我们设计了一种无细胞受体结合实验，用于评估粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与受体的结合情况。该方法能够以优异的重复性，检测GM-CSF自身抗体对生物素标记的GM-CSF与可溶性GM-CSF受体α结合的竞争性抑制作用。
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摘要
摘要
背景：此前，我们已证实，在自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）患者中，GM-CSF 自身抗体的中和能力而非其浓度与疾病严重程度相关1-3。由于肺部 GM-CSF 生物活性的丧失很可能是导致自身免疫性 PAP 的原因4,5，因此检测 GM-CSF 自身抗体的中和能力，有望用于评估每位 PAP 患者的疾病严重程度。
迄今为止，GM-CSF 自身抗体的中和能力主要通过评估其对 GM-CSF 刺激的人骨髓细胞或 TF-1 细胞增殖的抑制作用来测定6-8。然而，在该生物活性检测体系中，由于在技术上难以将细胞维持在稳定的恒定状态，常常难以获得可靠的数据，也难以对不同实验室之间的数据进行比较。
目的：利用无细胞受体结合实验，模拟粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其细胞表面受体的结合。
方法：采用转基因家蚕技术获得大量高纯度的重组可溶性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α（sGMRα）9-13。重组sGMRα存在于丝胶蛋白的亲水层中，未与丝蛋白融合，因此可通过中性水溶液从蚕茧中简便地提取出纯度良好的产物14,15。幸运的是，其寡糖结构与GM-CSF结合密切相关，且相较于其他昆虫或酵母表达系统所产生的产物，更接近于人源sGMRα的糖结构。
结果：使用sGMRα的无细胞检测系统获得了高可塑性和高可靠性的数据。多克隆GM-CSF自身抗体以剂量依赖的方式抑制GM-CSF与sGMRα的结合，其模式与使用TF-1细胞的生物活性检测相似，表明我们新建立的基于sGMRα的无细胞检测系统在测定GM-CSF自身抗体的中和活性方面，比使用TF-1细胞或人骨髓细胞的生物检测系统更具优势。
结论：我们建立了一种无细胞检测方法，用于定量测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）自身抗体的中和能力。
方案
1. sGMRα 的制备与纯化
- 通过聚合酶链式反应（PCR）从人胎盘cDNA文库中扩增sGMRα的cDNA。
- 通过另一次PCR，在PCR扩增产物的3'端添加50个碱基的杆状病毒多角体基因5'-UTR序列以及27个碱基编码的RGS His标签。
- 将扩增后的PCR产物插入质粒pMSG1.1MG中。
- 将构建体psGMR/M1.1MG与辅助载体pHA3PIG共同注射入家蚕pnd-w1品系的蚕卵中。
- 在25°C条件下饲养孵化的G0代幼虫至成虫，通过兄妹交配或与pnd-w1交配获得G1代胚胎，并筛选眼部具有MGFP表达的个体，以获得携带sGMRα基因的转基因家蚕。
- 使用含有500 mM NaCl的磷酸盐缓冲液从转基因家蚕的蚕茧中提取重组sGMRα，并在4°C下搅拌24小时。
- 以20000 g离心15分钟，去除沉淀物。
- 将上清液上样至镍亲和层析柱。
- 用含10 mM咪唑、500 mM NaCl和20 mM磷酸钠（pH 6.3）的缓冲液洗涤层析柱，然后用10 mM至250 mM咪唑的线性梯度进行洗脱。合并含有纯化sGMRα的洗脱组分，并将其对磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）进行透析。
2. 重组GM-CSF的生物素标记
- 通过透析去除山梨醇制备物，透析液为 PBS。
- 在冰上，....
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讨论
该无细胞检测法能够以优异的重复性和快速性评估GM-CSF自身抗体的中和能力。本检测方法可用于评价GM-CSF自身抗体或患者血清IgG组分对结合的抑制作用。实验数据显示，无细胞检测法的结合抑制作用与利用TF-1细胞进行的生物活性检测中的生长抑制作用之间存在相关性。尽管该生物活性检测已被广泛使用，但在不同实验机构及不同时间点之间比较数据时存在困难，而采用这一新系统可避免此类问题。
GM-CSF 与 sGMRα 以低亲和力结合，形成二元复合物20。最近的研究表明，人源 GM-CSF 在细胞表面与 GM-CSF 受体 α 和 GM-CSF 受体 β 结合，形成具有高亲和力的十二聚体复合物21。因此，基于单体 GM-CSF 受体 α 和二聚体 GM-CSF 受体 β 组成的三元复合物的检测系统，可能成为未来改进无细胞检测方法的候选体系。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们非常感谢 K. Nakagaki、H. Ishii 博士、K. Suzuki 博士、A. Yamagata 和 K. Oofusa 所做出的宝贵贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人胎盘 cDNA 文库 | Takara | ||
| 镍亲和层析柱 | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| 生物素酰肼（EZ-Link Biotin Hydrazide） | PIERCE | 21339 | |
| 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF，Leukine） | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino 氨基化固相载体 | Nalge Nunc International | 436007 | |
| 小鼠源单克隆抗多聚组氨酸抗体 | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| 封闭液（StabilCoat） | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX 链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物 | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star 即用型显色液（含 Sapphire-II） | Applied Biosystems | T2214 | |
| 化学发光板式读数仪 | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
参考文献
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R.
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