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利用重组可溶性 GM-CSF 受体评估 GM-CSF 抗体中和能力的无细胞检测系统

DOI：

10.3791/2742

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2011年6月27日

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1Bioscience Medical Research Center, Niigata University Medical and Dental Hospital, 2First department of Internal Medicine, School of Medicine, Kyorin University, 3Neosilk Laboratory, Immuno Biological Laboratories Co., Ltd.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们设计了一种无细胞受体结合实验，用于评估粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与受体的结合情况。该方法能够以优异的重复性，检测GM-CSF自身抗体对生物素标记的GM-CSF与可溶性GM-CSF受体α结合的竞争性抑制作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

背景：此前，我们已证实，在自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）患者中，GM-CSF 自身抗体的中和能力而非其浓度与疾病严重程度相关1-3。由于肺部 GM-CSF 生物活性的丧失很可能是导致自身免疫性 PAP 的原因4,5，因此检测 GM-CSF 自身抗体的中和能力，有望用于评估每位 PAP 患者的疾病严重程度。

迄今为止，GM-CSF 自身抗体的中和能力主要通过评估其对 GM-CSF 刺激的人骨髓细胞或 TF-1 细胞增殖的抑制作用来测定6-8。然而，在该生物活性检测体系中，由于在技术上难以将细胞维持在稳定的恒定状态，常常难以获得可靠的数据，也难以对不同实验室之间的数据进行比较。

目的：利用无细胞受体结合实验，模拟粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其细胞表面受体的结合。

方法：采用转基因家蚕技术获得大量高纯度的重组可溶性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α（sGMRα）9-13。重组sGMRα存在于丝胶蛋白的亲水层中，未与丝蛋白融合，因此可通过中性水溶液从蚕茧中简便地提取出纯度良好的产物14,15。幸运的是，其寡糖结构与GM-CSF结合密切相关，且相较于其他昆虫或酵母表达系统所产生的产物，更接近于人源sGMRα的糖结构。

结果：使用sGMRα的无细胞检测系统获得了高可塑性和高可靠性的数据。多克隆GM-CSF自身抗体以剂量依赖的方式抑制GM-CSF与sGMRα的结合，其模式与使用TF-1细胞的生物活性检测相似，表明我们新建立的基于sGMRα的无细胞检测系统在测定GM-CSF自身抗体的中和活性方面，比使用TF-1细胞或人骨髓细胞的生物检测系统更具优势。

结论：我们建立了一种无细胞检测方法，用于定量测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）自身抗体的中和能力。

方案

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1. sGMRα 的制备与纯化

  1. 通过聚合酶链式反应（PCR）从人胎盘cDNA文库中扩增sGMRα的cDNA。
  2. 通过另一次PCR，在PCR扩增产物的3'端添加50个碱基的杆状病毒多角体蛋白基因5'-UTR序列以及27个碱基编码的RGS His标签序列。
  3. 将扩增后的PCR产物插入质粒pMSG1.1MG中。
  4. 将构建体psGMR/M1.1MG与辅助载体pHA3PIG共同注射入家蚕pnd-w1品系的蚕卵中。
  5. 在25°C条件下饲养孵化的G0代幼虫至成虫，通过兄妹交配或与pnd-w1交配获得G1代胚胎，并筛选眼部表达MGFP的胚胎，以获得携带sGMRα基因的转基因家蚕。
  6. 用含有500 mM NaCl的磷酸盐缓冲液从转基因家蚕的茧中提取重组sGMRα，并在4°C下搅拌24小时。
  7. 在20000 g离心15分钟，去除沉淀物。
  8. 将上清液上样至镍亲和层析柱。
  9. 用含10 mM咪唑、500 mM NaCl和20 mM磷酸钠（pH 6.3）的缓冲液洗涤层析柱，然后用咪唑浓度从10 mM到250 mM的线性梯度进行洗脱。合并含有纯化sGMRα的洗脱组分，并将其对磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）进行透析。

2. 重组GM-CSF的生物素标记

  1. 通过透析去除山梨醇制备物，透析液为 PBS。
  2. 在冰上，向溶液中加入 1 ml 20 mM 的冷偏高碘酸钠溶液（4°C）。
  3. 将样品在冰上避光孵育 30 分钟。
  4. 向溶液中加入甘油，终浓度为 15 mM。
  5. 用 100 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.5）对溶液进行透析。
  6. 向溶液中加入生物素酰肼，终浓度为 5 mM，并在室温下持续振荡反应 2 小时。
  7. 通过在 PBS（pH 7.4）中透析去除未反应的物质。

3. 一种无细胞的 GM-CSF 受体-配体结合检测方法

  1. 在4°C条件下，用50μl单克隆抗多聚组氨酸抗体包被微孔板，孵育过夜。
  2. 用500μl PBST洗涤五次。
  3. 加入100μl封闭液，在4°C下孵育3小时。
  4. 用500μl PBST洗涤五次。
  5. 加入50μl含sGMRα的封闭液，在4°C下孵育过夜。
  6. 用500μl PBST洗涤五次。
  7. 加入25μl含GM-CSF自身抗体的样本，再加入25μl生物素标记的GM-CSF，在4°C下孵育1小时，以形成sGMRα-GM-CSF复合物。
  8. 用500μl PBST洗涤五次。
  9. 加入50μl 0.4 mM链霉亲和素碱性磷酸酶，在4°C下孵育1小时，用于检测与sGMRα结合的生物素化GM-CSF。
  10. 用500μl PBST洗涤五次。
  11. 向反应体系中加入50μl化学发光底物，在室温下孵育1小时。
  12. 使用化学发光酶标仪检测化学发光信号。

4. 代表性结果：

GM-CSF受体信号转导通路的第一步是GM-CSF与其细胞表面的GM-CSF受体α亚基结合。由于GM-CSF自身抗体可在体外特异性结合GM-CSF并阻断其与受体的结合16,17，我们推测这些自身抗体通过直接结合GM-CSF来抑制这一初始反应。如先前所述（参考文献9-15），我们采用转基因家蚕技术获得了大量高纯度的重组可溶性GMRα（sGMRα）。

当在非还原条件下将家蚕来源的重组sGMRα进行SDS-PAGE电泳时，sGMRα显示出单体（45 kDa）和二聚体（90 kDa）两种形式，而在还原条件下仅检测到单体形式（图1B），表明该重组sGMRα是单体与二硫键连接的二聚体的混合物18。

利用无细胞系统（图2A），我们评估了GM-CSF自身抗体对sGMRα结合GM-CSF的抑制作用（图2B和图2C）。这些方法已在Urano等人参考文献19中描述。在不同浓度的GM-CSF自身抗体条件下，生长抑制与结合抑制密切相关（r=0.988，p=0.002）（图3A）19。同样，结合抑制与生长抑制之间也存在显著相关性。GM-CSF自身抗体以剂量依赖的方式增强结合抑制效应（图3B）19。来自不同患者的血清IgG组分在这两个参数之间也表现出相互关联（r=0.589，p=0.006，图3C）。结合抑制和生长抑制均与Kd值无相关性，因此这两个参数不受结合亲和力的影响19。因此，我们评估了三次独立实验中三个不同样本所获得的结合抑制与生长抑制数据的可重复性。变异系数表明，无细胞系统的性能优于生物活性测定法（表1）。

figure-protocol-1
图1. 利用转基因家蚕生产sGMRα的流程图。A) 转化载体的结构9-11。B) 纯化的sGMRα在还原和非还原条件下的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色结果。sGMRα，可溶性GM-CSF受体α；MGFP，monster绿色荧光蛋白；BmNPVpol5'-UTR，Bombyx mori核型多角体病毒多角体蛋白基因的5'-非翻译区序列；SV40 polyA，SV40 polyA信号序列；P3xP3，3xP3启动子；Pser1，ser1启动子；fibL polyA，丝心蛋白L链polyA信号序列；hr3，Bombyx mori核型多角体病毒hr3增强子。

figure-protocol-2
图2. 无细胞检测系统的示意图。A) 利用家蚕表达的sGMRα进行的竞争性结合检测。B) 中和性与非中和性抗体在无细胞系统中对结合抑制的影响。C) 不同浓度的中和性抗体与非中和性抗体在结合抑制效果上的差异。GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；sGMRα，可溶性GM-CSF受体α；His，RGS-His标签；AP，碱性磷酸酶。

figure-protocol-3
图3. GM-CSF多克隆抗体或自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）患者血清IgG组分对GM-CSF与其可溶性受体α亚基（sGMRα）结合的抑制作用。A) GM-CSF自身抗体介导的结合抑制与生长抑制之间的关系。B) 不同浓度GM-CSF自身抗体下的结合抑制情况。C) 血清IgG组分对结合抑制和生长抑制的IC50值之间的关系19。IC50，50%抑制浓度；GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

样本ABC
批间差异
测定次数333
平均值（% 结合抑制）61.6 63.869.7
平均值（% 生长抑制）21.073.482.8
变异系数（%）（% 结合抑制）6.05.68.3
变异系数（%）（% 生长抑制）64.418.310.4

两种检测均在 5 ng/ml 的 GM-CSF 和等同于 GM-CSF 自身抗体浓度的条件下进行。

表1. 通过三次独立实验获得的结合率与生长抑制率的变异系数比较。

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讨论

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该无细胞检测法能够以优异的重复性和快速性评估GM-CSF自身抗体的中和能力。本检测方法可用于评价GM-CSF自身抗体或患者血清IgG组分对结合的抑制作用。实验数据显示，无细胞检测法的结合抑制作用与利用TF-1细胞进行的生物活性检测中的生长抑制作用之间存在相关性。尽管该生物活性检测已被广泛使用，但在不同实验机构及不同时间点之间比较数据时存在困难，而采用这一新系统可避免此类问题。

GM-CSF 与 sGMRα 以低亲和力结合，形成二元复合物20。最近的研究表明，人源 GM-CSF 在细胞表面与 GM-CSF 受体 α 和 GM-CSF 受体 β 结合，形成具有高亲和力的十二聚体复合物21。因此，基于单体 GM-CSF 受体 α 和二聚体 GM-CSF 受体 β 组成的三元复合物的检测系统，可能成为未来改进无细胞检测方法的候选体系。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们没有需要披露的内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们非常感谢 K. Nakagaki、H. Ishii 博士、K. Suzuki 博士、A. Yamagata 和 K. Oofusa 所做出的宝贵贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人胎盘 cDNA 文库Takara
镍亲和层析柱GE Healthcare17-5247-01
生物素酰肼（EZ-Link Biotin Hydrazide）PIERCE21339
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF，Leukine）Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino 氨基化固相载体Nalge Nunc International436007
小鼠源单克隆抗多聚组氨酸抗体Sigma-AldrichH10290.2ml
封闭液（StabilCoat）SurmodicsSC01-10001000ml
ZyMAX 链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物Invitrogen43-8322
CDP-Star 即用型显色液（含 Sapphire-II）Applied BiosystemsT2214
化学发光板式读数仪BERTHOLD TECHNOLOGIESTriStar LB 941

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
  2. Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
  3. Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
  4. Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
  5. Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
  6. Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
  7. Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
  8. Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
  9. Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
  10. Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
  11. Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
  12. Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  13. Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
  14. Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
  15. Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
  16. Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
  17. Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
  18. Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
  19. Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
  20. Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
  21. Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).

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