我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。
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本文内容
摘要
摘要
树突状细胞（DCs）可被视为免疫系统的哨兵，在免疫应答的启动及对感染的反应中发挥关键作用1。初始DC通过模式识别受体（PRRs）识别病原体抗原，这些受体能够识别被称为病原体相关分子模式（PAMPS）的特定保守结构。DCs对PAMPs的识别会触发细胞内信号级联反应，导致其活化并转化为成熟DC。该过程通常表现为I型干扰素及其他促炎性细胞因子的产生、MHCII和CD86等细胞表面标志物的上调，以及成熟DC向引流淋巴结的迁移，在此与T细胞相互作用，启动适应性免疫应答2,3。因此，DCs连接了先天性免疫系统与适应性免疫系统。
解析树突状细胞（DC）对各种病原体反应背后的分子网络，对于深入理解这些信号通路及其诱导基因的调控机制至关重要。这也将有助于推动针对传染病和肿瘤的树突状细胞疫苗的开发。然而，由于难以转染原代DC，这一研究方向受到了严重阻碍4。
病毒转导方法（如慢病毒系统）通常被采用，但存在诸多局限性，例如操作复杂以及生物危害风险（及其相关成本）5,6,7,8。此外，病毒基因产物的递送会增加被转导树突状细胞（DCs）的免疫原性9,10,11,12。电穿孔技术虽已有应用，但结果参差不齐13,14,15，而我们是首个报道使用高通量转染方案并确凿证明其有效性的研究团队。
本报告总结了一种优化的商业化方案，用于高效转染人原代树突状细胞（DCs），该方法细胞毒性低，且不会诱导树突状细胞成熟16。转染效率（以GFP质粒为指标）和细胞存活率分别超过50%和70%。流式细胞术（FACS）分析证实，转染细胞中成熟标志物CD86和MHCII的表达水平未升高，同时qRT-PCR结果显示IFNβ基因无上调表达。采用该电穿孔方案，我们证实了siRNA可成功转染树突状细胞，并在mRNA和蛋白质水平上有效沉默靶基因RIG-I——一种关键的病毒识别受体16,17。
方案
1. 设置 Amaxa 96 孔 Shuttle 核转染仪程序
- 打开一个新的参数文件。
- 通过在96孔板示意图上拖动光标，选择标准转染实验所用的孔数。每个实验样本至少使用3个孔进行合并。
- 输入程序代码：在“部分1”中从下拉菜单选择“FF”，在“部分2”中选择“168”。
- 在“Solution”（溶液）框中选择“Monocyte, human”。
- 在“Control Option”（控制选项）下选择“standard”（标准）。
- 点击“Apply”（应用）。
- 如需包含无转染对照，请根据需要从示意图中选择额外的孔，然后在“Control Option”中选择“No Program Control”，并点击“Apply”。
- 选中板图中所有剩余未使用的孔，然后点击“Undefine”（取消定义）。
2. 准备用于转染的树突状细胞
- 所有操作应尽可能在无菌条件下于细胞培养罩内进行。通过将96孔补充剂按450比2025的比例加入人单核细胞96孔核转染溶液中，制备核转染溶液。混匀后置于室温平衡。每孔需要20μl核转染溶液。额外多配制10%以弥补移液误差。
- 将所需数量的核转染杯模块按正确方向插入核转染杯板中，例如第一个插入第1和第2行。
- 根据实验所需，按每孔500,000个细胞计算并收集树突状细胞（DCs），在400g离心10分钟成团，小心吸除上清液。
- 用移液器轻轻吹打数次，将细胞重悬于核转染溶液中。
- 根据特定处理条件（如GLO和RIG-I）将重悬细胞的适当体积分装至标记好的离心管中。
- 每500,000个细胞加入0.25μg siRNA，通过移液混匀。在无转染对照样本中使用非靶向siRNA。
- 根据实验设计，将上述混合物各20μl移入相应的核转染杯模块中，确保液体送达孔底。
- 用盖子盖好核转染杯板，并在硬质表面上轻敲数次，以帮助排除气泡。
3. 转染树突状细胞
- 将培养板插入 Nucleofector 96 孔 Shuttle 转染装置托盘中，点击“上传”然后启动。
- 通过笔记本电脑显示屏监控转染过程的进度；绿色背景上的黑色十字表示该孔转染成功，红色背景上的黑色横条表示转染失败。
- 转染过程完成后，取出培养板，使用多通道移液器向每孔加入 80 μl DC 培养基。
- 在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
- 将核转染杯中的 100 μl 液体转移至含有 100 μl 预热 DC 培养基的矩阵管中，保持正确的方向。
- 移除并丢弃未发生转染的管子。
- 在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时或其它所需时间间隔。
4. 用新城疫病毒（NDV）感染细胞
- 从培养箱中取出基质管，转移至细胞培养操作台，将每个实验样本的基质管内容物合并至离心管中
- 在台式离心机中以5分钟低速离心收集细胞，小心吸弃上清液
- 用含新城疫病毒（NDV）且感染复数（MOI）为1的无血清生长培养基重悬细胞，将离心管松盖后于37°C、5% CO2条件下孵育45分钟
- 加入900μl树突状细胞（DC）生长培养基，继续孵育8–10小时
5. 收获细胞
- 使用台式离心机离心微量离心管，使细胞沉淀，然后弃去上清液。
- 根据您的实验方案收集细胞，用于RNA或蛋白质提取。
6. 代表性结果：
使用我们优化后的方案，将树突状细胞（DCs）进行转染 RIGI用靶向siRNA处理细胞24小时后，用新城疫病毒（NDV，一种可被RIG-I识别的副黏病毒）感染细胞，以激活干扰素反应通路。通过qRT-PCR分析，我们证实该基因在转录水平上的表达被敲低了75%。我们还观察到其表达水平出现类似的下降 IFNβ，这是RIG-I在IFN信号级联中的下游效应分子。此外，我们观察到表达 IFNβ 在未感染的对照转染细胞中不可检测，而 MxA，一个 IFNβ 下游响应基因的表达极低（图1A）。
使用足量细胞进行树突状细胞的第二次转染，以进行靶向 RIGI 的 siRNA 转染，并包含 Western blot 分析。尽管 RT-PCR 结果与我们此前观察到的结果相似（RIG-I 和 IFNβ 表达分别下调 62% 和 66%）（图 1B），但针对 RIG-I 的 Western blot 结果显示，该基因的表达已被完全阻断（图 1C）。
图1. (A) 使用靶向RIG-I的siRNA或非特异性GLO siRNA转染MoDCs，并通过qRT-PCR检测RIG-I、IFNβ和MxA的表达水平。转染采用单核细胞特异性缓冲液及核转染程序FF168（Lonza Walkersville Inc.）。转染后细胞在37°C孵育24小时，随后部分细胞感染NDV（+），另一部分未感染（-）。继续孵育10小时后收集细胞并提取RNA。转录水平数据来自两次重复实验的结果。引自Bowles et al 16。
(B) 与图1A所用不同血沉棕黄层来源的MoDCs，再次采用上述相同的转染方案，分别转染靶向RIG-I的siRNA或非特异性GLO siRNA。本实验额外增设未转染MoDCs作为对照组。所有细胞在转染后孵育24小时，随后均感染NDV，并继续孵育10小时，之后收集细胞用于RNA和蛋白质的提取。通过qRT-PCR测定的RIG-I、IFNβ和MxA转录水平代表两次重复实验的结果。引自Bowles et al 16。
(C) 对图1B所述细胞的裂解物进行Western印迹分析。第1和第2泳道：未转染细胞的裂解物；第3和第4泳道：转染GLO siRNA细胞的裂解物；第5和第6泳道：转染靶向RIG-I siRNA细胞的裂解物。样品使用RIG-I抗体进行探测，同时以GAPDH作为上样对照，并设置重复上样。引自Bowles et al 16。
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讨论
高效转染初始原代树突状细胞对于高通量分析以及逆向解析这类关键细胞中介导先天免疫向适应性免疫转换的炎症通路至关重要。然而，大多数研究者发现，使用常规转染技术时，这些细胞不仅难以实现高效转染，而且转染过程本身还容易诱导细胞成熟。我们探讨了是否可通过高通量方案优化，利用一种可同时独立操作的96孔商用核转染系统（Lonza），克服上述局限性。
通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，我们检测了表达GFP的质粒作为转染效率的标记物，并以CD86和MHCII的免疫反应性作为细胞成熟程度的读数。一系列评估缓冲液和电穿孔程序的实验最终确定了能够实现>50%转染效率且不引起成熟标志物升高的实验条件。
为进一步研究核转染过程是否可能激活树突状细胞（DCs），我们分析了其表达水平 IFNβ 及其下游应答基因 MxA 在mRNA水平上 MxA 表达对……极为敏感 IFNβ 产生，并可作为生物检定法用于检测极低水平的细胞因子18。通过qRT-PCR分析，我们未检测到明显信号 <...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所合同编号 HHSN2662000500021C 资助。我们感谢 Ming Chen 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96孔Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | 序列号 |
| Amaxa 人单核细胞96孔Nucleofector试剂盒 | Lonza Inc. | VHPA-2007 | 包含人单核细胞96孔Nucleofector溶液、96孔补充剂以及Nucleocuvette和板 |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | 添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素以制备树突状细胞生长培养基 |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030081 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15070063 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | 3070.03 | |
| 树突状细胞 | 纽约血液中心 | 树突状细胞通过标准程序从血沉棕黄层中纯化获得 |
参考文献
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