细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验可用于检测自身反应性应答，并在体外研究细胞死亡机制。然而，结合活细胞共聚焦显微镜成像技术与荧光染料，可更详细地研究细胞死亡的类型、动力学特征以及所涉及的信号通路。
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摘要
摘要
1型糖尿病（T1D）是一种由T细胞介导的自身免疫性疾病。在疾病发生过程中，随着胰岛素分泌逐渐减少，患者最终出现胰岛素缺乏，这可能是由于T细胞破坏了胰腺β细胞所致。了解T1D发展过程中β细胞死亡的机制，将有助于开发出有效的治疗方法。细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验 traditionally 采用放射性同位素铬-51（51Cr）标记靶细胞。随后将这些标记的靶细胞与效应细胞共孵育，通过检测靶细胞释放的51Cr量来判断淋巴细胞介导的细胞死亡程度。细胞死亡抑制剂会降低51Cr的释放。
作为效应细胞，我们使用了一种来自转基因小鼠品系的活化自身反应性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）克隆群体，该小鼠品系同时转染了AI4 T细胞受体（TCR）的α链和β链。将活化的AI4 T细胞与51Cr标记的靶NIT细胞共培养16小时，通过检测51Cr的释放量来计算特异性裂解率。
线粒体参与多种重要的生理过程，如能量生成、信号转导调控以及细胞凋亡。在1型糖尿病（T1D）发展过程中，β细胞线粒体功能变化的研究是一个新兴的研究领域。利用线粒体膜电位染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM）以及共聚焦显微镜活细胞成像技术，我们对NIT-1 β细胞系的线粒体膜电位随时间的变化进行了监测。在成像实验中，效应T细胞AI4用荧光核染料Picogreen进行标记。将NIT-1细胞与T细胞共同培养于带腔室的盖玻片中，并置于配备活细胞培养室的显微镜载物台上，培养条件控制为37°C、5% CO2并保持湿润。在实验过程中，每3分钟对每个细胞簇采集一次图像，持续400分钟。
在400分钟的过程中，我们观察到与AI4 T细胞结合的NIT-1细胞簇中线粒体膜电位的消散。在同时进行的对照实验中，NIT-1细胞与MHC不匹配的人淋巴细胞Jurkat细胞共培养，线粒体膜电位保持完整。该技术可用于观察细胞在细胞毒性淋巴细胞、细胞因子或其他细胞毒性试剂攻击下线粒体膜电位的实时变化。
方案
1. 细胞的制备
- 靶细胞培养：小鼠β细胞系NIT-1和NIT-4的培养方法此前已有描述1,2，使用添加10% FBS、0.02% BSA、非必需氨基酸、15 mM HEPES、16.5 mM葡萄糖以及青霉素/链霉素的DMEM培养基。进行51Cr标记时，将细胞以每孔5×104个细胞的密度接种于平底96孔培养板中，每孔加入200 μl培养基。进行显微镜实验时，将细胞以每室5×104个细胞的密度接种于8孔Lab-Tek II腔室载玻片中，每室加入500 μl培养基，培养48小时后用于细胞毒性实验。
- 对照T细胞系培养：使用Jurkat细胞系（ATCC，CD3+人淋巴细胞细胞系）作为阴性对照。Jurkat细胞在RPMI1640培养基中培养，培养基中添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、10 mM HEPES和1.0 mM丙酮酸钠。
2. 效应性自身反应性CD8+ T细胞的收集与激活
NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] 和 NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] 购自杰克逊实验室（缅因州巴港），并在本单位小鼠饲养设施中繁育。NOD-AI4a 与 NOD-AI4b 杂交产生的 F1 杂合子后代 [NOD-AI4a/b] 在 3 至 5 周龄时发生糖尿病。所有小鼠均饲养于特定病原体阴性设施中，并经相关机构动物护理与使用委员会批准。
- 使用 CO2 处死 3-4 周龄的 NOD-AI4a/b 小鼠。
- 从小鼠中收集脾脏。用乙醇喷雾处理已处死的小鼠，并在手术罩下打开腹腔。立即取出脾脏并置于冰上预冷的 HBSS 缓冲液中。
- 使用 7 mL 玻璃匀浆器收集脾细胞。每次将 2 至 3 个脾脏放入 5 mL 冷 HBSS 中，用 7 mL 玻璃匀浆器进行匀浆。收集匀浆液，在 4°C 条件下使用 Sorvall RT7+ 离心机以 1200 rpm 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
- 使用低渗溶液处理去除红细胞。将沉淀物按每脾脏 5 mL 低渗溶液在冰上处理 5 分钟，然后加入等体积 HBSS 中和。按上述方法离心收集细胞，重悬于 50 mL HBSS 中。将细胞悬液通过细胞筛过滤，并使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上进行细胞计数。
- 激活细胞。将细胞重悬至浓度为 5×106/mL，在 RPMI1640 培养基（添加 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠、10 mM HEPES 和 1.0 mM 丙酮酸钠）中加入 0.1 μM AI4 模拟表位肽（氨基酸序列 YFIENYLEL）和 25 U/mL IL-2，进行为期 3 天的培养以激活细胞。
3. 51Cr 释放实验检测细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞杀伤
- 标记靶细胞：在靶细胞中加入 51Cr，每孔 1 μCi，培养 3 小时，用培养基洗涤 3 次。
- 将效应细胞悬浮于 RPMI 1640 培养基中（如步骤 2.5 所述），使每孔最终加入体积为 200 μl。
- 标记靶细胞最后一次洗涤后，按所需的效应细胞与靶细胞（E:T）比例，将活化的效应细胞加入靶细胞培养物中。我们通常使用的 E:T 比例为 0.4:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1 和 50:1。
- 向 6 孔靶细胞中加入新鲜的改良 RPMI 1640 培养基（见步骤 2.5），作为自发裂解对照。
- 将效应细胞与靶细胞共培养 16 小时。
- 收集上清液至 6×50 mm 的青霉素玻璃管中。
- 通过加入 100 μl 2% SDS 并轻轻吹打数次，裂解细胞。
- 将细胞裂解液收集至另一组 6×50 mm 青霉素玻璃管中。
- 用洁净的 H2O 洗涤孔板一次，并将洗涤液加入细胞裂解液管中。
- 使用γ计数器测定上清液和细胞裂解液的放射性。
- 按下式计算特异性裂解率：
4. 活细胞成像的细胞染色
在常用的线粒体膜电位染料中，TMRM 的线粒体毒性最低。3 因此，我们选择 TMRM 用于这些活细胞成像研究。
- 用DMSO配制40 mM的TMRM储备液，于-20°C保存。使用不含酚红的DMEM培养基（含NIT-1细胞培养所需的所有补充成分）将储备液新鲜稀释至[25 nM]工作浓度1。
- 用25 nM TMRM在37°C孵育目标NIT-1细胞30分钟进行染色。
- 更换为含有5 nM TMRM的新鲜培养基，以维持染料的平衡分布4。
- 使用血细胞计数板对活化的效应型AI4 T细胞进行计数。
- 在室温下用1 μl/mL Picogreen染色活化的效应型AI4 T细胞5分钟，随后用不含酚红的培养基洗涤3次。
5. 使用活细胞成像评估T淋巴细胞介导的β细胞死亡
- 将带有染色NIT细胞的腔室盖玻片安装在Zeiss LSM 510共聚焦显微镜的载物台上。使用Dremel工具移除标签，并用环氧乙烷对腔室玻片进行气体灭菌。载物台配备活细胞成像室，可控制温度为37°C、5% CO2并保持湿度。
- 以不同的效应细胞与靶细胞（E:T）比例，将活化的染色T细胞加入指定的腔室中。
- 将相同数量的染色Jurkat细胞加入对照腔室中。
6. 获取活细胞图像
显微镜配备了一个电动载物台，使我们能够在实验的时间过程中，自动地从相同或不同的腔室中不同位置重复采集图像。
- 使用63倍油镜物镜，以每3分钟一次的时间间隔采集图像，每个位置共采集300帧。
- 采用543 nm激发波长和565-619 nm发射滤光片组检测TMRM染色。
- 采用488 nm激发光和500-630 nm发射滤光片组检测Picogreen染色。视频使用Zeiss LSM软件生成。
7. 发表用视频转换
- 使用 Zeiss LSM 软件创建一个未压缩的 AVI 格式电影文件。
- 为将视频转换为已发表的格式，请使用 LOCI 的 Bioformats 插件（http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats）将视频导入 FIJI 软件包（http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji），该软件包是 ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）的一个发行版本。
- 调整亮度和对比度设置，以平衡绿色和红色信号，并通过动画选项菜单将帧率设置为每秒 2 帧。
- 将视频裁剪为 512 × 512 像素，并导出为未压缩的 AVI 文件。
- 在 Quicktime 7 软件（Apple computer，Cupertino，CA）中打开该 AVI 文件，并以 1200 kbs/秒的码率压缩并导出为开放视频文件格式 H264/MPEG-4。
8. 代表性结果：
- 51Cr CML 实验的代表性结果。图1展示了一项CML实验的代表性结果，其中特异性裂解百分比（Y轴）随着效应细胞与靶细胞比例（X轴）的增加而上升。靶细胞为从免疫缺陷型NOD.Rag1-/-小鼠中分离得到的原代胰岛细胞，并用51Cr标记。效应细胞为来自NOD.AI4α/β转基因小鼠的脾细胞，其分离与活化步骤如上文步骤2所述。靶细胞与效应细胞共培养16小时。特异性裂解百分比的计算方法如上文步骤3.11所述。
- 两项T细胞介导的β细胞线粒体膜电位耗散的代表性结果（阳性与阴性）展示如下。细胞染色与反应记录步骤如上文步骤4、5和6所述，视频文件的生成方法如步骤7所述。视频1：小鼠β细胞系NIT-1使用线粒体膜电位染料TMRM（红色）进行染色。经活化的自身反应性CD8+ T细胞AI4（用Picogreen染成绿色）与这些NIT-1细胞以50:1的效靶比进行共培养。在400分钟的观察期间，NIT-1细胞的线粒体膜电位仅在与AI4 T细胞相互作用的细胞簇中逐渐耗散。 视频2：作为对照实验，NIT-1细胞经TMRM染色后，与经Picogreen染色的人源Jurkat细胞以50:1的效靶比共培养。Jurkat细胞是一种MHC不匹配的人T细胞系。在整个400分钟共孵育期间，NIT-1细胞维持了稳定的线粒体膜电位。Jurkat细胞未与NIT-1细胞簇发生相互作用，因此不诱导杀伤效应。
图1. 使用来自免疫缺陷型 NOD.Rag1-/- 小鼠的原代胰岛细胞作为靶细胞，以及来自 NOD.AI4α/β 转基因小鼠的脾细胞作为效应细胞进行细胞毒性T淋巴细胞实验（CML）的代表性结果。靶细胞与效应细胞共培养16小时。随着效应细胞与靶细胞比例的增加，特异性裂解百分比也随之升高。
视频 1. 小鼠胰岛β细胞系 NIT-1 用线粒体膜电位染料 TMRM（红色）染色。用 Picogreen（绿色）标记的活化自身反应性 CD8+ T 细胞 AI4 与这些 NIT-1 细胞以 50:1 的效靶比进行共培养。在 400 分钟的观察期间，NIT-1 细胞的线粒体膜电位逐渐丧失，但仅发生在与绿色 AI4 T 细胞相互作用的细胞簇中。点击此处观看视频。
视频 2. NIT-1 细胞的染色方法与视频 1 中所述相同，并与经 Picogreen 染色的人 T 细胞系 Jurkat 共培养。NIT-1 细胞在整个 400 分钟的观察期间均能维持线粒体膜电位。Jurkat 细胞未与 NIT-1 细胞簇发生相互作用，因此未诱导杀伤效应。点击此处观看视频。
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讨论
细胞毒性T细胞介导的β细胞死亡是1型糖尿病（T1D）的主要病理生理机制5。利用51Cr释放的细胞介导的细胞毒性（CML）实验可使我们研究效应细胞与靶细胞反应的程度6。然而，T细胞介导的β细胞死亡的具体过程和通路仍不完全清楚。由于线粒体对β细胞的功能和死亡至关重要7，我们重点关注了在可视化CML过程中线粒体的变化。线粒体膜电位的消散是线粒体功能改变并最终导致细胞凋亡过程中的早期且不可逆的步骤8。通过共聚焦显微镜活细胞成像，我们能够可视化自反应性T淋巴细胞与β细胞相互作用过程中β细胞线粒体膜电位的消散。该实验设置至少部分模拟了T1D发生过程中β细胞所经历的变化。本实验的局限性包括：我们所使用的蔡司显微镜配备的活细胞成像加热装置专为3.5 cm的培养皿设计，因此当使用8孔Lab-Tek II腔室载玻片（用于同时记录处理组和对照组）时，必须移除腔室载玻片的手柄才能将其放入显微镜的加热装置中。此外，由于加热装置是为35 mm培养皿设计的，在使用8孔Lab-Tek II腔室载玻片时，我们只能使用中央的4个孔。这一限制可通过安装蔡司专为Lab...
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披露
动物实验按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院DK074656和AI56374（CEM）以及青少年糖尿病研究基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| 四甲基罗丹明甲酯（TMRM） | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4模拟表位 | mimotopes.com | 氨基酸序列：YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM非必需氨基酸 | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| 青霉素/链霉素 | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| 无酚红DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | 保持无菌用于细胞培养 |
| 生物安全柜 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| 一次性培养管，6x50 mm 绿色玻璃 | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| γ计数器 | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 自动γ计数器 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | 配备电动载物台和活细胞培养室 |
| 移液器（1ml、200μl、20μl、10μl、2μl） | Eppendorf | ||
| 棕色管 | Fisher Scientific | 50819772 | |
| 离心机 | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 267110 | |
| 正置显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ 小鼠 | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ 小鼠 | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 小鼠 | N/A | N/A | 在中国台湾大学动物设施中繁育 |
参考文献
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