本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外 通过蛋白酶-胶原酶处理后再进行密度梯度离心。该技术可获得高纯度的肝星状细胞。
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摘要
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肝星状细胞是定居于肝脏、具有星形形态的细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的狄氏间隙中1,2。星状细胞来源于骨髓前体细胞，可储存体内高达80%的维生素A1, 2。在活化后，星状细胞可分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。基于其收缩能力，肌成纤维样星状细胞可调节与门静脉高压相关的血管张力4。最近，我们证实肝星状细胞具有强大的抗原呈递功能，能够激活NKT细胞以及传统T淋巴细胞5。
本文介绍一种从小鼠肝脏中高效制备肝星状细胞的方法。由于肝星状细胞位于窦周间隙，其分离过程需分步进行。为了使星状细胞能够从狄氏腔隙中被有效分离，需对小鼠肝脏进行灌流 原位 使用消化酶Pronase E和Collagenase P进行灌注。灌注后，肝组织再经Pronase E和Collagenase P的进一步酶处理 体外随后，该方法利用了肝星状细胞内大量储存维生素A的脂滴这一特性。此特性使得可通过在8% Nycodenz梯度溶液中离心，将星状细胞与其他肝细胞分离开来。本文所述方案可获得纯度高且均一的星状细胞群体。在进行荧光显微镜或流式细胞术分析之前，可通过标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色来评估细胞制备物的纯度。此外，光学显微镜下可观察到肝星状细胞特有的星形形态，并富含大量脂滴。
综上所述，我们提供了一种高效分离肝星状细胞的详细方案，包括肝星状细胞形态特征及GFAP表达的代表性图像，有助于界定肝星状细胞的特性。
方案
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建议使用约20周龄或更年长的C57BL/6小鼠。推荐使用体重为25–30 g的雄性小鼠。在分离星状细胞前2个月，通过给予富含维生素A的饮食可提高星状细胞的得率。从一只C57BL/6小鼠肝脏中可纯化得到约2×105个肝星状细胞，而Balb/c小鼠的星状细胞得率明显更高。以下实验方案适用于5只小鼠。动物饲养与实验操作均依照经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程进行。
1. 原位 小鼠肝脏灌注消化酶
- 将 SC1 缓冲液和酶灌注溶液在 37 ℃ 下预热°C 水浴
- 将带翼输液器安装到蠕动泵的硅胶管上。
- 用 PBS 校准泵，以获得 6.5 ml/min 的层流，该流速将用于后续实验 原位 肝脏灌注。用SC1溶液平衡硅胶管。
- 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）溶液麻醉小鼠，并检测反射消失以确认深度麻醉状态。
- 将小鼠仰卧固定在合适的基座上。
- 使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。
- 小心切开腹膜，并将肠管移出腹腔，置于动物左侧，以暴露门静脉。
- 将输注装置的套管插入门静脉。建议在显微镜下进行此步骤。
- 用30 ml SC1溶液开始肝脏灌注。在启动灌注液流后立即打开下腔静脉。肝脏组织颜色变浅表明肝脏灌注冲洗成功。
- 用30 ml Pronase E溶液灌注肝脏。消化成功后，肝叶会肿胀，肝小叶在被膜下变得清晰可见。
- 用30 ml Collagenase P溶液灌注肝脏。此时肝脏已失去原有形态，呈无张力、无定形状态。
- 小心地将肝脏与膈膜及周围器官分离，并将其置于冰上的70 ml SC2溶液中保存。
- 对其他小鼠重复该操作步骤。
2. 小鼠肝脏的体外消化
所有后续操作步骤均应在超净工作台内的无菌条件下进行。
- 使用锋利的剪刀将肝脏切成约 2x2x2mm3 的小块。
- 将含有肝组织块的 70ml SC2 悬液与 50ml Pronase E-Collagenase P 溶液混合，并加入 1ml DNase I 溶液。
- 在 37°C 下搅拌消化肝脏组织 20 分钟。
3. 密度梯度离心
- 将细胞悬液通过70μm细胞滤网过滤至6个50ml Falcon离心管中，并用SC2缓冲液补至50ml。在4°C条件下，以600g离心10分钟。
- 小心吸除40ml上清液，然后向每管中加入150μl DNase I溶液并重悬细胞。
- 将细胞悬液合并至4个50ml Falcon离心管中，用GBSS-B洗涤，在4°C条件下以600g离心10分钟。
- 小心尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀，向每管中加入150μl DNase I溶液。每管用10ml GBSS-B重悬细胞沉淀。
- 将细胞合并至2个50ml Falcon离心管中，每管加入GBSS-B至总体积为36ml。每管加入14ml Nycodenz溶液，并充分混匀。
- 将10ml细胞悬液转移至一个12ml梯度离心管中，共得到10个离心管。每管轻轻覆盖1.5ml GBSS-B。
- 在4°C条件下以1500g离心15分钟（不启用刹车）。离心后，肝细胞将沉淀于管底，而星状细胞则位于界面层，呈白色环状。
- 小心收集含有星状细胞的界面层，并用GBSS-B洗涤；在4°C条件下以600g离心10分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于20ml DMEM培养基中，该培养基添加有10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES。将细胞以2×104 cells/cm2的密度接种至组织培养瓶中。在37°C、5% CO2条件下培养细胞。
- 一旦肝星状细胞贴壁（约制备后2小时），立即更换培养基，以去除死细胞和细胞碎片。
- 次日，星状细胞应呈现出其特征性的星形形态，并在核周区域含有储存维生素A的脂滴。
- 在后续实验中，肝星状细胞可使用温和的酶溶液（如Accutase）轻松从非包被的塑料表面解离。
4. 代表性结果：
在按照所提供的方案分离肝星状细胞后，可通过该细胞类型的三个主要特征来检测所分离细胞群体的纯度，即星状形态、胞周脂滴以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。以下为细胞分离后2小时以及培养第1天和第3天时肝星状细胞典型形态的代表性图像 体外 图1展示了培养情况。图2显示了细胞分离后培养3天的肝星状细胞中GFAP的代表性免疫荧光染色结果。肝星状细胞在培养过程中会分化为肌成纤维细胞。 体外 培养。这些活化星状细胞的一个典型特征是表达α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin, α-SMA）。αSMA)。图3显示了第7天活化的星状细胞中aSMA和肌球蛋白IIA的免疫荧光染色结果 体外 培养。
图1. 肝星状细胞的典型形态学特征。星状细胞采用所提供的方案从小鼠肝脏中分离。图像显示了细胞分离后2小时（a，b）、以及培养第1天（c）和第3天（d）的星状细胞形态。 体外 培养。肝星状细胞在培养的最初几天内，于核周区域表现出大量脂质囊泡，并逐渐获得其特有的星状形态。 体外 培养（200倍放大）。
图2. 肝星状细胞在肝脏中特异性表达GFAP。在第3天对分离的星状细胞进行免疫荧光染色以检测GFAP（红色） 体外 细胞核呈蓝色（Hoechst 染色）。
图3. 肝星状细胞分化为肌成纤维细胞。从C57BL/6小鼠中分离的肝星状细胞培养7天后，转移至腔室载玻片，并对α-平滑肌肌动蛋白（aSMA，红色显示）和肌球蛋白IIA（绿色显示）进行染色。细胞核用Hoechst复染（蓝色）。
| SC1 缓冲液 | |
| EGTA | 190mg |
| 葡萄糖 | 900mg |
| HEPES | 10 ml 的 1M 储存液 |
| KCl | 400mg |
| Na2HPO4 · 2 H2O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH2PO4 · H2O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| 酚红 | 6mg |
| dH2O | 加水至 1L |
| SC2 缓冲液 | |
| CaCl2 · 2H2O | 560mg |
| HEPES | 10ml 的 1M 储存液 |
| KCl | 400mg |
| Na2HPO4 · 2 H2O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH2PO4 · H2O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| 酚红 | 6mg |
| dH2O | 加水至 1L |
| GBSS-A 缓冲液 | |
| KCl | 370mg |
| CaCl2 · 2H2O | 225mg |
| 葡萄糖 | 991mg |
| KH2PO4 | 30mg |
| MgCl2 · 6 H2O | 210mg |
| MgSO4 · 7 H2O | 70mg |
| Na2HPO4 · 2 H2O | 75mg |
| NaHCO3 | 227mg |
| 酚红 | 6mg |
| dH2O | 加水至 1L |
| GBSS-B 缓冲液 | |
| CaCl2 · 2H2O | 225mg |
| 葡萄糖 | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH2PO4 | 30mg |
| MgCl2 · 6 H2O | 210mg |
| MgSO4 · 7 H2O | 70mg |
| Na2HPO4 · 2 H2O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO3 | 227mg |
| 酚红 | 6mg |
| dH2O | 加水至 1L |
| 蛋白酶 E 灌注液 | |
| 蛋白酶 E | 100mg (4000 PU/mg min) |
| SC2 缓冲液 | 200ml |
| 胶原酶 P 灌注液 | |
| 胶原酶 P | 85mg (1.78 U/mg lyo) |
| SC2 缓冲液 | 200ml |
| 蛋白酶 E-胶原酶 P 混合液 | |
| 蛋白酶 E | 50mg (4000 PU/mg min) |
| 胶原酶 P | 85mg (1.78 U/mg lyo) |
| SC2 缓冲液 | 50ml |
| DNase I 溶液 | |
| DNase I | 6mg (约 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz 溶液 | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
表1：分离肝星状细胞所需的缓冲液和酶溶液。所有缓冲液的pH值应调整至7.3–7.4。此外，建议对所有缓冲液进行无菌过滤。应根据所用酶的活性调整其用量。
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讨论
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肝星状细胞调控肝脏内重要的生理和病理生理过程。此外，星状细胞具有抗原呈递特性，使其成为肝脏免疫反应的重要组成部分。尽管肝星状细胞占肝脏总细胞数的10-15%，但由于其定位于窦周间隙（Disse间隙），分离这些细胞具有较大挑战性。
本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的简便方法 原位 消化及后续的梯度离心。该方案可分离出高纯度的星状细胞，适用于免疫学检测。
通过考虑肝星状细胞的三个主要特征——星状形态、胞周脂质囊泡中储存维生素A以及GFAP的表达，可以控制分离细胞的纯度。根据这些标准，采用所述方案获得的星状细胞经免疫荧光染色和流式细胞术评估，纯度通常约为99%。星状细胞分离过程中可能的污染物是库普弗细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们通过流式细胞术对星状细胞培养物进行表面分子F4/80（库普弗细胞）和CD11c（DCs）的染色分析。结果显示，未检测到F4/80+和CD11c+细胞，表明星状细胞制备物中不存在库普弗细胞或DCs的污染。因此，无需进一步富集或分选步骤，使得所述肝星状细胞分离方案...
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披露
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未声明任何利益冲突。
致谢
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本工作由Smith Family生物医学研究卓越奖和美国国立卫生研究院（NIH）RO1 AI083426-01（F.W.）资助。Patrick Maschmeyer和Melanie Flach获得勃林格殷格翰基金会博士研究生奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 胶原酶 P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| 胎牛血清 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 16000 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| 梯度离心管 | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 15630 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 25030 | |
| MgCl2·6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4·2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4·H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 15140 | |
| 蠕动泵 | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| 蛋白酶 E | Calbiochem | 7433-2 | |
| 硅胶管 | Masterflex (Cole-Parmer) | HV-96440-14 | |
| 丙酮酸钠 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 11360 | |
| 组织培养瓶 (25 cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| 带翼输液器 | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
参考文献
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- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
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