使用人血管周围干细胞进行骨再生

摘要

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

摘要

人类血管周围干细胞（PSCs）可从多种组织中分离获得足够数量，用于骨骼组织工程^1-3。PSCs 是通过 FACS 分选获得的“周细胞”（CD146+CD34-CD45-）和“外膜细胞”（CD146-CD34+CD45-）的混合群体，我们此前已报道这两类细胞均具有间充质干细胞的特性。与间充质干细胞（MSCs）类似，PSCs 能够进行成骨分化，并分泌促成骨细胞因子^1,2。在本实验方案中，我们通过多种动物模型展示了 PSCs 的成骨能力，包括在 SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠中进行肌肉袋植入、SCID 小鼠颅骨缺损模型以及无胸腺大鼠的股骨节段性缺损（FSD）模型。大腿肌肉袋模型用于评估异位骨形成能力。颅骨缺损位于顶骨中央，标准直径为 4 mm（临界尺寸）⁸。FSD 为贯穿皮质骨的缺损，使用聚乙烯条和克氏针进行固定⁴。所描述的 FSD 同样属于临界尺寸缺损，无法自行实现显著愈合⁴。相比之下，若在缺损部位植入干细胞或生长因子，则可观察到明显的骨再生。PSC 异种移植的总体目标是验证该细胞类型在异位和原位骨再生模型中的成骨潜能。

方案

1. 血管周围干细胞的分离

这在M. Corselli撰写的相邻文章《从人白色脂肪组织中分离血管周围干细胞》中有详细描述。 等

2. 支架制备

1. 支架根据已发表的方案定制，采用聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA，Burmingham Polymer）制备，并涂覆羟基磷灰石^4-6采用溶剂浇铸和颗粒沥滤法制备由85/15 PLGA制成的磷灰石涂层PLGA支架。支架可制成球形（直径2 mm），用于肌肉袋植入；盘状（直径4 mm），用于颅骨植入；或圆柱形（直径4 mm，长度6 mm），用于股骨节段性缺损。
2. 简而言之，将PLGA/氯仿溶液与蔗糖混合（聚合物/蔗糖质量比为5/95），浇铸至200-300-μm 直径Teflon模具以制备定制的支架结构。在冷冻干燥过夜后，将支架从Teflon模具中取出并浸入ddH₂O中。₂O以溶解蔗糖。支架通过浸入70%乙醇中消毒30分钟，随后用ddH₂O冲洗三次。₂O.
3. 为了进行磷灰石涂层，通过依次溶解 CaCl₂·2H₂O 和 Na₂HPO₄·2H₂O，制备模拟体液（SBF）溶液。₂，MgCl2•6H₂O, NaHCO₃₃，以及 K₂HPO₄•3H₂ddH₂O 中₂O. 加入 1 M 盐酸将溶液 pH 降至 6，以提高溶解度。Na₂SO₄，加入 KCl 和 NaCl，并将最终 pH 值调节至 6.5（SBF 1）。
4. Mg2+ 和 HCO₃- 通过添加 CaCl₂ 制备无蛋白质 SBF（SBF 2）₂ 和 K₂HPO₄•3H₂ddH₂O 中₂O₂ 并将 pH 调至 6。加入 KCl 和 NaCl，最终 pH 调整至 6.8。所有溶液均通过无菌滤膜过滤 0.22 μm PES 膜（Nalgene）。在涂覆过程开始前，需立即对干燥的 PLGA 支架进行辉光放电氩等离子体刻蚀处理（Harrick Scientific），以改善润湿性和涂覆均匀性。
5. 蚀刻后的支架在 SBF 1 中孵育 12 小时，随后更换为含 Mg2+ 和 HCO₃- 在无 SBF 2 的条件下继续孵育 12 小时 37 °C 在温和搅拌下进行。用ddH₂O洗涤包被的支架₂O 以去除多余的离子，并在进一步研究前进行冻干处理。

3. 肌肉囊模型植入

1. 在植入前立即向基于PLGA的球形植入物上轻轻滴加100 μl PBS（磷酸盐缓冲液）中的PSC悬液。细胞已通过慢病毒插入萤光素酶（Firefly luciferase）进行预标记，以便植入后进行活体追踪。细胞密度为每植入物2.5 × 10⁵。
2. 使用6周龄的SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠。动物通过吸入异氟烷麻醉，并以布托啡诺（buprenorphine，Bedford Labs）进行术前给药。常规使用聚维酮碘（Betadine）准备后，在后肢做双侧切口（纵向，长度2 mm）。
3. 沿股二头肌肌纤维长轴方向，通过钝性分离切开肌内 pockets。每只小鼠植入一个含PSCs的基于PLGA的植入物，并用5-0 Vicryl（Ethicon）缝合覆盖肌肉的筋膜。
4. 随后以5-0 Vicryl采用皮下缝合方式关闭皮肤。动物术后接受布托啡诺治疗48小时，以及TMP/SMX（甲氧苄啶/磺胺甲噁唑；Trimethoprim/Sulfamethoxazole；Qualitest）治疗10天。

4. 颅骨缺损模型植入

1. 按照方案，对12至14周龄的SCID小鼠进行异氟烷麻醉后，剪除毛发并用聚维酮碘消毒皮肤。
2. 沿小鼠颅骨矢状缝做8 mm的皮肤切口，随后用棉签轻轻去除颅骨骨膜。
3. 接着，使用金刚石涂层 trephine 钻头在高速牙科钻上制备4 mm的顶骨缺损。该缺损为全层厚度，但需注意避免损伤下方的硬脑膜。
4. 然后将含有植入PSCs的定制PLGA基植入物轻柔地放置于缺损部位，每个植入物的细胞密度为2.5 × 10⁵。最后用6-0 Vicryl缝合皮肤。术后动物接受丁丙诺啡镇痛治疗48小时，并给予TMP/SMX治疗10天。

5. 股骨节段性缺损模型植入

1. 在异氟烷吸入麻醉下，对12-14周龄的无胸腺大鼠进行麻醉。按照标准程序使用聚维酮碘对股骨进行消毒准备（图1）。
2. 在股骨前外侧区域做一条27-30毫米的纵向切口。通过分离股外侧肌和股二头肌暴露股骨干（图2）。
3. 为最大程度保证骨再生的一致性，随切除的股骨节段一并完全去除覆盖在股骨缺损区的骨膜。
4. 将一块聚乙烯板（长度23毫米，宽度4毫米，高度4毫米）置于股骨前外侧表面。该板上设有六个预钻孔，用于固定直径0.9毫米的带螺纹克氏针（Zimmer）。以该板为模板，将六根带螺纹克氏针穿过钢板并贯穿双侧皮质（图3）。
5. 随后，使用小型摆动锯片（Stryker, MI）制造一个6毫米的股骨中段骨干缺损。通过插入按协议负载细胞的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）基植入物来处理节段性缺损（图4）。
6. 用4-0 Vicryl可吸收缝线缝合覆盖的肌肉和筋膜，以固定植入物，并缝合皮肤。

6. 体内 评估

1. 采用高分辨率 X 射线（XR）和高分辨率 μCT（微型计算机断层扫描）进行纵向放射学评估。μCT 分析（Skyscan 1172F）的扫描分辨率为 19.73 μm（使用 100 kV 和 100 mA 的辐射源，配备 0.5 mm 铝滤膜）。图像分析使用 DataViewer、Recon、CTAn 和 CTVol 软件完成。
2. 通过连续进行的生物发光成像评估细胞移植后的植入、存活、增殖情况，并排除细胞从植入部位迁移的可能性。生物发光成像使用 IVIS Lumina II 设备（Caliper Life Sciences）完成。光输出量通过 Living Image 软件（Xenogen）进行定量，总光输出以 光子/秒/平方厘米/球面度（photons/second/sq cm/steradian）记录。
3. 组织学与组织形态计量学分析在动物死亡后进行。常规染色方法包括 Masson 三色染色、苯胺蓝染色、五色染色以及苦味酸-天狼星红染色。使用苯胺蓝或五色染色可方便地进行组织形态计量分析，其中类骨质分别呈深蓝色和黄色。高倍视野下的像素数量通过 Adobe Photoshop 中的魔棒工具进行计算。

7. 代表性结果

由于颅骨和股骨缺损均为临界尺寸，若不使用生长因子或外源性干细胞进行治疗，不应期待有显著的愈合。

在手术操作方面，肌肉袋分离应沿筋膜平面进行，因此出血量应极少。尽管肌肉袋模型为双侧操作，小鼠在术后第1天应能轻松行走。对于颅骨缺损模型，可能会有出血，可用棉签吸除。需格外注意避免损伤下方的硬脑膜，否则将干扰正常愈合过程。在FSD模型中，应注意避免损伤主要血管，以防止大量出血，同时避免损伤股神经以预防神经损伤。使用克氏针钻孔时应施加轻柔压力，避免在此过程中损伤皮质骨。

图 1. 裸鼠股骨节段性缺损（FSD）术前准备。雄性大鼠（12–14 周龄）通过吸入异氟烷进行麻醉。按照标准操作规程，使用聚维酮碘对股骨区域进行清洁和消毒处理。

图 2. 股骨节段性缺损（FSD）造模的手术暴露。在股骨前外侧做一长度为 27–30 mm 的纵行切口。通过分离股外侧肌和股二头肌暴露股骨干的外侧部分。

图3. 股骨节段性缺损（FSD）构建的固定方法。将一块聚乙烯板（长度23 mm；宽度4 mm；高度4 mm）置于股骨前外侧表面。该板上设有六个预钻孔，用于插入直径0.9 mm的带螺纹克氏针。以该板作为模板，将六根带螺纹克氏针穿过板及股骨双侧皮质。随后，创建一个6 mm的骨干中段缺损。完成此步骤后，直接植入定制支架，该支架与缺损部位完全匹配（图中未显示）。

图4. 颅骨缺损术后示例。在无胸腺小鼠的右侧顶骨上创建一个直径4 mm的圆形颅骨缺损。此处显示的是术后8周植入多能干细胞（PSCs）的缺损部位。请注意缺损区域内有新骨形成。

讨论

多能干细胞（PSCs）的分离方法在其他文献中已有详细描述^1-3，包括一篇专门提交的 JoVE 文章，重点介绍 PSC 分离方案与方法。本文的具体目的是描述并演示三种 PSC 分离方案 体内 骨形成/再生应用。SCID小鼠肌肉袋模型是常用于异位人骨形成的模型⁷在骨组织研究中，异位模型与原位（缺损）模型之间存在重要差异，包括与宿主成骨细胞的旁分泌相互作用⁸ 以及骨骼缺损微环境中存在的大量成骨信号因子。本文介绍了两种缺损模型：颅骨缺损和股骨节段性缺损⁴两者均有充分文献记载为临界尺寸缺损（即无法自行愈合）。

颅骨缺损与股骨缺损之间存在显著差异。首先，异种移植的PSCs与内源性细胞之间的细胞-细胞相互作用截然不同。在颅骨缺损中，PSCs会与下方的硬脑膜（脑膜的最外层）以及环绕缺损区域的成骨细胞和骨膜细胞发生相互作用。重要的是，移植细胞与周围成骨细胞⁸之间的相互作用，或移植细胞与下方硬脑膜之间的相互作用（Levi et al.，待发表）对于干细胞介导的正常成骨过程至关重要。而在股骨节段性缺损（FSD）中，异种移植的PSCs所处的细胞和细胞因子环境则完全不同。例如，FSD部位包含骨髓及其伴随的间充质干细胞，以及骨内膜、骨膜和长骨成骨细胞。理论上，每种细胞对损伤都有其独特的反应，并且每种细胞都可能与PSC异种移植物发生细胞-细胞相互作用。

颅骨缺损与股骨缺损之间还存在其他明显差异。颅骨最初通过膜内成骨形成，而长骨则通过软骨中间阶段（软骨内成骨）形成。此外，损伤后的修复过程也模仿了这些发育起源。股骨缺损术后（FSD后）可观察到软骨痂的形成，而在顶骨缺损中则不会形成软骨中间阶段。最后，颅骨的胚胎起源可能与长骨不同。大部分颅骨（包括头部整个区域的血管周围细胞——周细胞）来源于神经嵴（中胚外胚层），而附肢骨骼则来源于轴旁中胚层⁹。这些差异可能导致PSC介导的骨修复在不同部位产生显著差异。

与传统的脂肪来源基质细胞（ASCs）相比，PSCs 的使用具有多项优势。PSCs 无需体外培养，且为纯化的细胞群体，不包含其他不参与成骨分化、甚至可能负向调控成骨分化的基质细胞，例如内皮细胞¹⁰。相比之下，例如对 ASCs 的克隆分析表明，仅有一部分亚群能够在体外进行成骨分化in vitro¹¹。最终，骨骼组织工程策略很可能会将具有成骨能力的干细胞（如 PSCs）、外源性生长因子以及成骨传导性支架（如本方法中使用的 HA-PLGA）相结合，以实现骨骼缺损的最佳修复。