通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

摘要

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。

摘要

同种异体造血干细胞移植（AHSCT）为许多患有先天性和获得性血液系统疾病的患者提供了最佳的治愈机会。然而，供体T细胞若对宿主组织产生异体反应并造成损伤，则可能导致移植物抗宿主病（GvHD）¹。AHSCT成功面临的一个挑战是在预防GvHD的同时，避免损害供体T细胞的有益作用，特别是免疫重建和防止疾病复发。可通过非特异性地从干细胞移植物中清除供体T细胞，或使用药物性免疫抑制来预防GvHD。但这些方法会增加感染和疾病复发的风险^2-4。另一种策略是在移植前，通过受者抗原呈递细胞（APC）对供体T细胞进行异体刺激后，选择性清除具有异体反应性的供体T细胞。早期临床试验表明，此类异体反应性T细胞清除策略在HLA不相合的HSCT后改善了免疫重建，且未导致GvHD显著增加^5,6。然而，部分异体清除技术需要专门制备受者来源的APC^6,7，且某些方法可能存在脱靶效应，包括清除供体中针对病原体特异性的T细胞⁸以及CD4调节性T细胞⁹。另一种替代方法是通过诱导针对异体抗原的特异性低反应性，使异体反应性供体T细胞失活。该方法通过使用受者APC刺激供体细胞，同时阻断CD28介导的共刺激信号来实现¹⁰。这种“异体无能化”（alloanergization）策略可在体外减少1至2个数量级的异体反应性，同时保留对病原体和肿瘤相关抗原的T细胞应答能力¹¹。该策略已在2项已完成和1项正在进行的临床小规模研究中成功应用，在HLA不相合的HSCT期间或之后输注经异体无能化处理的供体T细胞，结果显示出快速的免疫重建、较少的感染发生率，以及比接受未经处理的HLA不相合移植的历史对照组更轻的急性和慢性GvHD¹²。本文中，我们描述了当前用于制备对外源性HLA不相合刺激者外周血单个核细胞（PBMC）产生异体无能化的外周血单个核细胞（PBMC）的技术方案。异体无能化通过在单克隆抗体存在下进行异体刺激来实现，这些抗体靶向B7.1和B7.2配体，以阻断CD28介导的共刺激信号。该技术无需制备特殊的刺激性APC，操作简便，仅需一步相对短暂的体外孵育过程。因此，该方法易于标准化，可用于临床制备具有较低异体反应性但保留针对病原体特异性免疫应答能力的供体T细胞，以在AHSCT背景下进行过继性转移，从而在不引起过度GvHD的前提下促进免疫重建。

方案

1. 外周血单个核细胞的制备

1. 在实施本方案期间，必须遵守良好的无菌操作技术和通用预防措施。
2. 通过使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从健康志愿者供体中分离外周血单个核细胞（PBMC）。或者可复苏冻存的PBMC。
3. 用台盼蓝染色后，使用血细胞计数板计数活PBMC。将PBMC重悬于完全培养基（CM）中，调整浓度为每毫升100万个活细胞，置于15 mL Falcon管中。

2. 建立大规模异体无能共培养体系

1. 需要两个不同供体的外周血单个核细胞（PBMC）来建立同种无能化培养体系。其中一个供体的细胞作为反应细胞，另一个供体的细胞作为刺激细胞（称为第一方刺激细胞）。
2. 将1000万个刺激细胞PBMC以每毫升100万个的密度置于15 mL Falcon管中，并加入100 mg抗B7.1和100 mg抗B7.2抗体以阻断共刺激信号。轻轻振荡管子，孵育30分钟。本步骤及后续所有步骤的孵育条件均为37°C、5% CO₂、80%湿度。
3. 对刺激细胞PBMC进行照射（33 Gy），然后将其加入带有透气盖的T-25（50 cm³）细胞培养瓶中。将该培养瓶标记为“批量同种无能化共培养”。
4. 向培养瓶中加入10 mL反应细胞PBMC（以每毫升100万个细胞的密度悬浮于CM培养基中）。
5. 再加入各100 mg的抗B7.1和抗B7.2抗体，轻轻混匀，随后将培养瓶直立放入培养箱中孵育72小时。

3. 建立大规模对照共培养体系

1. 将1000万个刺激性外周血单个核细胞（PBMC）（浓度为100万个/mL）加入15 mL Falcon管中。
2. 对1000万个刺激性PBMC进行辐照处理（33 Gy），然后加入50 cm³细胞培养瓶中。标记为“批量对照共培养”。
3. 向培养瓶中加入10 mL效应PBMC（浓度为100万个/mL）的完全培养基（CM），轻轻混匀，随后将培养瓶直立放入培养箱中培养72小时。

4. 建立用于评估共刺激阻断疗效的初级混合淋巴细胞反应（MLR）

1. 共刺激阻断的有效性通过使用大量异体无能化共培养物和对照共培养物中的外周血单个核细胞（PBMC）建立的初级混合淋巴细胞反应（MLR）进行测定
2. 初级MLR与大量培养物在同一天建立
3. 首先为需要检测的三个时间点（培养板建立后的第4、5、6天）各标记一块U型底96孔板，标注为“初级MLR”
4. 将大量对照和异体无能化共培养物中的各5 mL培养液分别倒入15 mL Falcon管中
5. 从每根Falcon管中吸取200 µL细胞悬液，加入每块板上的三个复孔中。将来自大量对照共培养物的细胞孔标记为“无共刺激阻断（CSB）”，来自大量异体无能化共培养物的细胞孔标记为“CSB”
6. 在每块板上各加入200 µL完全培养基（CM）至6个孔作为阴性对照。向所有空孔中加入200 µL PBS以减少蒸发。将培养板放入培养箱中

5. 建立二次混合淋巴细胞反应以评估同种无应答诱导的有效性

1. 在建立大规模共培养体系72小时后，通过二次混合淋巴细胞反应（MLR）检测alloanergized PBMC中残余的同种异体反应。在二次MLR中，分别从大规模alloanergizing共培养体系和大规模对照共培养体系中收集PBMC，洗涤后用经辐照的同种异体刺激性PBMC重新刺激。
2. 为设置二次MLR，针对每个待检测的时间点（建立体系后的第3、5和7天），各准备一块U型底96孔板，并标记为“二次MLR”。
3. 从每个大规模对照和alloanergizing共培养体系中取出5 mL培养物，转移至15 mL Falcon管中，于2000 rpm离心5–10分钟。小心吸除上清液，重悬细胞沉淀，加入10 mL完全培养基（CM），再次离心。重复该洗涤步骤一次。
4. 将细胞重悬于1 mL完全培养基（CM）中，使用台盼蓝染色法计数活细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万个活应答细胞。
5. 从每根Falcon管中吸取100 µL细胞悬液，加入每块板的三个复孔中，并将这些孔标记为“第一方（FP）同种再刺激”。
6. 从每根Falcon管中另取100 µL细胞悬液，加入每块板的另外3个孔中，并将这些孔标记为“CD3/28刺激”。
7. 为准备二次MLR的刺激细胞，从与alloanergizing和对照培养体系中所用相同的健康供体的新鲜血液中分离PBMC（或复苏该供体的冻存PBMC）。
8. 将来自第一方（FP）供体的PBMC重悬至浓度为100万个/mL，并进行辐照处理（33 Gy）。
9. 向标记为“FP同种再刺激”的各孔中加入100 µL辐照后的刺激细胞。
10. 作为阳性对照，向标记为“CD3/28刺激”的各孔中加入CD3和CD28单克隆抗体各1 µL及完全培养基（CM）98 µL。每块板另设6个孔，每孔加入200 µL完全培养基（CM）作为阴性对照，并向空孔中加入200 µL PBS。将各板放入培养箱中孵育。

6. 测量异体无能化的特异性

1. 通过在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，使用来自“第三方”健康供体（即不同于第一方的供体）的照射外周血单个核细胞（PBMC）刺激后，比较来自已完成的异体无能化和对照共培养体系的反应细胞的增殖情况，来确定异体无能化的特异性。
2. 标记三个96孔板，分别为“二次MLR特异性”第3天、第5天和第7天。
3. 从每个大量对照和异体无能化共培养体系中取出5 mL，转移至15 mL Falcon管中，以2000 rpm离心5–10分钟。小心吸除上清液，重悬细胞沉淀，加入10 mL完全培养基（CM），再次离心。重复该洗涤步骤一次。
4. 将细胞重悬于1 mL完全培养基（CM）中，用台盼蓝染色法计数，并调整细胞浓度至每毫升含100万个活反应细胞。
5. 为准备二次MLR中的第三方刺激细胞，从新的健康供体新鲜血液中分离PBMC（或复苏冻存的PBMC）。从每个Falcon管中吸取100 mL细胞悬液，加入每块板的三个复孔中。将这些孔标记为“TP异源刺激”。
6. 将来自第三方（TP）供体的PBMC重悬至100万个/mL，并进行照射（33 Gy）。
7. 向标记为“TP异源刺激”的孔中加入200 mL照射后的第三方刺激细胞。
8. 异体无能化的特异性也可通过比较来自已完成的异体无能化和对照共培养体系的反应细胞，在受到如巨细胞病毒（CMV）等感染性病原体刺激后的增殖情况来确定。此步骤中，必须使用先前已证实对CMV裂解物具有增殖反应的供体来源的反应性PBMC。
9. 标记三个96孔板，分别为“二次MLR CMV”第3天、第5天和第7天。
10. 为准备用于检测CMV反应的二次MLR反应细胞，从每个大量对照和异体无能化共培养体系中转移5 mL至15 mL离心管，按前述方法进行洗涤、计数，并以完全培养基（CM）重悬为每毫升100万个细胞。从每个Falcon管中吸取100 mL细胞悬液，加入每块板的3个孔中。
11. 向孔中加入0.1 mL CMV裂解物溶于100 μL完全培养基（CM）中的溶液。
12. 在所有板上各选6个孔加入200 mL完全培养基（CM）作为阴性对照，并向空孔中加入200 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。将各板放入培养箱中孵育。

7. 测定原代和继代混合淋巴细胞反应中的增殖

1. 通过胸苷掺入法检测初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）中应答细胞的增殖情况。初次MLR培养板设置后，在第4、5和6天检测增殖；再次MLR培养板设置后，在第3、5和7天检测增殖。
2. 在收获前16小时，向各孔加入1 mCi的氚标记胸苷
3. 加入氚标记胸苷后，将培养板继续孵育16小时，然后使用Tomtec收获仪（或类似设备）将细胞收集至滤膜上。将滤膜在空气中干燥1小时，放入样品袋中，加入5 mL闪烁液并密封。使用Wallac Micro beta闪烁计数仪或类似仪器读取数据。

8. 计算共刺激阻断在初次混合淋巴细胞反应中的有效性

1. 初始同种异体反应的抑制率（PI）计算公式为：100 × [同种刺激孔中的平均cpm值（bulk alloanergy共培养PBMC）－ 同种刺激孔中的平均cpm值（bulk对照共培养PBMC）]
   

9. 计算同种无能化在二次混合淋巴细胞反应中的效果

继发性同种反应的增殖指数（PI）计算公式如下：

10. 在二次混合淋巴细胞反应中计算异体无能化的特异性

1. 在用 CD3 和 CD28、TP 同种异体刺激物或 CMV 抗原重新刺激细胞后，也可使用此公式计算对这些刺激的增殖指数（PI），从而评估同种无能化过程的特异性。

11. 异基因造血干细胞移植（HSCT）后用于临床的供者异源无能PBMC的制备

1. 可根据上述方案，在HLA不相合的异基因造血干细胞移植（HSCT）后，为临床应用制备供者来源的异体耐受性PBMC。
2. 在为临床应用制备细胞时，应于移植前从HSCT供者获取反应性PBMC，从HSCT受者获取刺激性PBMC。
3. 在为临床应用制备PBMC时，所有操作步骤均须在经认证的干细胞处理机构中，按照药品生产质量管理规范（GMP）条件进行。
4. 需进行额外的质量控制检测，包括内毒素检测、革兰染色及培养，以满足细胞放行用于临床前的安全性标准。

12. 代表性结果

使用HLA不匹配的刺激细胞和反应细胞外周血单个核细胞（PBMC），在初次混合淋巴细胞反应（MLR）中加入共刺激阻断后，反应细胞PBMC在第5天的平均同种增殖水平降低至无共刺激阻断对照组的约30%（±10%，均值±标准差）。这相当于在第5天对初次同种增殖的平均抑制率达到约70%（±10%），图1 A和B。

在第5天的二次混合淋巴细胞反应中，经同种无能化处理的外周血单个核细胞（PBMC）对第三方刺激细胞的增殖反应通常仅为对照PBMC的10-15%（±10%），相当于增殖抑制率平均达到85-90%（±10%），图2A和2B。这表明经同种无能化处理的PBMC对第三方同种刺激细胞呈现低反应性。

相比之下，同种异体无能化的外周血单个核细胞通常对有丝分裂原（CD3/CD28抗体）、第三方同种异体刺激细胞以及巨细胞病毒裂解物（在对巨细胞病毒有反应性的供体中）仍保持70%-100%的增殖能力。这表明，同种异体无能化外周血单个核细胞对第三方同种抗原的低反应性具有特异性，仅限于供体特异性同种抗原。

图1. A. 在无或有共刺激阻断（使用人源化单克隆抗-B7.1 和 -B7.2 抗体）条件下，采用HLA不匹配的刺激细胞与反应细胞外周血单个核细胞（PBMC）进行的初次混合淋巴细胞反应（MLR）中的增殖情况（通过胸苷掺入法测定）。结果展示了8个代表性实验（使用不同的刺激细胞-反应细胞配对）的平均值（±标准差）。B. 在存在共刺激阻断（使用人源化单克隆抗-B7.1 和 -B7.2 抗体）条件下进行的初次MLR中同种异体增殖的抑制百分比。结果展示了与图1A中相同的8个不同刺激细胞-反应细胞配对的平均值（±标准差）。

图 2. A. 在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，来自初次MLR的反应性外周血单个核细胞（PBMC）——初次MLR在无共刺激阻断（对照PBMC）或存在共刺激阻断（同种无能PBMC）条件下进行——被照射的第一方刺激细胞再次刺激后，细胞增殖情况（通过胸腺嘧啶掺入法测定）。结果以图1所示的8个不同刺激细胞-反应细胞配对的均值（±标准差）表示。B. 在二次MLR中，当来自初次MLR（在无共刺激阻断[对照PBMC]或存在共刺激阻断[同种无能PBMC]条件下进行）的反应性PBMC被照射的第一方刺激细胞再次刺激时，对第一方同种异体增殖反应的抑制百分比。结果以图1及图2A所示8个不同刺激细胞-反应细胞配对的均值（±标准差）表示。

讨论

通过在共刺激阻断存在的情况下对供者外周血单个核细胞（PBMC）进行同种抗原刺激，诱导针对同种抗原的低反应性或无能状态，是一种简便的技术，可用于制备同种反应性降低的供者PBMC。我们已在实验室中建立了该技术流程，并正在临床中应用此策略，以制备同种反应性降低的供者PBMC，用于HLA不相合的异基因造血干细胞移植（HSCT）后的输注。采用此类治疗的目的是在不增加毒性的前提下改善免疫重建。尽管目前该策略的临床应用仅限于异基因HSCT的情境，但该方法也可应用于其他由异常T细胞反应导致组织损伤的情况，例如实体器官移植排斥反应或自身免疫性疾病。

在同种无能化共培养过程中，可使用多种试剂阻断由CD28介导的共刺激信号。本文描述了我们目前采用的方案，即使用临床级人源化鼠单克隆抗体靶向CD28的配体（B7.1和B7.2）。非临床级鼠抗人B7.1和B7.2抗体可从多家供应商商业化获得。此外，也可在同种无能化过程中使用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA）4-免疫球蛋白（Ig）融合蛋白来阻断CD28共刺激。CTLA4-Ig由CTLA4分子的胞外段与IgG Fcγ受体连接而成，可高亲和力结合B7.1和B7.2。使用CTLA4-Ig可实现与人外周血单个核细胞（PBMCs）同种无能化相似的效果和特异性。

异体无能化技术操作简便。可使用新鲜或先前冻存的刺激型外周血单个核细胞，其处理结果无显著差异。该方法仅需一个相对较短的体外孵育步骤，且无需细胞分选操作，从而最大限度地降低了细胞输注前发生细胞死亡和细菌污染的风险，使得该策略在临床规模上应用相对简单。

我们所描述的方法（以及其他选择性降低人细胞同种反应性的方法）的一个局限性在于，目前缺乏一种能够实时检测残余同种反应性的检测手段。增殖实验需要3至5天才能完成，以确认同种反应性的降低程度，而用于临床的细胞必须在这些实验结果出来之前输注给患者。此外，尽管通过胸苷掺入法检测外周血单个核细胞（PBMC）增殖较为简便，但该方法不仅检测T细胞的增殖，还同时检测B细胞及其他细胞亚群的增殖。CFSE染料稀释法可用于检测应答性PBMC，可作为替代实验方法，并能够确定T细胞不同亚群特异性的同种增殖反应。为进一步提升本策略在临床上的应用，一种可行途径是开发并验证一种仅需数小时即可完成的同种反应性检测方法，以便在同种无能化细胞释放用于临床前完成检测。

除了证明该策略的有效性之外，确认异体无能化过程的特异性也非常重要。这可以通过测定针对第三方异体刺激细胞的异体反应性是否相对保留来轻松实现；此外，当对巨细胞病毒（CMV）反应性的供体细胞进行异体无能化时，还可通过检测其对CMV的增殖反应是否得以保留来确认特异性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-谷氨酰胺 200mM	Invitrogen	25030-081
庆大霉素	Invitrogen	15750-060
人AB血清（热灭活）	Gemini Bio Products	100-512	使用经过验证的批次
完全培养基（500ml）			440ml RPMI 1640，50ml AB血清，5ml Hepes，5ml 谷氨酰胺，167μL 庆大霉素
照射仪	GammaCell 1000
带透气盖的T-25细胞培养瓶	Corning	3056
人源化单克隆抗B7.1和抗B7.2抗体			参见实验方案正文
U型底96孔培养板	BD Biosciences	353077
单克隆CD3抗体	Beckman Coulter Inc.	IM0178	用200ml蒸馏水重悬
单克隆CD28抗体	Beckman Coulter Inc.	IM1376	用200ml蒸馏水重悬
CMV 2级抗原	Microbix	EL-01-02
氚标记胸腺嘧啶	NEN	NET027
闪烁液	PerkinElmer, Inc.	1205-440
细胞收集器	Tomtec
打印滤膜A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
滤膜袋	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux 闪烁计数仪	Wallac
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