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方法文章

星状细胞分离的七个步骤

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DOI：

10.3791/2710

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2011年5月10日

 ,  , 
1Immune Disease Institute, Program in Cellular and Molecular Medicine at Children's Hospital, Department of Pathology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外 通过蛋白酶-胶原酶处理后再进行密度梯度离心。该技术可获得高纯度的肝星状细胞。

摘要

肝星状细胞是定居于肝脏、具有星形形态的细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的狄氏间隙中1,2。星状细胞来源于骨髓前体细胞，可储存体内高达80%的维生素A1, 2。在活化后，星状细胞可分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。基于其收缩能力，肌成纤维样星状细胞可调节与门静脉高压相关的血管张力4。最近，我们证实肝星状细胞具有强大的抗原呈递功能，能够激活NKT细胞以及传统T淋巴细胞5。

本文介绍一种从小鼠肝脏中高效制备肝星状细胞的方法。由于肝星状细胞位于窦周间隙，其分离过程需分步进行。为了使星状细胞能够从狄氏腔隙中被有效分离，需对小鼠肝脏进行灌流 原位 使用消化酶Pronase E和Collagenase P进行灌注。灌注后，肝组织再经Pronase E和Collagenase P的进一步酶处理 体外随后，该方法利用了肝星状细胞内大量储存维生素A的脂滴这一特性。此特性使得可通过在8% Nycodenz梯度溶液中离心，将星状细胞与其他肝细胞分离开来。本文所述方案可获得纯度高且均一的星状细胞群体。在进行荧光显微镜或流式细胞术分析之前，可通过标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色来评估细胞制备物的纯度。此外，光学显微镜下可观察到肝星状细胞特有的星形形态，并富含大量脂滴。

综上所述，我们提供了一种高效分离肝星状细胞的详细方案，包括肝星状细胞形态特征及GFAP表达的代表性图像，有助于界定肝星状细胞的特性。

方案

建议使用约20周龄或更年长的C57BL/6小鼠。推荐使用体重为25–30 g的雄性小鼠。在分离星状细胞前，通过给予小鼠富含维生素A的饮食喂养2个月，可提高星状细胞的得率。从一只C57BL/6小鼠肝脏中可纯化出约2×105个肝星状细胞，而从Balb/c小鼠中获得的星状细胞得率明显更高。以下实验方案按5只小鼠的用量进行调整。动物饲养与实验操作均依照经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程进行。

1. 原位 小鼠肝脏灌注消化酶

  1. 将SC1缓冲液和酶灌注溶液在水浴中预热 37°C 水浴锅
  2. 将带翼输液器安装到蠕动泵的硅胶管上。
  3. 用 PBS 校准泵，以获得 6.5 ml/min 的层流，该流速将用于后续实验 原位 肝脏灌注。用SC1溶液平衡硅胶管。
  4. 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）溶液麻醉小鼠，并检测反射消失以确认深度麻醉状态。
  5. 将小鼠仰卧位固定于合适的基座上。
  6. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。
  7. 小心切开腹膜，并将肠管移出腹腔，置于动物左侧，以暴露门静脉。
  8. 将输注装置的套管插入门静脉。建议在该步骤中使用体视显微镜。
  9. 用30 ml SC1溶液开始灌注肝脏。启动灌流后立即打开下腔静脉。肝脏组织颜色褪去表明肝脏灌流成功。
  10. 用 30 ml Pronase E 溶液灌注肝脏。消化成功后，肝叶将肿胀，肝小叶通过被膜可见明显分界。
  11. 用30 ml胶原酶P溶液灌注肝脏。此时肝脏已失去原有形态，呈无张力且无固定形状的状态。
  12. 小心地将肝脏与膈膜及周围器官分离，并将其置于冰上的70 ml SC2溶液中保存。
  13. 对其他小鼠重复该操作步骤。

2. 小鼠肝脏的体外消化

所有后续操作步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。

  1. 使用锋利的剪刀将肝脏切成约 2x2x2mm3 的小块。
  2. 将含有肝组织块的 70ml SC2 悬液与 50ml Pronase E-Collagenase P 溶液混合，并加入 1ml DNase I 溶液。
  3. 在 37°C 下搅拌消化肝脏组织 20 分钟。

3. 密度梯度离心

  1. 将细胞悬液通过70μm细胞滤网过滤至6个50ml Falcon离心管中，并用SC2缓冲液补至50ml。在4°C条件下，以600g离心10分钟。
  2. 小心吸除每管中的40ml上清液，然后向每管中加入150μl DNase I溶液并重悬细胞。
  3. 将细胞悬液合并至4个50ml Falcon离心管中，用GBSS-B洗涤，在4°C条件下以600g离心10分钟。
  4. 小心尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀，向每管中加入150μl DNase I溶液。每管用10ml GBSS-B重悬细胞沉淀。
  5. 将细胞合并至2个50ml Falcon离心管中，每管加入GBSS-B至总体积为36ml。每管加入14ml Nycodenz溶液，并充分混匀。
  6. 将10ml细胞悬液转移至一个12ml梯度离心管中，共得到10个离心管。每管轻轻覆盖1.5ml GBSS-B。
  7. 在4°C条件下以1500g离心15分钟（不启用刹车）。离心后，肝细胞将沉淀于管底，而星状细胞则位于界面层，呈白色环状。
  8. 小心收集含有星状细胞的界面层，并用GBSS-B洗涤；在4°C条件下以600g离心10分钟。
  9. 吸除上清液，将细胞重悬于20ml DMEM培养基中，该培养基添加有10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES。将细胞以2×104 cells/cm2的密度接种至组织培养瓶中。在37°C、5% CO2条件下培养细胞。
  10. 一旦肝星状细胞贴壁（约制备后2小时），立即更换培养基，以去除死细胞和细胞碎片。
  11. 次日，星状细胞应呈现出其特征性的星形形态，并含有围绕细胞核的储存维生素A的脂滴。
  12. 在后续实验中，肝星状细胞可使用温和的酶溶液（如Accutase）轻松从非包被的塑料表面解离。

4. 代表性结果：

在按照所提供的方案制备肝星状细胞后，可通过考察该细胞类型的三个主要特征——星状形态、胞周脂滴以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达——来检测所分离细胞群体的纯度。图中展示了肝星状细胞在分离后2小时以及第1天和第3天时的典型形态特征。 体外 图1展示了培养情况。图2显示了细胞分离后培养3天的肝星状细胞中GFAP的代表性免疫荧光染色结果。肝星状细胞在培养过程中分化为成纤维肌细胞。 体外 培养。这些活化的星状细胞的一个特征性标志是表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。图3显示了培养第7天活化星状细胞中αSMA和肌球蛋白IIA的免疫荧光染色结果。 体外 培养

脂质体显微图像，可见细胞；四组实验，脂质分析。
图1. 肝星状细胞的典型形态学特征。采用所提供的方案从小鼠肝脏中分离肝星状细胞。图像显示细胞分离后2小时（a, b）、第1天（c）和第3天（d）的肝星状细胞形态。 体外 培养。肝星状细胞在培养最初几天于核周区域表现出大量脂质囊泡，并逐渐获得其特有的星状形态。 体外 培养（放大倍数 200x）。

细胞结构分析；显微镜图像显示神经元细胞中的荧光，呈蓝色和橙色。
图2. 肝星状细胞在肝脏中特异性表达 GFAP。在分离星状细胞后的第 3 天，通过免疫荧光染色检测 GFAP（红色）。 体外 细胞核以蓝色显示（Hoechst 染色）。

细胞结构荧光显微镜图像；肌动蛋白丝和细胞核染色；细胞研究。
图3. 肝星状细胞分化为肌成纤维细胞。从C57BL/6小鼠中分离的肝星状细胞培养7天后，转移至腔室载玻片，并对aSMA（红色显示）和肌球蛋白IIA（绿色显示）进行染色。细胞核用Hoechst复染（蓝色）。

SC1 缓冲液
EGTA190mg
葡萄糖900mg
HEPES10 ml 的 1M 储存液
KCl400mg
Na2HPO4 · 2 H2O151mg
NaCl8g
NaH2PO4 · H2O78mg
NaHCO3350mg
酚红6mg
dH2O加水至 1L
SC2 缓冲液
CaCl2 · 2H2O560mg
HEPES10ml 的 1M 储存液
KCl400mg
Na2HPO4 · 2 H2O151mg
NaCl8g
NaH2PO4 · H2O78mg
NaHCO3350mg
酚红6mg
dH2O加水至 1L
GBSS-A 缓冲液
KCl370mg
CaCl2 · 2H2O225mg
葡萄糖991mg
KH2PO430mg
MgCl2 · 6 H2O210mg
MgSO4 · 7 H2O70mg
Na2HPO4 · 2 H2O75mg
NaHCO3227mg
酚红6mg
dH2O加水至 1L
GBSS-B 缓冲液
CaCl2 · 2H2O225mg
葡萄糖991mg
KCl370mg
KH2PO430mg
MgCl2 · 6 H2O210mg
MgSO4 · 7 H2O70mg
Na2HPO4 · 2 H2O75mg
NaCl8g
NaHCO3227mg
酚红6mg
dH2O加水至 1L
蛋白酶 E 灌注液
蛋白酶 E100mg (4000 PU/mg min)
SC2 缓冲液200ml
胶原酶 P 灌注液
胶原酶 P85mg (1.78 U/mg lyo)
SC2 缓冲液200ml
蛋白酶 E-胶原酶 P 混合液
蛋白酶 E50mg (4000 PU/mg min)
胶原酶 P85mg (1.78 U/mg lyo)
SC2 缓冲液50ml
DNase I 溶液
DNase I6mg (约 2000U/mg)
GBSS-B3ml
Nycodenz 溶液
Nycodenz8g
GBSS-A28ml

表1. 分离肝星状细胞所需的缓冲液和酶溶液。所有缓冲液的pH值应调整至7.3–7.4。此外，建议对所有缓冲液进行无菌过滤。根据所用酶的酶活性调整用量至关重要。

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讨论

肝星状细胞调控肝脏内重要的生理和病理生理过程。此外，星状细胞具有抗原呈递特性，使其成为肝脏免疫反应的重要组成部分。尽管肝星状细胞占肝脏总细胞数的10-15%，但由于其定位于窦周间隙（Disse间隙），分离这些细胞具有较大挑战性。

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的简便方法 原位 消化及后续的梯度离心。该方案可分离出高纯度的星状细胞，适用于免疫学检测。

通过考虑肝星状细胞的三个主要特征——星状形态、胞周脂质囊泡中储存维生素A以及GFAP的表达，可以控制分离细胞的纯度。根据这些标准，采用所述方案获得的星状细胞经免疫荧光染色和流式细胞术评估，纯度通常约为99%。星状细胞分离过程中可能的污染物是库普弗细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们通过流式细胞术对星状细胞培养物进行表面分子F4/80（库普弗细胞）和CD11c（DCs）的染色分析。结果显示，未检测到F4/80+和CD11c+细胞，表明星状细胞制备物中不存在库普弗细胞或DCs的污染。因此，无需进一步富集或分选步骤，使得所述肝星状细胞分离方案...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由Smith Family生物医学研究卓越奖和美国国立卫生研究院（NIH）RO1 AI083426-01（F.W.）资助。Patrick Maschmeyer和Melanie Flach获得勃林格殷格翰基金会博士研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70μm 细胞筛BD Biosciences352350
CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3306
胶原酶 PRoche Group11249002001
DMEMGIBCO，由 Life Technologies 生产11960
DNase IRoche Group10104159001
DPBSCellgro21-031-cv
EGTAFluka3777
胎牛血清GIBCO，由 Life Technologies 生产16000
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
梯度离心管Greiner Bio-One163160
HEPESGIBCO，由 Life Technologies 生产15630
KClSigma-AldrichP9541
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
L-谷氨酰胺GIBCO，由 Life Technologies 生产25030
MgCl2·6H2OFluka63068
MgSO4·7H2OSigma-AldrichM2773
Na2HPO4·2H2OFluka71643
NaClSigma-AldrichS3014
NaH2PO4·H2OFluka71507
NaHCO3Fluka71628
NycodenzAccudenz AGAN7050/BLK
青霉素/链霉素GIBCO，由 Life Technologies 生产15140
蠕动泵Cole-ParmerHV-7523-70
酚红Sigma-AldrichP4633
蛋白酶 ECalbiochem7433-2
硅胶管Masterflex (Cole-Parmer)HV-96440-14
丙酮酸钠GIBCO，由 Life Technologies 生产11360
组织培养瓶 (25 cm2)BD Biosciences353108
带翼输液器Terumo Medical Corp.1SV27EL

参考文献

  1. Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
  2. Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
  3. Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
  4. Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
  5. Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
  6. Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
  7. Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).

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