本文描述了一种评估单次跨膜结构域（TMD）寡聚化倾向的高效方法。将TMD与ToxR融合形成的嵌合蛋白在大肠杆菌报告菌株中表达。TMD诱导的寡聚化可导致ToxR二聚化，从而激活转录并产生报告蛋白β-半乳糖苷酶。
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摘要
摘要
将蛋白质跨膜结构域简单地视为磷脂双分子层中锚定点的观点早已被证伪。在许多情况下，跨越膜的蛋白质已经进化出高度复杂的发挥作用机制1-3。膜蛋白调节其结构与功能的方式之一是通过疏水性螺旋之间的直接且特异性的接触，形成具有结构特征的跨膜寡聚体4,5。近年来大量研究聚焦于氨基酸在膜环境与水溶液环境中分布的偏好性差异，以及驱动蛋白质相互结合的不同分子间作用力6,7。然而，针对蛋白质跨膜结构域分子识别的研究仍落后于对水溶性区域的研究。一个主要障碍依然存在：尽管跨膜寡聚化可达到显著的特异性和亲和力8，但对其结合过程的直接测量仍具挑战性。传统用于研究整合膜蛋白功能的方法可能受限于待测序列本身固有的不溶性。通过对代表跨膜结构域的合成肽段进行研究，所获得的生物物理信息可提供有用的结构见解。然而，这些研究中常使用的去垢剂胶束或脂质体系统在多大程度上能真实模拟细胞膜环境仍常受质疑：肽段在这些条件下是否采取类似天然的结构？其功能行为是否真正反映了在天然膜中的作用模式？为了在天然磷脂双分子层中研究跨膜序列之间的相互作用，Langosch 实验室开发了 ToxR 转录报告基因检测方法9。目标跨膜结构域被表达为一种嵌合蛋白，其中包含麦芽糖结合蛋白以定位至周质空间，以及 ToxR 用于报告寡聚化水平（图1）。
近十年来，其他多个研究团队（例如 Engelman、DeGrado、Shai）进一步优化并应用了这种 ToxR 报告基因检测方法10-13。各类 ToxR 检测方法现已成为检测细胞膜中蛋白质-蛋白质相互作用的金标准。本文中，我们展示了一项在本实验室常规开展的实验操作，该操作主要遵循 Langosch 所建立的实验方案。这一通用方法可用于分析大肠杆菌（E. coli）中跨膜区（TMD）的自关联特性，其中通过检测 β-半乳糖苷酶的生成量来评估 TMD 的寡聚化倾向。当 TMD 介导 ToxR 发生二聚化时，ToxR 会结合到 ctx 启动子区域，从而上调 LacZ 基因表达，促进 β-半乳糖苷酶的产生。通过向裂解的细胞中加入 ONPG，可获得比色检测信号。β-半乳糖苷酶催化水解 ONPG，生成具有光吸收特性的产物邻硝基苯酚盐（o-nitrophenolate, ONP）（图 2）。
方案
1. 克隆注意事项
- 代表目标跨膜区（TMD）的商业化合成寡核苷酸，其两端带有 NheI 和 BamHI 限制性酶切位点，并进行 5'-磷酸化修饰，可连接至经 BamHI 和 NheI 依次消化的 pTox7 载体中（该载体由本实验室改造，在 BamHI 限制性酶切位点后插入了一个碱基对14）（图 3）。以下为一个寡核苷酸示例：
5'ctagcTMD序列g3'
3' gTMD序列cctag5'
跨膜区（TMD）序列长度应为12-24个残基（较短序列可能会被载体编码的疏水性残基延长）。为了研究界面相互作用，应构建四种TMD设计变体，通过依次插入残基并同时删除相应残基，使TMD相对于ToxR发生旋转15,16。最后，应将阿拉伯糖浓度在0.001%至0.01%（w/v）之间进行调整，以确定不同TMD序列间β-半乳糖苷酶信号差异最大的浓度；建议测试不同的表达水平，以明确能够最好地区分不同亲和力的实验条件。除阿拉伯糖和抗生素外，还可使用0.4 mM IPTG以增强不同TMD之间亲和力的差异。ToxR检测应至少设置四个重复。整个实验流程应使用不同的质粒转化至少重复三次。
2. 细菌培养物的培养
- 将 FHK12 感受态细胞（200 μl）在冰上轻轻解冻，并转移至 15 ml 培养管中。加入质粒 DNA（200 ng），冰上孵育 30 分钟。
- 在 42 °C 下热激 90 秒，随后立即冰上孵育 2 分钟。
- 加入 SOC 培养基（800 μl），在 37 °C 摇床（300 rpm）中孵育 1 小时。
- 取 50 μl 转化混合物，分别接种至含氯霉素（30 μg/ml）和阿拉伯糖（0.0025% w/v）的 5 ml LB 培养基中，每组设三个重复，置于 15 ml 培养管中。在 37 °C 摇床（300 rpm）中孵育 20 小时。（也可取 5 μl 菌液接种于 96 孔板中的 100 μl 培养基中。当处理大量样品时，此方法较为适用，但误差略高。为避免蒸发导致误差，需在最外圈孔中加入培养基但不用于样品检测。最后，用封口膜将板盖与板体连接处双层包裹密封）。
3. β-半乳糖苷酶活性的测定
- 将酶标仪预热至 28 °C。
- 使用大口径移液枪头将 Z 缓冲液转移至储液槽中，注意仅吸取上层（水相）液体。向 96 孔板的各孔中加入 100 μl 新鲜配制的 Z 缓冲液/氯仿。将每种菌液各 5 μl 以四复孔形式加入孔板中。留出四个孔不加菌液作为空白对照。
- 测定孔板在 OD595 处的吸光值，以确定细胞密度。
- 向孔板所有孔中加入 50 μl Z 缓冲液/SDS。将孔板放入酶标仪中振荡 10 分钟以裂解细胞。确保裂解后细胞悬液澄清，若未完全裂解则需重复振荡步骤。裂解不完全提示 Z 缓冲液/氯仿未新鲜配制。
- 向所有孔中加入 50 μl 新鲜配制的 Z 缓冲液/ONPG，将孔板放回酶标仪，每 30 秒测定一次 OD405，持续 20 分钟。
- 使用以下公式计算 β-半乳糖苷酶活性（注意扣除空白值）。应使用线性模型拟合，在 OD405 值范围为 0.0 至 1.0 内的所有数据点计算 OD405/分钟的比值。
米勒单位在不同日期测定时可能存在差异。因此，每次实验均应同时检测一个参考构建体（如 GpA），其测定值可用于对 ToxR 的数值进行归一化处理。
4. 蛋白质表达的对照
- 通过 Western 印迹验证不同构建体之间的蛋白质表达是否均一。取三份培养物各 50 μl 混合，于微量离心机中离心（2000 rpm，4 分钟）。用移液器吸除上清液，将残留的沉淀重悬于 2 x 上样缓冲液中。
- 每泳道上样 7.5 μl，使用标准 8% 凝胶在 125 V 条件下电泳 1 小时 5 分钟。转膜后，用 HRP 标记的抗 MBP 抗体孵育并显影；嵌合蛋白大小约为 70 kDa，有时在 48 kDa 处可见少量降解产物。内源性 MBP 在 45 kDa 处也可被检测到（见图 5）。
5. 质控膜的正确插入
使用麦芽糖结合蛋白缺陷型细胞系来评估嵌合跨膜区构建体的正确膜插入。当在以麦芽糖为唯一碳源的最低培养基中培养时，只有表达出麦芽糖结合蛋白正确定位于周质空间的膜整合表达产物的细胞才能生长。
- 转化PD28细胞（方法同FHK12细胞），接种至2 ml LB培养基中。于37 °C、300 rpm振荡条件下过夜培养。
- 在4 °C条件下，以3500 rpm离心10分钟收集细胞，用PBS（2 ml）通过大口径枪头轻柔吹打或轻微涡旋重悬洗涤。重复上述离心步骤，再次用PBS洗涤一次，离心后最终重悬于PBS（1 ml）中。
- 取25 μl重悬的细胞接种至5 ml最小培养基中，设三个重复，于37 °C、300 rpm振荡培养。在培养15–25小时期间，每隔约2小时取样，将每份样品200 μl转移至96孔板，使用酶标仪测定OD595值。
6. 代表性结果：
图4展示了使用ToxR转录报告基因检测法分析跨膜区段寡聚化倾向的示例。此前，我们已采用包括ToxR在内的多种技术研究了多跨膜整合蛋白潜伏膜蛋白-1（LMP-1）跨膜区段的寡聚化特性14。结果显示，第五个跨膜区（TM5）具有强烈的寡聚化倾向，其米勒单位值较高，与阳性对照GpA（一种公认的二聚化序列）相当。TM5中的有害突变D150A会降低该序列的寡聚化能力。LMP-1的TM1区段未表现出显著的寡聚化，其米勒单位信号非常低，仅略高于空白非转化FHK12细胞的信号。
图1. ToxR报告基因检测示意图。跨膜区（TMD）介导的寡聚化导致ToxR二聚化，从而激活LacZ的转录。通过定量LacZ基因产物β-半乳糖苷酶的活性，可反映TMD发生寡聚化的倾向性。
图2. β-半乳糖苷酶对ONPG的水解裂解反应生成具有光吸收特性的产物o-硝基苯酚根离子（ONP）。
图 3. pToxR7 质粒图谱。
图4. 代表性ToxR转录报告基因实验，用于分析潜伏膜蛋白-1跨膜区的寡聚化倾向。跨膜区5（TM5）表现出强烈的寡聚化能力，而跨膜区1（TM1）仅显示微弱的相互作用。TM5中的D150A突变显著降低了其寡聚化能力。GpA作为强二聚化阳性对照序列包含在内。空白对照代表未转染的FHK12细胞。
图5. 蛋白质表达的Western印迹分析。
图6. PD28互补实验用于验证蛋白是否正确插入至周质空间。阴性对照为缺乏麦芽糖结合蛋白的构建体。
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讨论
ToxR 转录报告基因检测是一种简便的方法，可用于鉴定具有寡聚化潜力的跨膜序列。由于这些相互作用发生在细菌内膜中，该检测方法避免了在膜模拟环境中研究系统时所面临的有效性问题。鉴于可并行地将多个跨膜区（TMD）克隆至单个质粒中，并且整个检测可在96孔板中进行，因此该方法适用于对大量蛋白质序列进行高通量分析17。一旦检测到相互作用，便可利用突变分析进一步探究关键功能残基，从而解析参与该过程的结构特征。在许多情况下，跨膜蛋白的晶体学分析存在困难，因而需要诸如ToxR检测等替代工具来阐明其功能的分子基础。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢美国国立卫生研究院（1R21CA138373）和“联合抗击癌症”（Stand Up to Cancer，SU2C）对本研究工作的资金支持。H.Y. 感谢美国癌症研究协会授予的2009年Elion奖、西德尼·基梅尔癌症研究基金会（SKF-08-101）授予的基梅尔学者奖，以及美国国家科学基金会教师早期职业奖（NSF0954819）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BamHI 限制性内切酶 | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen 酶的效率高于其他供应商 |
| NheI 限制性内切酶 | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen 酶的效率高于其他供应商 |
| 15 mL 培养管 | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC培养基 | TEKnova, Inc. | S0225 | 加至适当体积，经高压灭菌。 |
| LB培养基 | Sigma-Aldrich | L7275 | 加水至适当体积，经高压灭菌。 |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | CO378 | 30 mg/mL 乙醇储存液，保存于冷冻柜中 |
| 阿拉伯糖 | Fluka | 10839 | 2.5%（w/v）水溶液储备液，储存于冷冻室 |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker 公司 | 6858-06 | |
| MgSO₄4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-硝基苯基 β邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG） | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z缓冲区 | 16.1 g Na2HPO4 5.5 g NaH2PO4 0.75 g KCl 0.246 g MgSO₄4 加水定容至 1 L，pH 7.0 | ||
| Z缓冲液/氯仿 | 200 mL β-巯基–乙醇，2 mL 氯仿，用 Z 缓冲液定容至 20 mL。涡旋混匀 1 分钟，以 800 rpm 离心 1 分钟。每块平板现配现用。 | ||
| Z缓冲液/SDS | 160 mg SDS 溶于 10 mL Z 缓冲液中 | ||
| Z缓冲液/ONPG | 10 mL Z缓冲液中加入40 mg ONPG，每次实验前新鲜配制 | ||
| β-巯基–乙醇 | Calbiochem | 444203 | |
| 抗MBP单克隆抗体（HRP偶联） | 新英格兰生物实验室 | E8038S | |
| 含麦芽糖的最低限度培养基 | 1 × M9 盐溶液，0.4% 麦芽糖，1 mg/mL 硫胺素，2 mM MgSO₄4 | ||
| 96孔平底板 | Sarstedt有限公司 | 83.1835.300 | |
| 酶标仪 | Beckman Coulter Inc. | DTX880 多功能检测仪 | |
| 水浴锅 | VWR 国际 | 89032-204 | |
| 摇床培养箱 | 福尔马科学 |
参考文献
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