本方案展示了如何逆行标记视网膜神经节细胞，以及随后如何制造视神经 crush 损伤，以分析视网膜神经节细胞的存活与凋亡情况。该模型是一种用于研究不同类型视神经病变（包括青光眼）的实验性疾病模型。
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本文内容
摘要
摘要
视神经损伤可导致轴突变性，随后引起视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐死亡，从而造成不可逆的视力丧失。人类中此类疾病的例子包括外伤性视神经病变和青光眼中的视神经变性。其特征为视神经乳头的典型改变、进行性视神经变性和视网膜神经节细胞的丢失，若不加以控制，最终将导致视力丧失和失明。
视神经钳夹（ONC）损伤小鼠模型是研究外伤性视神经病变、青光眼等疾病的重要实验模型。在该模型中，视神经受到钳夹损伤后，会导致视网膜神经节细胞逐渐发生凋亡。该疾病模型可用于研究神经元死亡与存活的普遍过程和机制，这对于治疗策略的开发至关重要。此外，可在此模型中应用药理学和分子生物学方法，识别并验证潜在的治疗试剂，以治疗不同类型的视神经病变。
本文提供了以下步骤的逐步演示：（I）第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记，（II）第4天实施视神经 crush 损伤，（III）第11天获取视网膜并分析RGC存活情况，以及（IV）代表性结果。
方案
所有使用的仪器和试剂均为无菌。所有动物实验均经国家眼科研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准（动物研究方案编号 NEI-570），并依照美国国立卫生研究院（NIH）的指南与规定进行。
1. 第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记
本实验的目的是在小鼠视神经 crush 损伤前 3 天，将神经示踪染料注射到上丘，从而逆行标记视网膜神经节细胞。该染料可被视网膜神经节细胞逆行摄取，作为存活 RGCs 的标记物（图 1）。该方法可稳定地标记存活的 RGCs，个体间差异较小1-5。
- 对小鼠进行深度麻醉。清理头部上方的毛发，将小鼠置于小型立体定位仪中。在双眼涂抹保护性软膏，并分别使用碘伏和70%酒精擦拭消毒头部皮肤各三次。
- 切开皮肤以暴露颅骨，并使用3%过氧化氢保持术区干燥清洁。
- 确定并标记前囟位置，在每侧半球前囟后方2.9 mm、中线外侧0.5 mm处钻孔7。钻孔过程中需向钻孔部位滴加生理盐水，以防止继发性热损伤。
- 利用立体定位测量装置和哈密尔顿注射器，将FluoroGold神经示踪染料（1 μl 含3% Fluorochrome的生理盐水溶液）缓慢注入每侧上丘，进针深度为颅骨表面下1.6 mm。
- 缝合切口，并皮下注射布托啡诺以镇痛。
- 将小鼠转移至温暖干燥的环境中，持续观察直至其能够自主维持直立姿势，然后将其放回原饲养笼。标记操作后的前三天内，每天两次给予全身性镇痛药（如布托啡诺）及局部抗生素软膏，并密切监测小鼠状态。
2. 第4天视神经 crush 损伤
在此操作中，我们将对视神经施加挤压损伤，以造成轴突的原发性损伤（图2），这将导致视网膜神经节细胞逐渐死亡。
- 在示踪染料注射后第三天，对小鼠进行深度麻醉。使用解剖显微镜，用弹簧剪刀在一只眼睛的结膜约4点钟位置做切口。
- 轻柔地拨开眶内肌肉并将其移至一侧，暴露视神经自眼球后方穿出的白色部分。操作过程中需格外小心，避免损伤任何血管。
- 借助交叉作用镊子，在距离眼球约2 mm处对视神经施加约3秒的压榨性损伤。操作时须特别注意避免损伤眼动脉，以防出血。
- 完成压榨损伤后，缝合切口。
- 在小鼠苏醒前，皮下注射布托啡诺以提供镇痛。
- 将小鼠转移至温暖干燥的区域进行监测，直至其能够自主维持直立姿势，随后将其放回原饲养笼。在压榨损伤手术后的前三天内，每天两次给予全身性镇痛药（如布托啡诺）和局部抗生素软膏，并对小鼠进行密切观察。
3. 在第11天收获视网膜并分析视网膜神经节细胞存活情况
本实验的目的是获取视网膜，以分析视网膜神经节细胞的存活情况。
- 在第11天（视神经钳夹损伤后第7天），通过注入CO2并行颈椎脱位处死小鼠。
- 使用镊子对眼眶施加压力，摘除眼球。
- 将眼球置于4%多聚甲醛溶液中固定2小时，随后用PBS洗涤三次。分离视网膜。视网膜分离的操作步骤此前已于2010年由Gustmann, S. et al.6在JoVE上发表，因此本文不再赘述。
- 使用荧光显微镜在视网膜的特定区域拍摄存活的视网膜神经节细胞图像，并可计数视网膜神经节细胞密度。图3展示了经荧光标记的视网膜神经节细胞在有或无视神经钳夹损伤情况下的代表性结果。
4. 典型结果：
为分析视网膜神经节细胞的存活情况，在视神经 crush 损伤后第 7 天取视网膜组织，固定、展平并封片。使用荧光显微镜拍摄视网膜图像。与未受伤的正常视网膜（左侧，正常）相比，视神经 crush 损伤后的视网膜中存活的 RGC 数量（绿色，由注射至上丘的 FluoroGold 神经示踪染料逆行标记）显著减少（右侧，ONC）（图 3）。
图1. 视网膜神经节细胞的基础逆行标记
为了在视神经 crush 损伤后的不同时间点计数存活的视网膜神经节细胞，需在视神经（红色）损伤前3天，向大脑中的上丘注射一种神经示踪染料（绿色），从而逆行标记视网膜神经节细胞。由于视网膜神经节细胞的轴突终止于上丘，示踪染料将被这些细胞逆行摄取，从而标记出存活的视网膜神经节细胞。
图2. 视神经 crush 损伤
为分析视网膜神经节细胞存活状态，需对视神经（红色）施加 crush 损伤，以造成轴突的原发性损伤。这将导致视网膜神经节细胞逐渐死亡。在示踪染料（绿色）注射后三天，对小鼠进行麻醉。切开单侧眼睛的结膜，拨开眼眶肌肉并将其移开，暴露视神经自眼球出口处。使用交叉动作镊子在距眼球约 2 mm 处对视神经施加约 3 秒的 crush 损伤。
图 3. 视神经 crush 损伤前后荧光标记的视网膜神经节细胞
为分析视网膜神经节细胞的存活情况，在视神经 crush 损伤后第七天取材视网膜，固定、展平并封片。使用荧光显微镜拍摄视网膜图像。与未受伤的正常视网膜（左侧，正常）相比，视神经 crush 损伤后的视网膜（右侧，ONC）中存活的 RGC 数量显著减少（绿色，由注射至上丘的神经示踪染料 FluoroGold 逆行标记）（图 3）。比例尺：50 μm
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讨论
视神经 crush 损伤小鼠模型可用于研究视网膜神经节细胞（RGC）死亡与存活的过程。该模型也常用于探讨不同试剂和基因对 RGC 凋亡及存活的影响。此模型的一个优点是具有高度的可重复性，且个体间差异极小。
然而，该模型中的多个步骤需要特别注意。首先，在制造视神经挤压损伤时，必须避免使用过大的力量或挤压时间过长，因为这可能导致眼动脉受损，进而引发视网膜缺血。此外，在暴露视神经的过程中，应格外小心，避免损伤小鼠眼球周围其他血管。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们的研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所的院内研究计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体定位仪 | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| 解剖显微镜 | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 15号手术刀片 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| 微型钻头 | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 缝合针 | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton 注射器 | Hamilton Co | 88400 | |
| 纱布海绵 | Office Depot | 674889 | |
| 荧光染料 | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| 酒精 | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
参考文献
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
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