高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

Summary

我们目前我们优化的高通量nucleofection协议，要么质粒DNA或不会造成细胞的成熟的siRNA转染初级人类单核细胞衍生的树突状细胞的有效方法。我们进一步提供证据证明为成功的siRNA沉默靶基因的mRNA和蛋白水平的RIG - I。

Abstract

树突状细胞可以被认为是其中发挥关键作用，在其发起和响应^感染 1的免疫系统的哨兵。天真区议会致病抗原的检测是通过模式识别受体（PRRS）是能够识别特定病原体相关分子模式（PAMPS）的保守结构。区议会PAMPS检测触发细胞内的信号级联，导致他们的活化和转化为成熟DC。这个过程通常是通过对1型干扰素的生产特点以及与其他炎性细胞因子，如MHCII和CD86和迁移的淋巴结，与T细胞相互作用启动适应性免疫反应的成熟DC的细胞表面标志^的上调， ^3。因此，区议会的联系先天免疫和适应性免疫系统。

解剖的基本直流响应，以各种病原体的分子网络的能力是至关重要的，以更好地了解了这些信号通路的调控和诱导基因。它也应当有助于促进DC为基础的疫苗针对传染病和肿瘤的发展。然而，此行的研究已经严重阻碍，难以转染的主要区^议会 4 。

病毒转导的方法，如慢病毒系统，通常使用的，但携带很多限制，如复杂性和有害生物风险（ ^相关费用）5,6,7,8。此外，该病毒基因产物的交付增加转区^议会 9,10,11,12的免疫原性。电穿孔技术已用于^13,14,15结果好坏参半，但我们是第一个报告使用一种高通量的转染协议和确凿证明其效用。

在这份报告中，我们总结了一个优化的商业协议，高通量转染人类的主要区议会，与有限的细胞毒性和^一个 DC成熟16的情况下。转染效率（GFP质粒）和细胞活力分别超过50％和70％。流式细胞仪分析建立的成熟标志物CD86和MHCII转染细胞中表达增加的情况下，而定量RT - PCR结果显示没有IFNβ上调。使用此电协议，我们提供证据议会成功转染siRNA和有效的敲有针对性的基因RIG - ^I，16,17一个关键的病毒识别受体的mRNA和蛋白水平，。

Protocol

1。计划Amaxa 96穿梭Nucleofector

1. 打开一个新的参数文件。
2. 选择您将使用标准的转拖动光标在96孔板图，井的数量。使用至少3口井，池，每个实验样品。
3. 输入程序代码:在第一部分选择"FF"，并在第2部分选择'168'从下拉式菜单
4. 从解决方案中，选择"单核细胞，人类"
5. 在控制选项，选择"标准"。
6. 点击应用。
7. 包括无染控制，从图中选择进一步根据需要，然后选择"没有计划控制"控制选项，并单击Apply井。
8. 选择任何的板图上剩余的未使用的水井和点击取消定义。

2。准备转区议会

1. 一切工作都要在细胞培养罩在可能的情况下无菌条件下进行。准备加入96 nucleofection解决方案以及补充96人单核细胞以及在450到2025年的比例Nucleofector解决方案。混合，让温暖室温。您需要的解决方案nucleofection20μL，每口井。作出超过10％，让移液错误。
2. 将nucleocuvette模块，你需要在正确的方向，即nucleocuvette板插入1和第2行第一个。
3. 确定为您的实验400克离心10min后，在50万个以及细胞和颗粒细胞计算所需的DC。小心去除上清。
4. 重悬浮在nucleofection溶液中轻轻吹打向上和向下几次的细胞。
5. 分成特定的治疗如GLO和RIG - I标记eppendorfs的悬浮细胞的正确的卷。
6. 添加吹打每50万细胞和混合0.25μg的siRNA。使用非针对你不转染对照样品的siRNA。
7. 移取20μL到nucleocuvette模块上述混合物中，根据实验布局，确保液体被传递到井底。
8. 盖上盖子nucleocuvette板和挖掘了几次，在坚硬的表面，以帮助确保去除气泡板。

3。转染区议会

1. Nucleofector 96穿梭托盘插入板，点击上传，然后开始。
2. 按照圈上方显示转染过程中的进展情况;一个绿色背景上的黑十字标志，以及在成功转染，而红色背景上的一个黑条意味着它是不成功的。
3. 在转染过程完成后，删除板和直流生长介质中添加每口井使用多道移液器80μl。
4. 盘10分钟在37 ° C和5％的CO _2。
5. 从nucleocuvettes转移到矩阵管的预热直流生长培养基中含有100μL100μL量，保持正确的方向。
6. 取下并丢弃那些管的地方转没有发生。
7. 在37 ° C和5％的CO ₂为24小时或其他所需的时间间隔。

4。感染新城疫病毒细胞

1. 每个实验样品取出矩阵管从孵化器到细胞培养罩和池管到eppendorfs
2. 颗粒细胞轻轻在桌面离心纺丝5分钟，去除上清液。
3. 重悬在无血清的增长介质中含有新城疫病毒的细胞在MOI为1，并在37 ° C和5％ _的 CO 2为45分钟eppendorfs松散覆盖在无菌的方式。
4. 添加直流生长培养基900μl，和重新孵育8-10小时

5。收获细胞

1. 纺eppendorfs在桌面离心机，去除上清液，沉淀细胞。
2. 收获细胞RNA或蛋白质的提取，根据您的协议。

6。代表性的成果:

使用我们的优化协议，我们转染的 DC瑞吉，针对24小时的siRNA，然后感染新城疫病毒（RIG - I检测到一个副粘病毒）的细胞刺激干扰素反应途径。 QRT - PCR分析表明敲的基因在转录水平的75％。我们还观察到一个类似IFNβ表达减少，在干扰素信号级联，这是一个RIG - I的下游效应。此外，我们观察到，在非疫区，控制转染的细胞表达IFNβ，没有检测到 ， 而 MXA，IFNβ下游反应基因，是最小的（图1A）。

一个区议会第二次转瑞吉靶向的siRNA进行足够的细胞包括免疫印迹分析。凡RT - PCR结果相似，我们看到以前（敲除RIG - I和IFNβ表达分别下降62％和66％）（图1B），免疫印迹检测RIG - I显示，该基因的表达已完全阻断（图1C）。

图1。 （一）MoDCs或者siRNA的转染靶向的RIG - I或GLO的siRNA和非特异性的RIG - I，IFNβ和QRT - PCR确定MXA的表达效果。转染协议，用于单核细胞特定的缓冲和nucleoporation方案FF168（龙沙Walkersville公司）以下潜伏期为24小时，转染的细胞被感染了新城疫病毒（+）或左未受感染者（ - ）。进一步潜伏期为10小时后，收获细胞和RNA提取的转录水平代表两个重复实验的结果。从鲍尔斯等 ^16。（二）从一个不同的棕黄色大衣图1A MoDCs再次转任的RIG - I靶向siRNA或使用相同的转染上述协议的非特异性GLO的siRNA 。一个额外的控制，使用未转染MoDCs纳入实验。所有细胞与鸡新城疫病毒感染，并为进一步的RNA和蛋白质的提取收获前10 h孵育后培养24 h。 RIG - I，IFNβ和MXA QRT - PCR确定的转录水平代表两个重复实验的结果。鲍尔斯等 ^16（C）从上面的图1B中描述的细胞裂解液，免疫印迹分析。泳道1和2，未转染细胞裂解液;泳道3和4，来自GLO siRNA转染细胞裂解液;泳道5和6，RIG -我靶向的siRNA转染细胞裂解液。样品探测RIG - I，也GAPDH的装载控制和重复运行。摘自鲍尔斯等 ^16。

Discussion

幼稚的初级树突状细胞的高效转染重要的是，在这关键的细胞介导的​​先天适应性免疫过渡的细胞炎症通路的高通量分析和逆向工程。然而，大多数研究人员发现，这些细胞是难以转染效率和转染过程诱导细胞成熟时，使用标准的转染技术。我们研究了克服这些限制是否可以由高吞吐量协议优化使用，同时，独立96以及商业核转染系统（龙沙）。

利用荧光激活细胞分选（FACS），我们测得的绿色荧光蛋白表达质粒转染效率和标志物CD86和MHCII免疫细胞成熟的读数。一系列实验评估缓冲器和电的方案，最终确定的条件显示> 50％的转染和成熟的标志物增加的情况下。

为了进一步探讨的nucleofection过程中可能激活区议会，我们分析，在mRNA水平的IFNβ的表达水平和其下游反应基因 MXA。MXA表达是极其敏感IFNβ生产的，可用于生物活性检测到非常低的水平在cytokine18。通过定量RT - PCR分析，我们看到没有检测 IFNβ表达，但确实看到...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备/试剂	公司	目录＃	评论
Amaxa Nucleofector 96以及班车	龙沙	108S0109	序列号
Amaxa人类单核细胞96 Nucleofector套件	龙沙	VHPA - 2007	包含96 Nucleofector解决方案的人单核细胞，96的补充和Nucleocuvettes和板
RIG -我的siRNA	Dharmacon	L - 012511 - 00
GLO的siRNA	Dharmacon	D - 001600 - 01 - 20
RPMI 1640培养	Invitrogen公司	11875	辅以10％的FCS，2毫米L -谷氨酰胺，100 U / ml青霉素和100微克/ ml链霉素，使直流生长介质
DMEM培养液	Invitrogen公司	11965
L -谷氨酰胺	Invitrogen公司	25030081
青霉素/链霉素	Invitrogen公司	15070063
胎牛血清	Hyclone公司	3070.03
树突状细胞	纽约血液中心		区议会是从Buffy大衣使用的标准程序纯化