小鼠外周淋巴结的解剖与双光子成像

摘要

双光子成像已揭示了在基础状态及免疫应答过程中淋巴结内淋巴细胞的运动性及细胞间相互作用¹。本文中，我们展示了T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及离体淋巴结中CD4+ T细胞运动性的成像。

摘要

双光子成像技术揭示了在基础状态下以及免疫应答启动过程中淋巴结内细胞运动与细胞间相互作用的精巧动态过程¹。本文介绍了标记T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及如2002年首次描述的那样，在离体淋巴结中对CD4+ T细胞运动行为进行成像的方法²。对免疫细胞进行双光子成像需要细胞带有荧光标记，可通过细胞示踪染料染色或表达荧光蛋白实现。我们展示了将来源于供体小鼠的细胞经尾静脉注射到受体动物体内的过继转移操作，这些细胞可在约15–30分钟内归巢至淋巴器官。我们图示了淋巴结的分离过程，并描述了确保离体淋巴结正确安装的方法。其他注意事项，如灌注介质的充分氧合、温度控制和激光功率的调节，也进行了讨论。最后，我们展示了在37°C条件下，初始型CD4+ T细胞呈现稳态运动的三维视频图像。

方案

1. 细胞过继转移：

尾静脉注射或眼内注射均适用于导入经细胞示踪剂标记或表达荧光蛋白的淋巴细胞。在本视频中，我们演示通过尾静脉注射进行细胞过继转移的方法。

a. 材料

CD4+ T细胞在37ºC下用1.4 μM CFSE标记30分钟，洗涤两次后重悬于100 μL RPMI-1640培养基中。将细胞加载至无菌的28号胰岛素注射器中用于注射。所用细胞数量取决于具体实验设计。通常，500万个T细胞 足以进行简单的T细胞示踪观察。实验中需使用小鼠啮齿类动物固定器，以防止对动物 和 操作者造成伤害。

b. 固定动物

将小鼠缓慢地向后推入啮齿类动物固定器中以进行过继转移（参见视频），并通过轻轻按压推杆封闭管子的开口端。在此过程中，请勿松开小鼠尾巴，因为一些体型较小的动物可能在固定器内转身。该方法可防止动物受伤，并避免在注射过程中移动。安装啮齿类动物固定器时，推入推杆的深度不应超过防止动物向前跳跃所需的程度。同时， 切勿将推杆直接抵住动物身体，也不应让动物在固定器中停留过长时间。

c. 观察尾静脉

轻轻将尾巴朝向自己拉近，使其轻柔地缠绕在食指上，并用拇指将尾巴压在食指内侧固定。辨认位于直立尾巴两侧的尾静脉。可通过温水加热尾巴以促进血管显影，随后用乙醇擦拭表面。

d. 细胞注射

确定静脉位置后，将注射器针尖斜面朝上，以与静脉平行的浅角度插入。进入静脉后，轻轻推动推杆；若针头在静脉内，则注射时应无任何阻力。如果遇到任何阻力，应立即退出注射器，并在另一位置重新尝试。

如果血管清晰可见，缓慢推动针栓直至注射完成。注射过程中尾部不应出现肿胀，若发生肿胀，则表明针头未进入血管内。在注射过程中有可能“失去”血管，此时应拔出针头，并在尾部另一位置重新尝试注射。若需进行多次注射尝试，最好从原注射位点向小鼠身体方向沿尾部上移选择新注射点。 为应对这一情况，初始注射应从尾部较远端开始，以便为后续的过继性转移操作预留足够的尝试空间。

e. 注射后的注意事项

注射完成后，静脉处会出现少量血液回流。用干净的擦拭巾轻轻按压注射部位，直至出血停止。取出注射器的活塞，轻轻抓住动物的尾巴，让其向前行走，离开固定装置。

务必咨询您的动物护理委员会并遵守动物使用规程，以确保符合相关规定。在进行正式实验之前，务必多次练习该技术。

2. 淋巴结分离

用于双光子成像的淋巴结分离需要从周围组织中仔细摘取正确的淋巴结。

a. 外周淋巴结的选择与定位

用于成像的淋巴结选择取决于实验目的。需注意局部感染或注射部位引流的淋巴结，并选择适合成像的淋巴结。Van den Broeck 等人的文章详细描述了小鼠淋巴结的位置和形态³。在本视频中，我们展示了六个适合用于细胞分离或成像的大型外周淋巴结的切除过程。

b. 淋巴结切除：

在去除淋巴结时，需注意保持组织的完整性。操作过程中应小心避免破坏被膜或以任何方式损伤淋巴结结构。淋巴结结构完整性的丧失将影响实验结果。如有必要，可在解剖显微镜下使用精细解剖镊（#5 Dumont 镊子）去除淋巴结表面的脂肪组织。淋巴结表面不应残留任何脂肪，因为脂肪会散射光线，从而干扰成像效果。

在首次正式实验之前，正确切除淋巴结也是一项需要练习的重要技术。

3. 淋巴结成像设置与注意事项

应将淋巴结固定在成像台上， 在这种情况下，装置包含一个凹陷的腔室。通过蠕动泵和管路加热器，将加温并充氧的培养基从一侧泵入腔室，培养基随后经由向下倾斜的通道流出，进入带有真空管的收集室，并最终流入废液收集瓶。在我们的系统中，淋巴结浸没于37°C的培养基中，并以医用级碳氧混合气体（5% CO₂ + 95% O₂）进行表面灌流。₂，95% O₂₂灌流液的温度应尽可能靠近淋巴结的位置进行记录。您所使用的特定系统可能需要根据显微镜载物台和物镜的配置，对灌流液流速和载物台设计进行相应调整。

a. 淋巴结成像装置设置：

如视频所示，我们将淋巴结髓质面朝下（以便使用直立显微镜观察T细胞或B细胞区域）固定在裁剪至合适尺寸的塑料盖玻片上。必须使用无毒的组织胶（我们使用3M公司生产的VetBond™）。

通过在盖玻片的底面涂抹少量硅脂，然后将其粘附到成像室的玻璃底座上，从而在流动的培养基中固定盖玻片。

b. 双光子成像注意事项：

多种因素可导致淋巴细胞停止运动：温度过高或过低；激光功率过高；淋巴结受到压迫或其他损伤；以及缺氧。由于激光功率过高或温度>约39°C造成的损伤是不可逆的。

如果细胞荧光较弱，通常最好提高检测器增益或优化细胞标记方案，而不是使用更高的激光功率来观察细胞。可能需要优化标记过程或荧光蛋白的表达，以使荧光信号高于背景自发荧光水平。在合理的增益和激光功率设置下，荧光信号较基线水平（通过流式细胞术测定）提高约两个数量级，是细胞观察的合理范围。

使用可调谐的双光子激光器时，激发所用的波长应略小于待成像荧光染料单光子激发最大值的两倍。在使用多种标记物或荧光蛋白的双光子实验中，可能需要尝试不同的激发波长，以找到适用于所有标记物的最佳设置。双光子激发还可通过利用内源性胶原结构固有的蓝色二次谐波生成来实现成像。二次谐波生成（SHG）是指在材料内部两个光子结合并发射出一个频率为原始光子两倍的单光子的现象。在组织中，当入射激光垂直于高度有序的蛋白质结构（如胶原）时，会发生双光子激发。

关于双光子成像的实际问题已在先前的综述中讨论过^{4, 5}。

讨论

在本视频方案中，我们展示了用于成像外周淋巴结中淋巴细胞运动所需的过继性细胞转移以及淋巴结分离与制备步骤。与共聚焦成像相比，双光子成像在离体组织（如本文所示）和活体样本中均具有多项优势。值得注意的是，使用红外激发可最大限度减少光散射，从而能够对淋巴结被膜下约300微米深度以及某些组织更深层区域进行成像⁴。此外，多光子激发仅局限于物镜的焦点位置，可显著减少焦点平面以外的光漂白和组织损伤。然而，与任何新技术一样，双光子成像并非万能，其局限性和潜在陷阱必须予以充分考虑⁵。其中之一是，除胶原蛋白等内源性信号（如二次谐波产生）外，目标细胞必须通过外源性探针标记或表达荧光蛋白才能实现荧光标记。因此，人们容易产生一种印象，即这些被标记的细胞仿佛游动于一片黑色虚空之中；而事实上，它们所处的环境极为复杂，被大量未标记且不可见的细胞及结构成分所包围，并与之发生相互作用。

自从双光子成像技术引入免疫学领域的六年来，该技术使研究人员能够通过直接观察完整活体组织中的细胞间相互作用、细胞运动与定位、细胞信号通路以及细胞毒性细胞杀伤事件等过程，解答了长期以来存在的科学问题。该领域已迅速超越最初的表型描述阶段，目前正结合定量分析、计算机建模与模拟，逐步揭示淋巴结内看似混乱的细胞运动和相互作用如何最终产生高效的免疫应答。这一进展已在近期一篇综述文章中得到全面总结¹，该文列出了100多篇关于双光子显微镜在免疫成像中应用的研究论文。