细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验可用于检测自身反应性应答，并在体外研究细胞死亡机制。然而，结合活细胞共聚焦显微镜成像技术与荧光染料，可更详细地研究细胞死亡的类型、动力学特征以及所涉及的信号通路。
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摘要
摘要
1型糖尿病（T1D）是一种由T细胞介导的自身免疫性疾病。在疾病发生过程中，随着胰岛素分泌逐渐减少，患者最终出现胰岛素缺乏，这可能是由于T细胞破坏了胰腺β细胞所致。了解T1D发展过程中β细胞死亡的机制，将有助于开发出有效的治疗方法。细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验 traditionally 采用放射性同位素铬-51（51Cr）标记靶细胞。随后将这些标记的靶细胞与效应细胞共孵育，通过检测靶细胞释放的51Cr量来判断淋巴细胞介导的细胞死亡程度。细胞死亡抑制剂会降低51Cr的释放。
作为效应细胞，我们使用了一种来自转基因小鼠品系的活化自身反应性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）克隆群体，该小鼠品系同时转染了AI4 T细胞受体（TCR）的α链和β链。将活化的AI4 T细胞与51Cr标记的靶NIT细胞共培养16小时，通过检测51Cr的释放量来计算特异性裂解率。
线粒体参与多种重要的生理过程，如能量生成、信号转导调控以及细胞凋亡。在1型糖尿病（T1D）发展过程中，β细胞线粒体功能变化的研究是一个新兴的研究领域。利用线粒体膜电位染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM）以及共聚焦显微镜活细胞成像技术，我们对NIT-1 β细胞系的线粒体膜电位随时间的变化进行了监测。在成像实验中，效应T细胞AI4用荧光核染料Picogreen进行标记。将NIT-1细胞与T细胞共同培养于带腔室的盖玻片中，并置于配备活细胞培养室的显微镜载物台上，培养条件控制为37°C、5% CO2并保持湿润。在实验过程中，每3分钟对每个细胞簇采集一次图像，持续400分钟。
在400分钟的过程中，我们观察到与AI4 T细胞结合的NIT-1细胞簇中线粒体膜电位的消散。在同时进行的对照实验中，NIT-1细胞与MHC不匹配的人淋巴细胞Jurkat细胞共培养，线粒体膜电位保持完整。该技术可用于观察细胞在细胞毒性淋巴细胞、细胞因子或其他细胞毒性试剂攻击下线粒体膜电位的实时变化。
方案
1. 细胞的制备
- 靶细胞培养：小鼠β细胞系NIT-1和NIT-4的培养方法此前已有描述1,2，使用添加10% FBS、0.02% BSA、非必需氨基酸、15 mM HEPES、16.5 mM葡萄糖以及青霉素/链霉素的DMEM培养基。进行51Cr标记时，将细胞以每孔5×104个细胞的密度接种于平底96孔培养板中，每孔加入200 μl培养基。进行显微镜实验时，将细胞以每室5×104个细胞的密度接种于8孔Lab-Tek II腔室载玻片中，每室加入500 μl培养基，培养48小时后用于细胞毒性实验。
- 对照T细胞系培养：使用Jurkat细胞系（ATCC，CD3+人淋巴细胞细胞系）作为阴性对照。Jurkat细胞在RPMI1640培养基中培养，培养基中添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、10 mM HEPES和1.0 mM丙酮酸钠。
2. 效应性自身反应性CD8+ T细胞的收集与激活
NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] 和 NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(....
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讨论
细胞毒性T细胞介导的β细胞死亡是1型糖尿病（T1D）的主要病理生理机制5。利用51Cr释放的细胞介导的细胞毒性（CML）实验可使我们研究效应细胞与靶细胞反应的程度6。然而，T细胞介导的β细胞死亡的具体过程和通路仍不完全清楚。由于线粒体对β细胞的功能和死亡至关重要7，我们重点关注了在可视化CML过程中线粒体的变化。线粒体膜电位的消散是线粒体功能改变并最终导致细胞凋亡过程中的早期且不可逆的步骤8。通过共聚焦显微镜活细胞成像，我们能够可视化自反应性T淋巴细胞与β细胞相互作用过程中β细胞线粒体膜电位的消散。该实验设置至少部分模拟了T1D发生过程中β细胞所经历的变化。本实验的局限性包括：我们所使用的蔡司显微镜配备的活细胞成像加热装置专为3.5 cm的培养皿设计，因此当使用8孔Lab-Tek II腔室载玻片（用于同时记录处理组和对照组）时，必须移除腔室载玻片的手柄才能将其放入显微镜的加热装置中。此外，由于加热装置是为35 mm培养皿设计的，在使用8孔Lab-Tek II腔室载玻片时，我们只能使用中央的4个孔。这一限制可通过安装蔡司专为Lab.......
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披露
动物实验按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院DK074656和AI56374（CEM）以及青少年糖尿病研究基金会的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| 四甲基罗丹明甲酯（TMRM） | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4模拟表位 | mimotopes.com | 氨基酸序列：YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM非必需氨基酸 | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| 青霉素/链霉素 | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| 无酚红DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | 保持无菌用于细胞培养 |
| 生物安全柜 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| 一次性培养管，6x50 mm 绿色玻璃 | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| γ计数器 | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 自动γ计数器 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | 配备电动载物台和活细胞培养室 |
| 移液器（1ml、200μl、20μl、10μl、2μl） | Eppendorf | ||
| 棕色管 | Fisher Scientific | 50819772 | |
| 离心机 | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 267110 | |
| 正置显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ 小鼠 | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ 小鼠 | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 小鼠 | N/A | N/A | 在中国台湾大学动物设施中繁育 |
参考文献
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
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