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方法文章

使用激光解笼荧光素葡聚糖对斑马鱼细胞进行谱系标记

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DOI：

10.3791/2672

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2011年4月28日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

本文内容

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摘要

本方案阐述了一种利用紫外光解笼释放荧光素的方法，对斑马鱼胚胎中少量细胞进行标记并追踪其命运，随后通过整体免疫标记放大光解后荧光素的信号。

摘要

发育生物学中的一个核心问题是推断脊椎动物中众多细胞类型的起源，即这些细胞如何从非特化的前体细胞逐步产生。研究人员已采用多种谱系标记方法，例如DiI标记1和可追踪酶的压力注射2，以确定模式生物在发育后期阶段的细胞命运。最早的斑马鱼（Danio rerio）命运图谱是通过在胚胎特定区域的单个细胞中电泳注射荧光染料（如罗丹明葡聚糖），并随时间追踪标记细胞的归宿而建立的3-5。尽管这些方法有效，但其技术要求较高，且需要斑马鱼实验室中通常不具备的专用设备。近年来，光转化荧光蛋白（如Eos和Kaede）在斑马鱼中的应用日益广泛6-8，这类蛋白在紫外光照射下会不可逆地从绿色荧光转变为红色荧光。由于斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性，且转基因操作相对简便，这些工具特别适用于体内细胞谱系标记及细胞迁移的观察in vivo7。尽管如此，与染料介导的谱系标记方法相比，这些蛋白仍存在一些不足。其中最关键的是我们在进行蛋白光转化时难以获得高精度的三维分辨率。在此背景下，目前用于斑马鱼谱系标记、兼具高分辨率与操作便捷性的最佳选择可能是使用笼锁型荧光素葡聚糖（caged fluorescein dextran）——一种与淬灭基团结合而使其荧光被屏蔽的荧光染料9。该染料可通过激光或汞灯发出的紫外光在特定细胞内“解笼”（即从淬灭基团中释放），从而使其荧光得以显现或可通过免疫学方法检测。与电泳注射法不同，笼锁型荧光素可使用常规显微注射装置注入，并借助带针孔的落射荧光显微镜进行解笼10。此外，抗荧光素抗体仅识别解笼后的形式，且该抗原表位在固定过程中保持稳定11。最后，笼锁型荧光素可实现极高的三维分辨率激活，尤其是在采用双光子显微镜时效果更佳12,13。本实验方案描述了利用笼锁型荧光素及激光解笼进行谱系标记的方法，并进一步通过抗体标记实现解笼后荧光素与其他抗原表位（如GFP）的同步检测。

方案

1. 笼锁型荧光素葡聚糖的合成

  1. 称取 3.5 - 4 mg 氨基葡聚糖，加入 Invitrogen 提供的避光管中，管内含有 1 mg CMNB 保护的荧光素琥珀酰亚胺酯。据我们经验，该比例可实现平均每分子葡聚糖偶联约 2.5 个染料分子。
  2. 向管中加入 500 μL 0.1 M Na2B4O7（硼酸钠）缓冲液。
  3. 盖紧管盖，涡旋振荡 30 秒，使氨基葡聚糖和保护型荧光素充分溶解。
  4. 在涡旋混合器上反应过夜。
  5. 拧下 Zeba 离心柱底部的封闭端，松开上端盖子。用记号笔在柱体上标记一个点。将柱体放入一个 15-mL 圆锥形离心管中。
  6. 以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。柱体压缩后应立即使用。
  7. 将压缩后的柱体转移至一个新的 15-mL 圆锥形离心管中。
  8. 合并反应混合物，并转移至压缩柱树脂床的中心位置。盖上盖子。
  9. 以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。离心后，流出液与柱体上部颜色应大致呈现相同深浅的黄色。
  10. 将黄色流出液（约 350 μL）转移至 1.5-mL 微量离心管中。
  11. 在真空浓缩仪中冻干至完全干燥。用铝箔覆盖真空浓缩仪。
  12. 将所得的约 2-3 mg 浅黄色泡沫重新溶于水，配制成终浓度为 1% w/v 的溶液。
  13. 将该溶液分装后置于 -20 °C 保存，使用铝箔包裹离心管。建议将葡聚糖溶液分装保存，以避免反复冻融。

2. 向斑马鱼胚胎注射笼锁型荧光素葡聚糖

  1. 将1% w/v的笼锁荧光素葡聚糖储备液用0.2 M KCl稀释5倍或10倍。
  2. 使用压力注射仪将0.5–1.0 nL笼锁荧光素溶液注入单细胞期胚胎的卵黄中。注射后，胚胎必须在28.5°C避光保存，以减少非特异性解笼反应。
  3. 手动去除胚胎的绒毛膜。
  4. 用4%三卡因麻醉胚胎。
  5. 将胚胎固定于35 mm × 10 mm培养皿中的0.8%琼脂糖中，然后用胚胎培养液覆盖。
  6. 将融化的琼脂糖置于50°C金属浴中平衡至少15分钟。
  7. 使用玻璃移液器吸取少量水中的一个胚胎，并将其释放至琼脂糖中。注意：在将胚胎放入管中前，务必将装有琼脂糖的管子在手中冷却约30秒，以避免杀死胚胎。
  8. 用移液器吸取胚胎及约50 μL琼脂糖，将内容物排至培养皿中央。
  9. 使用塑料细丝迅速调整胚胎方向，使待解笼的细胞朝上。注意：琼脂糖会迅速冷却凝固，因此调整胚胎方向需迅速。若在琼脂糖变硬后操作，可能损伤胚胎。
  10. 待琼脂糖完全凝固（需几分钟），然后加入含4%三卡因和0.003% PTU的胚胎培养液至培养皿三分之二满。

3. 荧光素葡聚糖的激光解笼

  1. 用于解笼的显微镜必须配备40倍水浸物镜。
  2. 我们使用Photonics Instruments激光器，配备365 nm染料池和70%/30%分光二向色镜。
  3. 在解笼前，必须将激光与物镜调至齐焦，并将激光功率衰减至适当水平。
  4. 为聚焦激光，将镜面玻璃载片置于物镜下方，调节物镜直至载片上的划痕清晰可见。
  5. 调节激光衰减器，直至激光单次脉冲即可在镜面上产生清晰可见的划痕。
  6. 上下调节物镜焦点。若在物镜失焦时激光仍能产生划痕，则将激光焦点上下调节¼圈。重复此步骤，直至仅在物镜聚焦时激光才能在镜面上产生划痕。
  7. 将固定好的胚胎置于物镜下，聚焦于待解笼区域。
  8. 进行解笼时，聚焦于目标细胞，并以2-3 Hz频率脉冲照射10-20次。
  9. 解笼后，用镊子剥离琼脂糖，将胚胎释放并转移至含有0.003% PTU的卵水溶液中。将胚胎置于避光盒中培养，直至固定。

4. 抗体标记及去笼化荧光素葡聚糖的检测

  1. 用 Ab 固定液（4% 多聚甲醛，0.3 mM CaCl₂）固定胚胎2，8% 蔗糖，1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.3）在室温（RT）下孵育 2 至 4 小时，或在 4°C 过夜（O/N） 4°C将胚胎在所有标记步骤中置于避光盒或用铝箔包裹的管中。
  2. 去除固定液，加入100%甲醇，室温放置10分钟，去除甲醇并更换为新鲜的100%甲醇。
  3. 在 -20 °C 下以甲醇保存20°C 至少 30 分钟。 注意： 可在甲醇中保存长达两周，之后表位开始降解。
  4. 用以下溶液在室温下依次洗涤胚胎：75% 甲醇/1×磷酸盐缓冲液（含0.1% Tween 20，即1×PBSTw）洗涤5分钟，然后用50% 甲醇/50% 1×PBSTw洗涤5分钟，最后用25% 甲醇/75% 1×PBSTw洗涤5分钟。
  5. 用 1×PBSTw 洗涤三次，每次 5 分钟。
  6. 如果胚胎是 >24小时龄，用 permeabilize 胚胎 10 μg/mL 蛋白酶K置于1×PBSTw中。通透时间取决于样本发育阶段。若胚胎处于受精后24至48小时（hpf），在蛋白酶K中处理5分钟即可；对于更晚期的幼体，可能需要更长时间。室温下用Ab固定液再固定20分钟。
  7. 在室温下用1×PBSTw洗涤5次，每次5分钟。
  8. 在孵育液（1×PBS，0.1% Triton X-100，10% 羊血清，10% 牛血清白蛋白，1% 二甲基亚砜）中室温孵育 1–2 小时。
  9. 在封闭液中稀释一抗（抗荧光素抗体及针对细胞类型特异性标记物的抗体）。
  10. 孵育胚胎过夜于 4°C 在含有初级抗体的溶液中。
  11. 在室温下，用含0.1% Triton X-100的1×磷酸盐缓冲盐水（PBSTx）洗涤四次，每次20分钟。
  12. 在封闭液中按1:300比例稀释荧光标记的二抗。
  13. 孵育过夜于 4°C 在含有二抗的溶液中。
  14. 室温下用1×PBSTx洗涤四次，每次20分钟。
  15. 在室温下用50%甘油/50% 1×PBS透明胚胎至少2小时，然后去除甘油/PBS混合液，加入100%甘油，4℃过夜静置 4°C.

5. 代表性结果：

免疫标记后，去笼细胞中应出现染色富集区域（图1）。观察到相对较高的信噪比并不罕见 >48小时大的斑马鱼，由于荧光素的自发解笼所致。

foxd3:GFP 和荧光素标记物，背侧视图荧光显微镜观察；基因表达分析。
图 1. 斑马鱼松果体复合体的谱系标记。在受精后24小时（24 hpf），通过UV激光脉冲对由foxd3:GFP表达所指示的前部松果体原基的一部分进行光解激活。A) 到48小时（48 hpf）时，从光解激活区域（白色圆圈）中出现了一个位于左侧的细胞簇，称为副松果体（红色圆圈）。B) 光解激活的荧光素信号在副松果体（红色圆圈）和松果体器官（白色圆圈）中富集。

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讨论

如所述，本方案提供了一种相对快速的斑马鱼谱系标记方法，该方法基于常用的显微注射、显微观察和免疫荧光技术。我们发现，激光解笼是局部解笼荧光素最高效且成本效益最高的方式。该方法可用于实验终点长达4天的谱系标记。然而，随着细胞分裂，每个细胞中的笼锁荧光素浓度最终会降低至无法检测的水平。此外，已有文献报道在斑马鱼幼体中存在自发性、非特异性的荧光素解笼现象11。因此，对解笼荧光素的检测在早期幼体阶段（48–72小时）或更早时期最为有效。

我们首选的解笼方法是使用脉冲氮激光器。这类激光器通常用于细胞消融实验，能够准确定位并解笼单个细胞或少量细胞群11-12。然而，解笼也可以通过共聚焦显微镜实现；双光子共聚焦显微镜已被用于实现极为精确的解笼12。在另一端，如果不需要高精度，则可以不使用激光器。配备DAPI滤光片组的落射荧光显微镜可通过一个小针孔实现解笼11。

我们发现，使用一抗检测去笼化荧光素，并结合在红色或远红波长（例如 Alexa 633）发射荧...

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致谢

我们感谢 Dan Carlin 在制备笼锁型荧光素方面提供的帮助。此外，我们还要感谢以下资助来源：Vanderbilt 大学医学院发育生物学培训项目对 JAC 的资助，以及 NIH HD054534 对 JTG 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CMNB-笼锁型荧光素 SEInvitrogenC20050
氨基葡聚糖，10 kDaInvitrogenD1860
Zeba 脱盐离心柱Pierce, Thermo Scientific89889
山羊抗荧光素抗体InvitrogenA11095
Alexa Fluor 633 驴抗山羊抗体InvitrogenA21082
35 mm × 10 mm 培养皿BD Biosciences351008
配备 40 倍水浸物镜的直立复合显微镜Leica MicrosystemsDM6000B
MicroPoint 手动激光照射系统Photonic Instruments
苯硫脲（PTU）Alfa AesarL06690
三卡因Sigma-AldrichE10521
蛋白酶 KRoche Group03115836991
塑料细线任意供应商
琼脂糖Research Products International Corp.A20090
真空离心浓缩仪Thermo Fisher Scientific, Inc.Savant SPD131DDA
涡旋混合器VWR internationalVortex Genie 2
压力注射仪Applied Scientific InstrumentationMPPI-3

参考文献

  1. Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
  2. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
  3. Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
  4. Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).
  5. Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
  6. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
  7. Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
  8. Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
  9. Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 9th Edition, 707-711 (2002).
  10. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
  11. Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
  12. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  13. Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.

A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:

Ilya A. Shestopalov and James K. Chen

instead of:

Ilya Shestopalov and James Chen

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