方法文章

星状细胞分离的七个步骤

DOI：

10.3791/2710

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2011年5月10日

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1Immune Disease Institute, Program in Cellular and Molecular Medicine at Children's Hospital, Department of Pathology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

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本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外 通过蛋白酶-胶原酶处理后再进行密度梯度离心。该技术可获得高纯度的肝星状细胞。

摘要

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肝星状细胞是定居于肝脏、具有星形形态的细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的狄氏间隙中1,2。星状细胞来源于骨髓前体细胞，可储存体内高达80%的维生素A1, 2。在活化后，星状细胞可分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。基于其收缩能力，肌成纤维样星状细胞可调节与门静脉高压相关的血管张力4。最近，我们证实肝星状细胞具有强大的抗原呈递功能，能够激活NKT细胞以及传统T淋巴细胞5。

本文介绍一种从小鼠肝脏中高效制备肝星状细胞的方法。由于肝星状细胞位于窦周间隙，其分离过程需分步进行。为了使星状细胞能够从狄氏腔隙中被有效分离，需对小鼠肝脏进行灌流 原位 使用消化酶Pronase E和Collagenase P进行灌注。灌注后，肝组织再经Pronase E和Collagenase P的进一步酶处理 体外随后，该方法利用了肝星状细胞内大量储存维生素A的脂滴这一特性。此特性使得可通过在8% Nycodenz梯度溶液中离心，将星状细胞与其他肝细胞分离开来。本文所述方案可获得纯度高且均一的星状细胞群体。在进行荧光显微镜或流式细胞术分析之前，可通过标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色来评估细胞制备物的纯度。此外，光学显微镜下可观察到肝星状细胞特有的星形形态，并富含大量脂滴。

综上所述，我们提供了一种高效分离肝星状细胞的详细方案，包括肝星状细胞形态特征及GFAP表达的代表性图像，有助于界定肝星状细胞的特性。

方案

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建议使用约20周龄或更年长的C57BL/6小鼠。推荐使用体重为25–30 g的雄性小鼠。在分离星状细胞前2个月，通过给予富含维生素A的饮食可提高星状细胞的得率。从一只C57BL/6小鼠肝脏中可纯化得到约2×105个肝星状细胞，而Balb/c小鼠的星状细胞得率明显更高。以下实验方案适用于5只小鼠。动物饲养与实验操作均依照经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程进行。

1. 原位 小鼠肝脏灌注消化酶

  1. 将 SC1 缓冲液和酶灌注溶液在 37 ℃ 下预热°C 水浴
  2. 将带翼输液器安装到蠕动泵的硅胶管上。
  3. 用 PBS 校准泵，以获得 6.5 ml/min 的层流，该流速将用于后续实验 原位 肝脏灌注。用SC1溶液平衡硅胶管。
  4. 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）溶液麻醉小鼠，并检测反射消失以确认深度麻醉状态。
  5. 将小鼠仰卧固定在合适的基座上。
  6. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。
  7. 小心切开腹膜，并将肠管移出腹腔，置于动物左侧，以暴露门静脉。
  8. 将输注装置的套管插入门静脉。建议在显微镜下进行此步骤。
  9. 用30 ml SC1溶液开始肝脏灌注。在启动灌注液流后立即打开下腔静脉....

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讨论

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肝星状细胞调控肝脏内重要的生理和病理生理过程。此外，星状细胞具有抗原呈递特性，使其成为肝脏免疫反应的重要组成部分。尽管肝星状细胞占肝脏总细胞数的10-15%，但由于其定位于窦周间隙（Disse间隙），分离这些细胞具有较大挑战性。

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的简便方法 原位 消化及后续的梯度离心。该方案可分离出高纯度的星状细胞，适用于免疫学检测。

通过考虑肝星状细胞的三个主要特征——星状形态、胞周脂质囊泡中储存维生素A以及GFAP的表达，可以控制分离细胞的纯度。根据这些标准，采用所述方案获得的星状细胞经免疫荧光染色和流式细胞术评估，纯度通常约为99%。星状细胞分离过程中可能的污染物是库普弗细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们通过流式细胞术对星状细胞培养物进行表面分子F4/80（库普弗细胞）和CD11c（DCs）的染色分析。结果显示，未检测到F4/80+和CD11c+细胞，表明星状细胞制备物中不存在库普弗细胞或DCs的污染。因此，无需进一步富集或分选步骤，使得所述肝星状细胞分离方案.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本工作由Smith Family生物医学研究卓越奖和美国国立卫生研究院（NIH）RO1 AI083426-01（F.W.）资助。Patrick Maschmeyer和Melanie Flach获得勃林格殷格翰基金会博士研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70μm 细胞筛BD Biosciences352350
CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3306
胶原酶 PRoche Group11249002001
DMEMGIBCO，由 Life Technologies 生产11960
DNase IRoche Group10104159001
DPBSCellgro21-031-cv
EGTAFluka3777
胎牛血清GIBCO，由 Life Technologies 生产16000
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
梯度离心管Greiner Bio-One163160
HEPESGIBCO，由 Life Technologies 生产15630
KClSigma-AldrichP9541
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
L-谷氨酰胺GIBCO，由 Life Technologies 生产25030
MgCl2·6H2OFluka63068
MgSO4·7H2OSigma-AldrichM2773
Na2HPO4·2H2OFluka71643
NaClSigma-AldrichS3014
NaH2PO4·H2OFluka71507
NaHCO3Fluka71628
NycodenzAccudenz AGAN7050/BLK
青霉素/链霉素GIBCO，由 Life Technologies 生产15140
蠕动泵Cole-ParmerHV-7523-70
酚红Sigma-AldrichP4633
蛋白酶 ECalbiochem7433-2
硅胶管Masterflex (Cole-Parmer)HV-96440-14
丙酮酸钠GIBCO，由 Life Technologies 生产11360
组织培养瓶 (25 cm2)BD Biosciences353108
带翼输液器Terumo Medical Corp.1SV27EL

参考文献

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  1. Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
  2. Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate ....

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标签

Nycodenz Pronase E P GFAP

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