稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。
本文内容
摘要
摘要
定量检测蛋白质的方法存在巨大需求。传统的夹心免疫测定法在定量分析中被广泛视为金标准，但其成本高昂、周期长，且存在诸多缺陷（例如异嗜性抗体、自身抗体干扰、“钩状效应”等）1。一种替代技术是将肽段亲和富集与定量质谱分析相结合，通常称为SISCAPA（稳定同位素标准品与抗肽抗体捕获法）2。该技术通过稳定同位素稀释法进行肽段亲和富集，并利用选择/多反应监测质谱法（SRM/MRM-MS）进行检测，从而实现对肽段的定量测量，以代表其对应蛋白质的含量。SRM/MRM-MS在小分子准确定量方面已有成熟应用3, 4，近年来已被改进用于测定血浆和细胞裂解液中蛋白质的浓度5-7。为了实现蛋白质的定量，通常先使用胰蛋白酶等酶将这些大分子蛋白质消化为肽段。随后，从样本中选择并富集一个或多个在该物种中仅目标蛋白特有的肽段序列（即“蛋白质组型”肽段），利用抗肽抗体对其进行富集，并作为蛋白质浓度的定量化学计量替代物进行测量。因此，结合稳定同位素稀释（SID）方法（即加入稳定同位素标记的肽段标准品），SRM/MRM可用于在复杂生物基质中测定蛋白质组型肽段的浓度，从而实现对蛋白质的定量。相比传统免疫测定法，该方法具有多项优势：试剂制备成本相对较低，分析物特异性优异，可实现高度多重检测，可在未经去除高丰度蛋白的血浆中直接进行富集，且该技术适用于多种目标蛋白质或其修饰形式的检测8-13。在本视频中，我们将演示该方法在磁珠平台上的基本操作流程。
方案
实验步骤：
该检测需要合成肽段和抗肽抗体。所选肽段应为靶蛋白特有，包含8至22个氨基酸残基，且无已知的翻译后修饰。通常避免使用含蛋氨酸的肽段，同时不推荐使用含有双碱性氨基酸（如KK、KR、RR）的肽段。在本技术中，通常使用稳定同位素标记的肽段作为内标物，在肽段的C端引入重同位素标记的氨基酸（即标记的K或R，如13C和15N标记）。
以下实验方案描述了一种用于检测小鼠骨桥蛋白（Osteopontin）中GDSLAYGLR肽段的方法，该方法使用来自Epitomics Inc.（加利福尼亚州伯林盖姆）的抗肽抗体以及New England Peptide（马萨诸塞州加德纳）提供的合成肽段。本方案包括三个主要步骤（图1）：1）复杂蛋白质混合物的胰蛋白酶消化，2）肽段富集，3）质谱分析。本方法将以添加了小鼠骨桥蛋白的人血浆样本为例进行演示。
1. 胰蛋白酶酶解及纯化
- 在湿冰上解冻10 μL纯血浆等分试样。
- 通过BCA法测定总蛋白浓度，并离心样品以去除任何悬浮固体。
- 用移液器将10 μL等分试样从储存管转移至1000 μL深孔板中，并用可穿刺封膜覆盖。
- 向每个样品中加入20 μL新鲜配制的9M尿素/30mM二硫苏糖醇（DTT）（终浓度为6M尿素/20mM DTT）。
- 在37°C孵育30分钟。
- 向每个样品中加入3 μL新鲜配制的500 mM碘乙酰胺（IAM）（终浓度为50 mM IAM）。
- 在室温下避光孵育30分钟。
- 加入257 μL 100 mM Tris（pH 8）（将尿素稀释至约0.6M）。
- 加入10 μL胰蛋白酶储存液（1 μg/μL；酶与底物比例为1:50）。
- 在37°C孵育过夜（12–16小时）。
- 加入3 μL纯甲酸（终浓度为1%）。
- 加入稳定同位素标准品（若进行多重检测，则加入多个标准品，通常约为10 μL，含有50–100 fmol的同位素标记肽标准品）。
- 用500 μL含0.1%甲酸的80%乙腈洗涤Oasis小柱板孔，弃去穿流液。重复此步骤3次。
- 通过加入500 μL含0.1%甲酸的水溶液平衡小柱板，并弃去穿流液。重复此步骤4次。
- 将消化后的样品加载至小柱板，并调节真空度使流速非常缓慢。
- 用500 μL含0.1%甲酸的水溶液洗涤，弃去穿流液。重复此步骤3次。
- 用2 × 500 μL含0.1%甲酸的80%乙腈洗脱肽段，收集至1000 μL深孔板中（勿弃穿流液）。
- 将洗脱液冷冻干燥（或使用真空浓缩仪）至完全干燥。（推荐使用冷冻干燥法）
- 加入50 μL PBS + 0.03% CHAPS，重新溶解干燥的肽段。
2. 肽段免疫亲和富集
- 将样品转移至标准的 Kingfisher 96 孔板中。
- 每个靶标加入 1 μg 抗体和 1.5 μL 蛋白G包被的磁珠（可选择在加入前将抗体交联至磁珠上）。通过振荡或涡旋确保磁珠充分悬浮。
- 用铝箔覆盖板孔。
- 在温和振荡条件下孵育过夜（12–16 小时），以确保磁珠保持悬浮状态。
- 将板以 32 × g 离心 5 秒，去除铝箔表面的液体。
- 移除铝箔盖。
- 磁珠的洗涤与洗脱可手动进行，也可自动化操作。本流程描述的是在 Kingfisher 平台上自动化的操作步骤。
- 用 200 μL PBS + 0.03% CHAPS 洗涤磁珠 2 次（每次洗涤 1 分钟）。
- 用 200 μL PBS + 0.03% CHAPS 的 1:10 稀释液洗涤磁珠 1 次（1 分钟）。
- 使用 25 μL 含 5% 乙酸 + 0.03% CHAPS 的溶液进行肽段洗脱。
- 将洗脱板置于磁架上，小心转移洗脱液至新的 96 孔板中，避免转移残留的磁珠。
- 用密封垫密封板孔。
- 含有洗脱液的板将被送至三重四极杆质谱仪进行分析。
3. 多重反应监测-质谱分析
- 用于SRM/MRM分析的跃迁可通过对含有30%乙腈/0.1%甲酸的1皮摩尔每微升肽标准品溶液进行质谱仪直接进样来选择和优化 0.5 μL/min喷雾稳定后，采集二级质谱（MS/MS）谱图。
- 通过在噪声较少的质谱区域中识别出三个丰度较高的碎片离子，从二级质谱（MS/MS）谱图中选择跃迁。对于多电荷肽离子，检测到的 y 离子碎片位于 m/z > 母离子 m/z 通常是进行 SRM/MRM 检测方法开发的最佳选择。 图2 显示 MS/MS 谱图及选定的过渡离子 476.3 > 508.3、579.3、692.4（重稳定同位素标准品481.3的跃迁） > 518.3、589.3、702.4（未显示）对应于肽段GDSLAYGLR。
- 根据所使用的质谱仪型号，每种离子转换均有多个可优化的参数。在此，我们通过梯度增加碰撞能量并监测信号强度，对每种选定离子转换的碰撞能量进行了优化。最终每种离子转换均采用25的碰撞能量。
- 简而言之，SRM/MRM 分析的典型配置如下：流动相（A）0.1% 甲酸；（B）90% 乙腈 / 0.1% 甲酸，0.3 x 5 mm C18 捕获柱， 75 μm ID x 15 cm C18 分析柱（Reprosil-Pur C18 AQ，120 Å）° 孔）。注射体积为 10 μL 样品在总流速下以3% B的条件加载5分钟 3 μL/min 以3–45%B的线性梯度在10分钟内以300–400 nL/min的流速洗脱。在4000 QTRAP（ABSCIEX，Foster City，CA）上的条件为喷雾电压2.3 kV，离子源温度 150 °C，第12个GS为GS1，帘气为15。
- 通过进样，采用选择反应监测/多反应监测（SRM/MRM）对样品进行分析 10 μL 样品的峰面积使用Skyline程序对轻链和重链肽段进行积分。14 使用背景噪声-free 的最丰富裂解峰（此处为 y5 裂解峰，轻肽 476.3）计算每个样品中未标记/标记肽的峰面积比（PAR） > 579.3，重标肽 481.3 > 589.3).
4. 代表性结果：
通过测量内源性轻肽与加入的重同位素标记肽的峰面积比值，可对目标肽段进行定量分析。图3展示了SISCAPA富集样品中轻肽和重肽的典型色谱图。请注意，轻肽和重肽在同一时间洗脱，且可对每种肽段监测多个跃迁离子对，以确认其身份。
图1. SISCAPA 流程的示意图。复杂的蛋白质混合物被消化成肽段。利用固定在蛋白G包被的磁性微粒上的抗肽抗体，富集目标肽分析物（内源性分析物和添加的稳定同位素标记的内标）。在分离后，目标肽段从磁性微粒上洗脱，并通过质谱分析，相对于内标进行定量。
图 2. 肽段 GDSLAYGLR 的 MS/MS 谱图，显示为 SRM/MRM 转换选择的三个碎片。
图3. 示例色谱图显示了轻链肽分析物（红色）和重链稳定同位素标记的内标物（蓝色）的峰形特征。图中展示了轻链肽的 y5 转换（476.3 > 579.3）和重链稳定同位素标记内标物（481.3 > 589.3）在洗脱过程中随时间变化的色谱曲线。
讨论
如文中所述，该实验方案中最关键的步骤是确保在孵育期间磁珠始终保持充分混匀。若允许磁珠沉降到孔板或小管底部，将导致实验变异性的增加。此外，在孵育结束后，必须离心去除可能残留在孔板或小管顶部的液体。可重复的胰蛋白酶消化同样至关重要。本研究所描述的消化程序已在本实验室与SISCAPA技术联合使用多年；然而，针对特定目标蛋白组，其他消化方法也可能经过优化后适用15。游离抗体的洗脱不会干扰肽段的检测，这可能是由于抗体被排除在色谱柱之外，或其洗脱时间晚于肽段；但在大规模实验中，或当游离抗体造成干扰时，可在亲和富集前将抗体交联至Protein G磁珠上。我们还发现，在自动进样器的样品板下方放置磁铁，以及以与上样相反的方向冲洗捕获柱，有助于去除任何残留的磁珠或颗粒物。除了本文所述的磁珠方法外，该技术也可适配为柱层析形式（即亲和层析）12, 16。
当用户熟悉整体实验方案后，该技术还可进行多种改进以提升整体检测效果11。首先，可在富集步骤中联合使用多种抗体，从而在单次检测中分析多个分析物（即多重检测）。质谱仪能够同时分析大量分析物。其次，增加原始样本的体积可提高检测的灵敏度。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家癌症研究所临床蛋白质组学技术评估中心（CPTAC）基金（编号：U24 CA126476）以及娱乐产业基金会（EIF）和EIF妇女癌症研究基金资助，资助对象为乳腺癌生物标志物发现联盟，同时感谢凯克基金会、坎纳里基金会和保罗·G·艾伦家族基金会的慷慨捐赠。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1000 µL 深孔96孔板 | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc 柱板，Sep-pak，40 mg 96孔板 | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96孔板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| 透明96孔，白色壁板 | Bio-Rad | HSP9601 | |
| 96孔板封口铝箔膜 | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat 96孔板密封垫 | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce 膜 | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| 配备PCR磁头的Kingfisher磁珠处理器 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| 表1：材料 | |||
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma 基础缓冲液（Trizma base） | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| 碘乙酰胺（IAM） | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| 蛋白G磁珠，2.8 µm | Invitrogen | 10004D | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| 甲酸 | EMD Millipore | 11670 | |
| 乙腈 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| 表2：试剂 | |||
| 100 mM Tris，pH 8 | |||
| 9 M 尿素 / 30 mM DTT 溶于 100 mM Tris（pH 8） | 每次使用前必须新鲜配制 | ||
| 500 mM IAM 溶于 100 mM Tris（pH 8） | 每次使用前必须新鲜配制 | ||
| 胰蛋白酶（Trypsin）1 mg/mL 溶于 100 mM Tris，pH 8 | |||
| 胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor）1 mg/mL 溶于 100 mM Tris，pH 8 | |||
| 稳定同位素标准母液混合物（Stable isotope standard mastermix） | |||
| 抗肽抗体母液混合物（Anti-peptide antibody mastermix） | |||
| 表3：需配制的溶液 |
参考文献
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