrichA4544-25G
HEPESSigma-AldrichH3375-100G
硅胶塞Cole-Parmer06298-24
Masterflex 泵管 L/SCole-Parmer06508-16, 06508-18
Masterflex 泵Cole-Parmer7553-80
涤纶袖套Maquet174406
PGA 毡片ConcordiaMO000877-01
4-0 1.5 克重 Surgipro II 缝线SynetureVP-557-X
6-0 0.7 克重 Dexon 缝线Syneture7538-11
0.22μm PTFE 滤器Whatman, GE Healthcare6780-2502
三通旋塞阀Edwards Lifesciences593WSC
压力传感器Edwards LifesciencesPX212
静脉输液袋Baxter Internationl Inc.R4R2110
生理盐水稀释装置Arrow InternationalW20030
硅胶管Saint-GobainF05027

参考文献

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