单个Drosophila小眼的解剖与成像

摘要

利用成年 Drosophila 眼研究神经变性和细胞生物学的主要限制因素是细胞内过程的成像困难。我们描述了单个单眼的解剖方法，以建立真正意义上的原代神经元细胞培养体系，该体系可用于药物处理和高级成像分析。

摘要

果蝇Drosophila melanogaster为神经科学研究做出了不可估量的贡献，因其强大的遗传学工具而被广泛用作神经退行性疾病的模型¹。其中，果蝇复眼尤其成为神经退行性研究的首选器官，因为它是Drosophila神经系统中最易接近且对生存非必需的部分。然而，完整复眼的主要局限在于，由于色素的强烈自发荧光，难以对自噬动态等细胞内事件²进行成像，而这些事件对于理解神经退行性过程至关重要。

我们最近采用了单个小眼的解剖与培养技术³，该技术对于理解齿状核-红核-苍白球-路易体萎缩症（DRPLA）果蝇模型中自噬功能障碍至关重要^{3, 4}。

本文现报告该技术的全面描述（图1），该技术改编自电生理学研究⁵，有望极大地拓展果蝇在神经退行性疾病模型中的应用前景。该方法可适用于活体观察亚细胞事件，并监测药物对感光细胞的有效递送（图2）。若与嵌合体技术结合使用^6-8，可同时平行检测遗传背景不同的细胞的反应（图2）。

方案

1. 解剖 果蝇 视网膜

1. 在3孔玻璃载片的一个孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS 1X），然后用CO₂麻醉果蝇。本实验可使用雄性和雌性果蝇。
2. 果蝇麻醉后，用镊子夹取一只果蝇，放入盛有PBS的小培养皿中。
3. 在解剖显微镜下，用镊子夹住果蝇的喙，再用另一把镊子剪断颈部，将头部与身体分离。
4. 用镊子夹住果蝇头部的喙部，用显微剪刀沿左右中线将头部纵向剪开，以暴露大脑。
5. 用剪去尖端的移液枪头挑起视网膜，并转移至3孔玻璃载片的另一个孔中，该孔预先加入Schneider培养基。
6. 首先剥离大部分头部头壳，然后用镊子取出大脑，保持视网膜夹在视网膜外层（lamina）与角膜之间。
7. 接着，将视网膜转移至直接滴加在玻璃载片上的新鲜Schneider培养基液滴（50 μl）中。

2. 小眼的解剖

1. 根据解剖的最终目的（是立即成像还是培养）以及荧光显微镜的光学类型（正置或倒置），此步骤可在载玻片上或24孔板中进行。就本解剖的最终目的而言，小眼将直接在玻璃载玻片上进行解剖。
2. 用镊子夹住视网膜的最背侧或腹侧末端，使用显微剪刀沿背腹中线将视网膜剪成两半，以暴露眼球中部的小眼结构。
3. 继续夹住视网膜，使角膜朝下、视神经叶（lamina）朝上。使用细钨针将小眼从视神经叶和角膜上分离下来。
4. 单个小眼或小眼群体会聚集在孔板底部或载玻片上。在继续操作前，清除可能积聚的任何较大碎片。

3. 处理、染色与成像

1. 为分析自噬，将Lysotracker在Schneider液滴中按1:1000比例稀释（先用Schneider液按1:10稀释，然后取0.5 μl加入载玻片上的液滴中），混匀后静置10秒。
2. 小心移除载玻片上多余的液体，注意保留眼小面结构。使用细尖的凝胶上样枪头操作效果最佳。
3. 加入一滴Vectashield以覆盖眼小面，盖上盖玻片，并用指甲油封片。

4. 代表性结果：

正确执行该方案后，应得到大量单个的小眼以及由视网膜碎片连接在一起的小眼小簇，但在角膜侧则清晰分离。这些结构可如本示例所示进行成像，以观察 Atg8:GFP 和溶酶体示踪剂（Lysotracker），从而显示自噬体、溶酶体及自噬溶酶体（图 3）。该方法可用于活体成像，但需注意 Schneider 培养基的自发荧光会干扰弱荧光信号的识别。另一个问题是，仍附着在光感受器上的色素颗粒具有强烈荧光，尤其在红色通道中明显。因此，可能需要拍摄明场图像以将其与真正的细胞器区分开来。

图1. 从果蝇视网膜中分离单个或少量小眼的解剖流程图。

图2. 该简易实验方案可能的变体包括在解剖和染色或培养（长达24小时）之前涉及果蝇遗传学与衰老的研究，以及在解剖之后进行药物处理。

图3. 来自一只 w; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP::Atg8/+ 果蝇的单个小眼（已表达多聚谷氨酰胺突变型Atrophin，并在29°C下培养12天）中自噬体与溶酶体的共聚焦扫描图像。右上角的明场图像显示了小眼几乎完整的结构，框线表示扫描区域。红色标记溶酶体，绿色标记自噬体，两种细胞器融合形成的自噬溶酶体呈黄色。箭头指示两个正在进行的自噬体与溶酶体融合事件。

讨论

本文介绍的单个小眼解剖技术能够获取关于神经变性等过程更深入的细胞生物学信息，这些过程可在Drosophila eye中建模研究。感光神经元比其他神经元更容易获取，且其细胞质特别丰富，因此非常适合在活体in vivo中用于量化神经变性的同一类细胞中研究囊泡动态。该解剖技术的关键在于必须对未固定的组织进行操作，且组织绝不能暴露于空气中或干燥。该基础技术具有广泛的拓展可能性（图2），有望彻底改变从神经变性眼部模型中获得的信息，使初级神经元培养中可行的各种操作与果蝇中卓越的遗传修饰能力相结合成为可能。

结合在神经退行性研究中极为有用的嵌合技术⁹，该方法可能实现在同一果蝇体内，于野生型对照存在的条件下，鉴定特定突变小眼细胞中的细胞生物学改变。

将解剖得到的单眼小体在体外培养时，对雷帕霉素¹⁰或百草枯¹¹等药物的反应相比在活体果蝇中给药更易于控制和定量。该系统的主要局限在于解剖后单眼小体在培养中的存活时间，目前我们尚未能将其显著延长至24...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
便携式 CO2 分配器	Flystuff	59-150	也可购买补充装
DUMONT 镊子 No 5	Agar Scientific	T5034
三孔玻璃载片	EMS	71561-01
微型剪刀	VWR international	HAMMHSB516-09
Schneider’s Medium	VWR international	733-1663
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
Superfrost 载玻片	VWR international	631-0108
含 DAPI 的 Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
盖玻片	VWR international	631-1336