星状细胞分离的七个步骤

摘要

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外 通过蛋白酶-胶原酶处理后再进行密度梯度离心。该技术可获得高纯度的肝星状细胞。

摘要

肝星状细胞是定居于肝脏、具有星形形态的细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的狄氏间隙中^1,2。星状细胞来源于骨髓前体细胞，可储存体内高达80%的维生素A^{1, 2}。在活化后，星状细胞可分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质，从而促进肝纤维化³。基于其收缩能力，肌成纤维样星状细胞可调节与门静脉高压相关的血管张力⁴。最近，我们证实肝星状细胞具有强大的抗原呈递功能，能够激活NKT细胞以及传统T淋巴细胞⁵。

本文介绍一种从小鼠肝脏中高效制备肝星状细胞的方法。由于肝星状细胞位于窦周间隙，其分离过程需分步进行。为了使星状细胞能够从狄氏腔隙中被有效分离，需对小鼠肝脏进行灌流 原位 使用消化酶Pronase E和Collagenase P进行灌注。灌注后，肝组织再经Pronase E和Collagenase P的进一步酶处理 体外随后，该方法利用了肝星状细胞内大量储存维生素A的脂滴这一特性。此特性使得可通过在8% Nycodenz梯度溶液中离心，将星状细胞与其他肝细胞分离开来。本文所述方案可获得纯度高且均一的星状细胞群体。在进行荧光显微镜或流式细胞术分析之前，可通过标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色来评估细胞制备物的纯度。此外，光学显微镜下可观察到肝星状细胞特有的星形形态，并富含大量脂滴。

综上所述，我们提供了一种高效分离肝星状细胞的详细方案，包括肝星状细胞形态特征及GFAP表达的代表性图像，有助于界定肝星状细胞的特性。

方案

建议使用约20周龄或更年长的C57BL/6小鼠。推荐使用体重为25–30 g的雄性小鼠。在分离星状细胞前，通过给予小鼠富含维生素A的饮食喂养2个月，可提高星状细胞的得率。从一只C57BL/6小鼠肝脏中可纯化出约2×10⁵个肝星状细胞，而从Balb/c小鼠中获得的星状细胞得率明显更高。以下实验方案按5只小鼠的用量进行调整。动物饲养与实验操作均依照经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程进行。

1. 原位 小鼠肝脏灌注消化酶

1. 将SC1缓冲液和酶灌注溶液在水浴中预热 37°C 水浴锅
2. 将带翼输液器安装到蠕动泵的硅胶管上。
3. 用 PBS 校准泵，以获得 6.5 ml/min 的层流，该流速将用于后续实验 原位 肝脏灌注。用SC1溶液平衡硅胶管。
4. 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）溶液麻醉小鼠，并检测反射消失以确认深度麻醉状态。
5. 将小鼠仰卧位固定于合适的基座上。
6. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。
7. 小心切开腹膜，并将肠管移出腹腔，置于动物左侧，以暴露门静脉。
8. 将输注装置的套管插入门静脉。建议在该步骤中使用体视显微镜。
9. 用30 ml SC1溶液开始灌注肝脏。启动灌流后立....

讨论

肝星状细胞调控肝脏内重要的生理和病理生理过程。此外，星状细胞具有抗原呈递特性，使其成为肝脏免疫反应的重要组成部分。尽管肝星状细胞占肝脏总细胞数的10-15%，但由于其定位于窦周间隙（Disse间隙），分离这些细胞具有较大挑战性。

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的简便方法 原位 消化及后续的梯度离心。该方案可分离出高纯度的星状细胞，适用于免疫学检测。

通过考虑肝星状细胞的三个主要特征——星状形态、胞周脂质囊泡中储存维生素A以及GFAP的表达，可以控制分离细胞的纯度。根据这些标准，采用所述方案获得的星状细胞经免疫荧光染色和流式细胞术评估，纯度通常约为99%。星状细胞分离过程中可能的污染物是库普弗细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们通过流式细胞术对星状细胞培养物进行表面分子F4/80（库普弗细胞）和CD11c（DCs）的染色分析。结果显示，未检测到F4/80+和CD11c+细胞，表明星状细胞制备物中不存在库普弗细胞或DCs的污染。因此，无需进一步富集或分选步骤，使得所述肝星状细胞分离方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70μm 细胞筛	BD Biosciences	352350
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
胶原酶 P	Roche Group	11249002001
DMEM	GIBCO，由 Life Technologies 生产	11960
DNase I	Roche Group	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031-cv
EGTA	Fluka	3777
胎牛血清	GIBCO，由 Life Technologies 生产	16000
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
梯度离心管	Greiner Bio-One	163160
HEPES	GIBCO，由 Life Technologies 生产	15630
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
L-谷氨酰胺	GIBCO，由 Life Technologies 生产	25030
MgCl2·6H2O	Fluka	63068
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
Na2HPO4·2H2O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH2PO4·H2O	Fluka	71507
NaHCO3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
青霉素/链霉素	GIBCO，由 Life Technologies 生产	15140
蠕动泵	Cole-Parmer	HV-7523-70
酚红	Sigma-Aldrich	P4633
蛋白酶 E	Calbiochem	7433-2
硅胶管	Masterflex (Cole-Parmer)	HV-96440-14
丙酮酸钠	GIBCO，由 Life Technologies 生产	11360
组织培养瓶 (25 cm2)	BD Biosciences	353108
带翼输液器	Terumo Medical Corp.	1SV27EL