一种用于研究视网膜神经节细胞存活的视神经 crush 损伤小鼠模型

摘要

本方案展示了如何逆行标记视网膜神经节细胞，以及随后如何制造视神经 crush 损伤，以分析视网膜神经节细胞的存活与凋亡情况。该模型是一种用于研究不同类型视神经病变（包括青光眼）的实验性疾病模型。

摘要

视神经损伤可导致轴突变性，随后引起视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐死亡，从而造成不可逆的视力丧失。人类中此类疾病的例子包括外伤性视神经病变和青光眼中的视神经变性。其特征为视神经乳头的典型改变、进行性视神经变性和视网膜神经节细胞的丢失，若不加以控制，最终将导致视力丧失和失明。

视神经钳夹（ONC）损伤小鼠模型是研究外伤性视神经病变、青光眼等疾病的重要实验模型。在该模型中，视神经受到钳夹损伤后，会导致视网膜神经节细胞逐渐发生凋亡。该疾病模型可用于研究神经元死亡与存活的普遍过程和机制，这对于治疗策略的开发至关重要。此外，可在此模型中应用药理学和分子生物学方法，识别并验证潜在的治疗试剂，以治疗不同类型的视神经病变。

本文提供了以下步骤的逐步演示：（I）第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记，（II）第4天实施视神经 crush 损伤，（III）第11天获取视网膜并分析RGC存活情况，以及（IV）代表性结果。

方案

所有使用的仪器和试剂均为无菌。所有动物实验均经国家眼科研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准（动物研究方案编号 NEI-570），并依照美国国立卫生研究院（NIH）的指南与规定进行。

1. 第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记

本实验的目的是在小鼠视神经 crush 损伤前 3 天，将神经示踪染料注射到上丘，从而逆行标记视网膜神经节细胞。该染料可被视网膜神经节细胞逆行摄取，作为存活 RGCs 的标记物（图 1）。该方法可稳定地标记存活的 RGCs，个体间差异较小^1-5。

1. 对小鼠进行深度麻醉。清理头部上方的毛发，将小鼠置于小型立体定位仪中。在双眼涂抹保护性软膏，并分别使用碘伏和70%酒精擦拭消毒头部皮肤各三次。
2. 切开皮肤以暴露颅骨，并使用3%过氧化氢保持术区干燥清洁。
3. 确定并标记前囟位置，在每侧半球前囟后方2.9 mm、中线外侧0.5 mm处钻孔⁷。钻孔过程中需向钻孔部位滴加生理盐水，以防止继发性热损伤。
4. 利用立体定位测量装置和哈密尔顿注射器，将FluoroGold神经示踪染料（1 μl 含3% Fluorochrome的生理盐水溶液）缓慢注入每侧上丘，进针深度为颅骨表面下1.6 mm。
5. 缝合切口，并皮下注射布托啡诺以镇痛。

讨论

视神经 crush 损伤小鼠模型可用于研究视网膜神经节细胞（RGC）死亡与存活的过程。该模型也常用于探讨不同试剂和基因对 RGC 凋亡及存活的影响。此模型的一个优点是具有高度的可重复性，且个体间差异极小。

然而，该模型中的多个步骤需要特别注意。首先，在制造视神经挤压损伤时，必须避免使用过大的力量或挤压时间过长，因为这可能导致眼动脉受损，进而引发视网膜缺血。此外，在暴露视神经的过程中，应格外小心，避免损伤小鼠眼球周围其他血管。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪	ASI Instruments	SAS-4100
解剖显微镜	World Precision Instruments, Inc.	PZMIV-BS
手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12
15号手术刀片	Fine Science Tools	10015-00
微型钻头	Fine Science Tools	18000-17
缝合针	Fine Science Tools	12050-03
弹簧剪	Fine Science Tools	16144-13
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-50
Hamilton 注射器	Hamilton Co	88400
纱布海绵	Office Depot	674889
荧光染料	Sigma-Aldrich	39286
酒精	Sigma-Aldrich	459844	70%
H2O2	Sigma-Aldrich	H3410	3%