一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。
本文内容
摘要
摘要
病毒性感染可导致异基因造血干细胞移植（HSCT）受者出现发病率和死亡率。我们及其他研究者已成功利用单核细胞以及经腺病毒载体基因修饰的EB病毒转化的淋巴母细胞样细胞（EBV-LCL）作为抗原呈递细胞（APCs），生成并输注针对EB病毒（EBV）、巨细胞病毒（CMV）和腺病毒（Adv）的特异性T细胞。低至每公斤体重2×105的三病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在输注后可扩增数个数量级，并显示出可预防和治疗其他现有疗法难以控制的严重病毒感染。然而，这一具有前景的方法的大范围应用受到高生产成本、制备工艺复杂以及制备周期长（EBV-LCL生成需4–6周，CTL制备需4–8周，总计10–14周）的限制。为克服这些局限，我们开发了一种新的符合GMP标准的CTL制备方案。首先，我们采用经核转染编码EBV抗原LMP2、EBNA1和BZLF1，Adv抗原Hexon和Penton，以及CMV抗原pp65和IE1的DNA质粒的树突状细胞（DCs）作为抗原呈递细胞，替代腺病毒载体刺激T细胞。这些APC能够重新激活针对所有刺激抗原的特异性T细胞。其次，在含有IL-4（1,000 U/ml）和IL-7（10 ng/ml）的培养体系中培养活化的T细胞，可增加并维持T细胞系中特异性T细胞的多样性及频率。第三，我们采用了一种新型透气性培养装置（G-Rex），可在单次刺激后促进大量细胞的扩增与存活，从而无需使用EBV-LCL，并减少技术人员的干预。通过实施这些改进，我们现在可在仅10天内生产出靶向EBV、CMV和Adv的多特异性CTL，每106个细胞的生产成本降低>90%，且该方法可进一步拓展至其他具有保护性的病毒抗原。我们经美国FDA批准的方法，有望用于高风险异基因HSCT受者的预防和治疗。
方案
1. 树突状细胞核转染
- 通过轻柔吹打重悬，收获经塑料贴壁法富集、并在含IL4（1000 U/ml）、GMCSF（800 IU/ml）的Cell Genix培养基中培养5天后，再使用DC成熟细胞因子IL4（1000 U/ml）、GMCSF（800 IU/ml）、IL6（100 ng/ml）、TNF-α（10 ng/ml）、IL1-β（10 ng/ml）和PGE2（1 μg/ml）进一步成熟24小时的单核细胞来源树突状细胞（DC）1。
- 用台盼蓝计数活细胞，将细胞分装至3个15 ml离心管中，每管细胞数不少于0.5×106，不超过2×106个细胞。
- 以200g离心10分钟。在此期间，将添加了DC成熟细胞因子的Cell Genix培养基（DC成熟培养基）预热：在12孔组织培养板的三个孔中每孔加入2 ml，置于37°C、5% CO2培养箱中。
- 离心结束后，吸除上清液，并向各离心管中加入相应的DNA质粒，使终浓度为每管5 μg DNA。具体为：在1号管中加入编码IE1-pp65的质粒，2号管中加入Hexon-Penton质粒，3号管中加入EBNA1-LMP2-BZLF1质粒。
- 用100 μl Amaxa核转染溶液重悬细胞与DNA，充分混匀后转移至核转染杯中。
- 将核转染杯放入4D核转染仪中，选择程序CB150（Amaxa/Lonza），按下启动键。
- 核转染完成后立即向核转染杯中加入500 μl预热的2 ml Cell Genix DC成熟培养基，用移液器轻柔吹打2–3次混匀，然后将转染后的DC转移至已准备好的12孔板中（孔中含剩余的1.5 ml预热DC成熟培养基），放入37°C、5% CO2培养箱继续培养12–18小时。
2. T细胞刺激
- 收集并计数核转染后的树突状细胞（DCs），以30Gy剂量进行照射。用10ml CTL培养基（45% RPMI，45% Clicks EHAA，10% FBS，2mM Glutamax）洗涤一次，并重悬于CTL培养基中，浓度为每毫升含3 × 105个DCs。
- 混合至少7.5×105（2.5ml）至最多15×105（5ml）含有各质粒的DCs，并将混合后的DCs转移至G-Rex装置中，随后将装置放入培养箱。
- 制备受体细胞时，可使用先前冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）或DC筛选后剩余的非贴壁单个核细胞（通过贴壁法或CD14筛选获得）。将细胞解冻后转移至预温的培养基中，用CTL培养基洗涤一次，再用CTL培养基重悬细胞，计数后调整细胞浓度至每毫升含2×106个细胞。取15×106个细胞（或7.5ml），加入30000U IL-4（终浓度1000U/ml）和300ng IL-7（终浓度10ng/ml）。
- 将7.5ml PBMCs（含15×106个细胞）转移至G-Rex装置中，并用CTL培养基补足体积至30ml。
- 将G-Rex装置置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养6–7天。
3. T细胞扩增
- 在第6-7天，吸出10 ml培养基，然后用10 ml移液管将剩余20 ml培养基中的细胞混匀，使用台盼蓝计数活细胞。若细胞数量<50×106，则补充新鲜培养基加细胞因子；若细胞数量>50×106，则移除10 ml细胞悬液，转移至新的G-Rex培养瓶中，随后向两个G-Rex培养瓶中均加入新鲜CTL培养基加细胞因子进行换液。
- 继续培养额外4-6天。当细胞扩增达到足够数量后，对CTL细胞进行表型和功能鉴定，并将多余细胞冻存以供后续使用。
4. 典型结果：
我们经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）制备流程示意图如下所示 图1。 与传统的多病毒CTL方案使用腺病毒载体和EBV-LCL刺激病毒特异性T细胞相比2 我们已用编码各病毒多种抗原的DNA质粒替代了传染性病毒材料3为刺激三病毒特异性CTL，我们设计了三种多顺反子质粒，分别编码腺病毒的Hexon和Penton、CMV的IE1和pp65，以及EBV的EBNA1、LMP2和BZLF1。选择这些抗原的依据来自我们团队及其他研究团队的临床结果，这些结果表明靶向腺病毒Hexon和Penton的T细胞具有良好的免疫应答2,4-6，且对 CMV-1E1 和 CMV-pp65 具有保护作用 体内7对于EBV，EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤及正常EBV感染的B细胞中表达的一种免疫优势CD4+ T细胞靶抗原8,9LMP2 在多种 HLA 类型中具有免疫原性，并在大多数 EBV 恶性肿瘤中表达，10,11 而BZLF1编码一种免疫优势性的即刻早期裂解周期抗原，能够刺激大多数个体的CD4+和CD8+ T细胞，可能在控制病毒复制细胞方面具有重要作用12为进一步优化我们的生产工艺，我们与 Nature Technology 合作，生成了最小化、无抗生素（符合 FDA 要求）的质粒用于 CTL 刺激13,14. 采用此策略，我们 consistently 获得的核转染效率为 >35%，同时保持高细胞活力（数据未显示）3. 图2 表明，通过IFNγ ELIspot检测，针对优化后的DNA质粒所产生的病毒特异性T细胞频率高于针对表达相同抗原的传统pShuttle表达质粒（n=8 腺病毒，n=4 巨细胞病毒，n=2 EB病毒）。如图所示，DC:PBMC的最佳比例对于有效T细胞刺激至关重要 图3 其中1:50的比例相比1:20的S:R比例产生的激活效果次优（n=2名供者）。产生具有广泛抗原特异性的足够数量的CTL是实现针对全部三种病毒临床疗效的前提。通过在G-Rex中培养CTL可实现这一目标，因其支持的T细胞扩增效果优于传统的24孔板图 4A)15，而向培养物中添加 IL4 和 IL7 可扩大其库容和特异性，如所示 图 4B 其中评估了在有或无IL4和/或IL7存在下培养的细胞中，针对CMV-pp65衍生的HLA-A2限制性NLV肽反应的T细胞频率16,17为了评估扩增细胞的表型和功能能力，我们进行流式细胞术分析、细胞内细胞因子染色/IFNγ ELIspot 以及 Cr51 对最终用于冷冻保存/输注的产品进行释放检测。通常所获得的细胞为多克隆细胞，包含混合的CD4+和CD8+ T细胞群体，且在两类T细胞中均可检测到抗原特异性。这些细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够杀伤表达病毒抗原的靶细胞，但不能杀伤病毒阴性且部分HLA匹配的靶细胞，表明其不应引发移植物抗宿主病（GvHD）。 体内 (图5).
图1. 重组CTL生成方案。首先，将编码病毒抗原的质粒通过核转染导入树突状细胞（DCs），然后以10:1或20:1的细胞比例与自体外周血单个核细胞（PBMCs）共培养。细胞在G-Rex培养瓶中加入IL-4和IL-7培养10至14天，随后收获、计数，并进行功能、身份鉴定及无菌检测，最后冻存以用于临床应用。
图2. 优化的DNA质粒可诱导更强的T细胞激活 体外. 使用编码六邻体（Hexon）和五邻体（Penton）（Adv）、IE1和pp65（CMV），以及EBNA1、LMP2和BZLF1（EBV）的优化型符合FDA标准的质粒，或编码相同抗原的传统pShuttle质粒对树突状细胞（DCs）进行核转染。用这些细胞刺激T细胞，并在刺激后第10天通过IFNγ ELIspot检测分析T细胞特异性。
图3. CTL激活的最佳DC:T细胞比例。来自两位供体的DC细胞通过核转染导入三种优化后的质粒，随后以1:20或1:50的DC:PBMC比例用于刺激自体PBMC。在第10天通过IFNγ ELIspot检测再激活T细胞的频率。
图4. 利用促进性细胞因子在G-Rex中进行T细胞扩增。图A展示了G-Rex装置以及通过显微镜观察到的气体可透膜上CTL细胞的形态，同时展示了传统组织培养板与G-Rex中获得的细胞产出量的比较。图B显示了在无细胞因子、单独添加IL-4、单独添加IL-7以及联合添加IL-4和IL-7的条件下扩增培养物中CMV五聚体阳性CTL的频率。
图5. 扩增的CTL表型与功能。图A展示了扩增多病毒特异性CTL表型的代表性示例，这些细胞为多克隆性，包含CD4+（45%，辅助性）和CD8+（42%，细胞毒性）T细胞的混合群体，其中绝大多数（95%）表达记忆性标志物CD45RO+/CD62L+。图B显示，这些细胞对所有刺激性抗原均具有特异性，并通过细胞内细胞因子染色检测抗原刺激后IFNγ和TNFα的产生，证实其具有多效功能。图C显示，通过Cr51释放实验测定，扩增的CTL具有功能活性。以自体LCL细胞作为靶细胞，单独使用或转导空载体或表达CMV-pp65的腺病毒载体；同种异体反应性则通过使用同种异体PHA活化母细胞作为靶细胞进行评估。
讨论
病毒感染在因疾病本身或其治疗而导致免疫功能低下的患者中，是造成显著发病率和死亡率的重要原因。例如，在造血干细胞移植（HSCT）后，由EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）等持续性疱疹病毒以及呼吸道合胞病毒（RSV）等呼吸道病毒引起的感染已被广泛认知；而近年来，腺病毒（Adv）、BK病毒以及人疱疹病毒（HHV）-6所致感染的重要性也逐渐受到重视。尽管某些病毒感染的标准治疗手段为药物治疗，但这些药物往往具有显著的毒性，易诱导耐药株的产生，且疗效常不理想。相比之下，来源于干细胞供体的病毒特异性T细胞在预防和治疗造血干细胞移植（HSCT）环境下的病毒感染或疾病方面已被证实安全且有效2,5,6,18-21。然而，T细胞免疫治疗的广泛应用最终受限于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）制备过程中的高昂成本、技术复杂性以及所需时间较长等问题。
我们在此手稿中描述的生成多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的创新且快速的方法，将显著提高针对病毒性疾病的细胞毒性T细胞治疗的可行性，从而使该策略有望成为免疫功能低下宿主的标准治疗方案。利用质粒核转染的树突状细胞（DC）作为抗原呈递细胞（APC），可在同一细胞中避免病毒载体或多种病毒抗原共表达时可能发生的竞争效应，从而在MHC I类和II类分子上均实现抗原呈递，因为每种质粒分别使用不同的DC细胞群进行处理。3使用IL-4/7可增强T细胞的存活与增殖，从而相应地提高抗原特异性T细胞的频率及其应答谱系16,17最后，在G-Rex中培养可显著降低T细胞在培养过程中的凋亡。气体交换（O₂2 在和 CO2 氧气通过烧瓶底部的透气性硅胶膜进行交换，可防止细胞缺氧，同时允许在细胞上方保留更厚的培养基，从而提供更多营养物质并稀释代谢废物。当保护性抗原被确定后，该平台还可拓展应用于其他病毒。
披露
Juan F. Vera 担任 Wilson Wolf Manufacturing 公司的顾问。其余作者无相关披露信息。
致谢
本工作得到了细胞疗法生产援助项目（合同编号：NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C）（C.M.R.）、细胞治疗专项研究中心资助项目 NIH-NHLBI 1 U54 HL081007（C.M.R.）、美国血液与骨髓移植学会青年研究者奖（U.G. 和 J.V.）、白血病与淋巴瘤学会临床研究特聘研究员奖（U.G.）以及艾米·斯特雷泽·马纳塞维特学者奖（A.M.L）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CellGenix | CellGenix | 2005 | |
| IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
| IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
| Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
| 人AB型血清 | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
| Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
| Nucleofector试剂盒 | Amaxa | V4XP-3012 | |
| 质粒 | NTC | n/a | |
| GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
| IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
| G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
参考文献
- Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale. J Immunother. 31, 359-369 (2008).
- Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).
- Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host. Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).
- Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol. 82, 546-554 (2008).
- Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 114, 4283-4292 (2009).
- Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).
- Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).
- Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses. J Virol. 75, 8649-8659 (2001).
- Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function. J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).
- Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).
- Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus. Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).
- Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response. J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).
- Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).
- Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids. Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).
- Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex. Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).
- Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).
- Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).
- Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet. 345, 9-13 (1995).
- Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916-3922 (2002).
- Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).
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