通过RNA文库筛选分离出多个针对HIV-1Ba-L gp120、具有纳摩尔亲和力的2’-氟代RNA适配体 体外 SELEX 流程。一种新型双抑制功能抗 gp120 适配体-siRNA 嵌合体被成功构建，在全身性抗 HIV 治疗中展现出显著潜力。
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摘要
摘要
艾滋病病毒（HIV）感染的全球流行使得开发新型抗逆转录病毒药物变得尤为紧迫。小干扰RNA（siRNA）能够有效抑制互补RNA转录本的表达，这一特性正被开发为治疗包括艾滋病在内的多种疾病的一类新型治疗手段。以往许多研究已表明，基于RNA干扰（RNAi）的抗HIV/AIDS治疗策略具有广阔的应用前景；然而，siRNA在治疗应用及临床转化中的一个关键障碍是其递送效率。特别是考虑到RNAi疗法的安全性与有效性，开发一种能够靶向特定细胞群体或组织的细胞内siRNA递送方法显得尤为重要。HIV-1的gp120蛋白是存在于病毒表面的一种糖蛋白包膜成分，在病毒进入CD4细胞的过程中发挥关键作用。gp120与CD4受体的相互作用可触发HIV-1进入细胞并启动细胞融合，该过程已被证实为药物研发中具有临床相关性的抗病毒策略靶点。
本文首先讨论2'-F修饰的抗HIV gp120 RNA适体的筛选与鉴定。采用传统的硝酸纤维素膜筛选（SELEX）方法，从一个包含50个随机核苷酸的RNA文库中分离出多个具有纳摩尔亲和力的新适体。为了成功获得亲和力更高的结合物种，通过精确调控筛选条件以严格控制筛选的严谨性。所筛选出的适体能够特异性结合并快速被表达HIV-1包膜蛋白的细胞内化。此外，这些适体本身即可中和HIV-1的感染性。基于最优适体A-1，我们还构建了一种新型的双功能抑制性抗gp120适体-siRNA嵌合体，其中适体部分和siRNA部分均具有强效的抗HIV活性。进一步地，我们利用gp120适体-siRNA嵌合体实现将siRNA特异性递送至HIV-1感染的特定细胞类型。这种双功能嵌合体在联合应用多种核酸治疗剂（适体与siRNA）以抑制HIV-1感染方面展现出巨大潜力，使适体-siRNA嵌合体成为对高效抗逆转录病毒治疗（HAART）失败患者极具吸引力的治疗候选方案。
方案
1. RNA文库的制备
- 起始DNA文库包含50个核苷酸的随机序列，由Integrated DNA Technologies（爱荷华州科拉尔维尔）合成。单链DNA寡核苷酸文库序列为5'- GGG AGG ACG ATG CGG - N50- CAG ACG ACT CGC CCG A - 3'（81 nt）。该随机区域两侧为恒定区，其中包含用于T7启动子的序列 体外 转录以及用于RT-PCR的3'标签。5'和3'恒定序列分别为5' – TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3'（32 mer）和5' -TCG GGC GAG TCG TCT G - 3'（16 mer）。用水配制贮存液，并分装后于-80℃保存。20°C.
- 扩增单链DNA寡核苷酸随机文库（0.4 μM通过PCR使用 3 μM 5'-和3'-引物各一条，以及2 mM MgCl₂2 和 200 μM 每种dNTP。为了保持原始DNA文库的丰度，将PCR循环次数限制在10个循环。PCR反应结束后（共10个反应， 100 μL 每次反应），使用 QIAquick Gel 纯化试剂盒（QIAGEN）回收扩增的双链DNA产物。
- 使用 DuraScription 试剂盒（Epicentre，Madison，WI）按照制造商说明书将所得的 dsDNA 转化为 RNA 文库。在转录反应体系中，用 2'-F-CTP 和 2'-F-UTP 替代 CTP 和 UTP，以生成抗核糖核酸酶的 RNA。通常情况下，准备 20 μL 反应体系 包含 1 μg 纯化的DNA模板 2 μL 10 x 缓冲液， 2 μL dATP, 2 μL dGTP, 2 μL 2'-F-dCTP 2 μL 2'-F-dUTP 2 μL DTT 和 2 μL T7 RNA 聚合酶在室温下反应，然后孵育 37°C 6小时。（每种dNTP为50 mM。）
- 随后用 DNase I 消化反应体系（1.5 μL 每20-μL T7 转录反应）以去除模板 DNA，并通过 8% 聚丙烯酰胺/7 M 尿素凝胶进行纯化。使用紫外分光光度法对纯化的 RNA 文库进行定量。
2. 体外 适配体的制备
- 筛选前，准备筛选缓冲液和复性缓冲液。配制含有100 mM Hepes（pH 7.4）的HEPES缓冲液，用NaOH调节pH值，然后室温保存。配制RNA复性缓冲液（5xHBS），其中含50 mM Hepes（pH 7.4）、750 mM NaCl、5 mM MgCl2、5 mM CaCl2、13.5 mM KCl。配制低盐RNA结合缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，50 mM NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2.7 mM KCl，10 mM DTT，0.01% BSA）和高盐RNA结合缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2.7 mM KCl，10 mM DTT，0.01% BSA）。将这些缓冲液储存于-20°C。
- SELEX实验主要按文献所述方法进行1-4。每轮筛选前，将RNA文库在1xHBS缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2.7 mM KCl）中进行复性，95 °C加热3分钟，然后缓慢冷却至37°C。继续在37°C孵育10分钟。
- 通常，为了尽量减少与硝酸纤维素膜的非特异性结合，在与靶标HIV-1Bal gp120蛋白孵育之前，先将复性后的RNA文库预吸附于硝酸纤维素膜（HAWP滤膜，0.45 μm）上30分钟。
- 在第1至第4轮SELEX中，将预清除的RNA文库与靶蛋白在低盐RNA结合缓冲液中孵育30分钟。自第4轮SELEX起，改用高盐RNA结合缓冲液。随着SELEX进程推进，逐步减少gp120蛋白用量并增加竞争性酵母tRNA的浓度，以提高适配体筛选的严谨性。
- 在第一轮筛选中，将预清除的随机RNA文库（40 μg，1.5 nmol，9×1014个分子）与HIV-1Bal gp120蛋白（0.23 nmol，RNA/蛋白摩尔比为6.5:1）在200 μL低盐RNA结合缓冲液中混合，于室温旋转平台上孵育30分钟。
- 将反应液通过预先润湿的硝酸纤维素膜，并用1 mL结合缓冲液洗涤。
- 用200 μL洗脱缓冲液（7 M尿素和5 mM EDTA）在95 °C洗脱膜上结合的RNA 5分钟，随后进行酚/氯仿抽提，并使用Microcon YM-30柱浓缩。
- 使用ThermoScript RT-PCR系统（Invitrogen）对回收的RNA文库进行逆转录，并进行15个循环的PCR扩增。
- 使用QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化扩增后的双链DNA文库，并如上所述进行转录，用于下一轮筛选。
3. 通过滤膜结合实验监测SELEX进程
- 通过滤膜结合实验监测适配体的SELEX进程。用CIP处理RNA文库，去除起始的5'-三磷酸，然后用T4多聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP进行标记。
- 将10 pmol经CIP处理的RNA文库在95°C加热5分钟，随后置于冰上冷却。接着加入2 μL PNK缓冲液、1 μL T4多聚核苷酸激酶、1 μL γ-P32-ATP，并加水至终体积20 μL。
- 在37 °C孵育30分钟，然后加入20 μL水，并通过G-50柱纯化反应产物。最终获得40 μL标记的RNA，终浓度为250 nM。
- 实验前，在1xHBS缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，2.7 mM KCl）中对标记的RNA文库进行重折叠：95 °C加热3分钟，然后缓慢冷却至37°C。继续在37°C孵育10分钟。
- 以100 μL结合反应为例。将末端标记的RNA文库（10 nM）与gp120蛋白（100 nM）以及10倍摩尔过量的非特异性竞争tRNA（100 nM）在高盐RNA结合缓冲液中于37°C孵育30分钟。
- 取50 μL结合反应液，通过预先润湿的硝酸纤维素滤膜进行分离。
- 用2 mL结合缓冲液洗涤滤膜，并使用多功能闪烁计数器（Beckman Coulter）测定滤膜上保留的放射性。同时，对剩余的50 μL结合反应液进行计数作为输入对照。以滤膜上保留的RNA占输入RNA的百分比计算结合亲和力。
4. 克隆、测序与序列比对
- 经过11轮筛选后，若即使继续增加筛选轮次仍无法观察到进一步的富集，则RNA文库的结合可能已达到饱和。
- 逆转录高度富集的适配体文库（12th 使用ThermoScript RT-PCR系统（Invitrogen）对RNA混合物进行反转录，随后通过PCR扩增获得的cDNA。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒（QIAGEN）纯化PCR产物。将凝胶纯化的DNA产物克隆至TA克隆载体pCR 2.1（Invitrogen）中。共接种170个单克隆，并通过DNA测序鉴定，以获得各自的序列。
- 根据各个适配体序列的比对结果，将单个克隆分为六个不同的组。从每组中选择一个代表性序列（A-1、A-5、A-9、A-12、A-28 和 B-68）进行进一步表征，因其在各自组内相对丰度较高。
5. 通过以下方法生成适配体和嵌合RNA 体外 转录
- 使用 2 μM 的 5'-和 3'-引物、2 mM MgCl2 以及每种 dNTP 200 μM，通过 PCR 直接生成双链 DNA 模板，并使用 QIAquick Gel 纯化试剂盒回收所得的 PCR 产物。
- 使用 DuraScription 试剂盒（Epicentre，Madison，WI）从 PCR 生成的 DNA 模板转录嵌合体正义链。在转录反应体系中，用 2'-F-CTP 和 2'-F-UTP 替代标准的 CTP 和 UTP，以产生对 RNase A 降解具有抗性的 RNA。
- 通常，在含有 1 μg DNA 模板、2 mL 10x 缓冲液、2 μL dATP、2 μL dGTP、2 μL 2'-F-dCTP、2 μL 2'-F-dUTP、2 μL DTT 和 2 μL T7 RNA 聚合酶的 20 μL 反应体系中，于 37 °C 孵育 6 小时，随后经酚抽提和乙醇沉淀后，使用 Bio-Spin 30 柱（Bio-Rad）进行纯化。
- 为避免干扰素反应，需进一步用 CIP 处理转录得到的 RNA，以去除起始的 5'-三磷酸基团。将总共 60 μL 的反应体系（含 3 μg 转录本、6 μL Buffer 3 和 0.25 μL CIP）于 37 °C 孵育 60 分钟。经酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，将 RNA 沉淀重悬于水中。
- 为制备嵌合体，将仅含有正义链 RNA 的嵌合体与相应的反义 RNA 在复性缓冲液中混合，加热至 95 °C 持续 3 分钟，然后缓慢冷却至 37 °C。继续在 37 °C 孵育 10 分钟。在最终浓度为 1xHBS 的缓冲液中进行复性步骤。例如：将 10 μL 10 μM 嵌合体正义链、10 μL 10 μM 反义链和 5 μL 复性缓冲液（5xHBS）混合至 25 μL 体系中。
6. 通过凝胶迁移实验测定解离常数
- 对每组中的代表性适配体及嵌合体正义链进行 P32 末端标记，并如上所述在 1xHBS 缓冲液中重新折叠 RNA。
- 通过混合 2.5 mL 10xTBE 缓冲液、3.125 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、19.375 mL 水、150 μL 10% 过硫酸铵（APS）溶液和 30 μL TEMED，配制 25 mL 的 5% 凝胶。凝胶应在约 30 分钟内完成聚合。小心移除梳子，并使用装有针头的 30 mL 注射器用电泳缓冲液（1xTBE）冲洗加样孔。
- 完成凝胶装置的组装并连接至电源。可在 4°C 条件下以 180 V 预电泳 1 小时。
- 用结合缓冲液将 HIV-1Bal gp120 蛋白连续稀释至所需浓度。gp120 的终反应浓度分别为 0、1、5、10、20、40、80、160、320、640 nM。在总反应体积为 20 μL 的结合缓冲液中，将固定量的 5'-P32 末端标记 RNA（10 nM）与递增浓度的 gp120 蛋白在室温下于旋转平台上孵育 30 分钟。
- 孵育结束后，将 20 μL 结合反应液与 5 μL 天然上样缓冲液混合，上样至 5% 非变性聚丙烯酰胺凝胶中。配制天然上样缓冲液（4x）：含 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA、0.1% 溴酚蓝、0.1% 二甲苯蓝 FF、0.1% 橙黄 G、40% 甘油。分装后于 -20°C 保存。
- 电泳完成后（在 4°C 下以 180 V 电泳 2 小时，直至次级染料迁移至凝胶中部），将凝胶暴露于磷屏，并使用 Typhoon 扫描仪对放射性信号进行定量分析。
- 使用 Graph Pad Prism 软件通过非线性曲线回归计算解离常数。
7. 通过流式细胞术进行细胞表面结合研究
- 使用 Silencer siRNA 标记试剂盒（Ambion）生成荧光标记的适配体及其嵌合体。按以下顺序加入试剂：22.5 μL 无核酸酶水；5 mL 10×标记缓冲液；15 μL RNA（5 μg）；7.5 μL 标记染料。将总体积为 50 μL 的标记反应体系在 37°C 下孵育 1 小时。
- 孵育结束后，加入 5.0 μL（0.1 体积）5 M NaCl 和 125 μL（2.5 体积）预冷的 100% 乙醇，充分混匀。在 -20°C 下孵育 60 分钟。在 4°C 下以最高速度离心 20 分钟。弃去上清液，并用 175 μL 70% 乙醇洗涤沉淀。在避光条件下将沉淀空气干燥，然后将其悬浮于 15 μL 无核酸酶水中。
- 测定标记 RNA 在 260 nm 处以及荧光染料最大吸收波长处的吸光度。根据 http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html 提供的计算器计算碱基与染料的比率及 RNA 浓度。
- 将 Cy3 标记的嵌合体正义链与反义链混合，并如上所述在复性缓冲液中进行复性。
- 通过艾滋病研究与参考试剂项目5, 6获取表达 gp160 的 CHO-WT 细胞和 CHO-EE 对照细胞。在 GMEM-S 培养基（谷氨酰胺缺陷型最低必需培养基，含 400 μM 甲硫氨酸亚砜胺（MSX））（Gibco, Invitrogen）中培养细胞。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中培养。
- 用预热的洗涤缓冲液洗涤 CHO-WT gp160 或 CHO-EE 对照细胞，胰酶消化并从培养板上脱离。用 500 μL 结合缓冲液洗涤细胞两次后，将细胞沉淀重悬于结合缓冲液中，并在 37°C 下孵育 30 分钟。离心收集细胞，然后将其重悬于 50 μL 预热的结合缓冲液中，其中含有 400 nM Cy3 标记的实验 RNA。
- 在 37°C 孵育 40 分钟后，用 500 μL 预热的结合缓冲液洗涤细胞三次，最后将细胞重悬于 350 μL 预热至 37°C 的结合缓冲液中，并立即进行流式细胞术分析。
8. 活细胞共聚焦显微镜观察内吞作用与细胞内定位
- 在检测前一天，将CHO-WT gp160和CHO-EE对照细胞以0.3×10⁵的密度接种于35 mm培养皿中进行培养。6 在2 mL GMEM-S培养基中培养，使24小时内达到约70%融合度。
- 实验当天，用1 mL预热的PBS洗涤细胞，然后加入1 mL预热的完全培养基，在30分钟内于 37°C.
- 制备Cy3标记的适配体-siRNA嵌合体，方法如上所述。将复性后的适配体-短链与含有5'-Cy3标记正义链的siRNA-短链孵育，以形成适配体-短链-siRNA偶联物，具体方法如上所述。
- 在检测前，将Hoechst 33342（活细胞核染料，Molecular Probes, Invitrogen, CA）配制成0.15 mg/mL的水溶液，并分装保存于 4°C.
- 用 0.15 mg/mL Hoechst 33342 处理细胞，染色 15 分钟 37°C立即用1.0 mL新鲜培养基洗涤两次以去除染料，并更换2 mL预热的新鲜培养基。
- 将Cy3标记的适配体-siRNA嵌合体加入培养基中，使其终浓度为100 nM，并在5% CO2显微镜培养箱中孵育，用于活细胞共聚焦显微镜观察 37 °C.
- 每15分钟使用蔡司LSM 510 Meta倒置双光子共聚焦显微镜系统，在40倍水浸条件下采集图像。
9. 体外 HIV-1 攻毒与 p24 抗原检测
- 从 ATCC 购买 CCRF-CEM 细胞。使用添加了 10% 胎牛血清（FBS，HyClone）、L-谷氨酰胺和 1× 青霉素-链霉素（Gibco，Invitrogen）的 RPMI-1640 培养基（Cellgro，Mediatech Inc.）进行培养。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱中培养。
- 从希望之城国家医学中心（临床工作人员）获取健康供体的外周血单个核细胞样本。
- 通过 Ficoll-Hypaque 溶液（Histopaque-1077，Sigma）离心分离全血中的 PBMC。使用 Dynabeads CD8（Invitrogen，CA）从 PBMC 中去除 CD8 阳性细胞（细胞毒性/抑制性 T 细胞）。
- 在 T 细胞活性培养基（BioE，St. Paul，MN）中培养细胞。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱中培养。
- 从艾滋病研究与参考试剂项目获取 HIV-1 IIIB 和 NL4-3 病毒以及 HIV-1 Bal 病毒。病毒扩增后，分装保存于 -80°C。
- 用 HIV 病毒（IIIB、NL4-3 或 Bal）以 MOI 0.001 或 0.005 感染 CCRF-CEM 细胞或人 PBMC。感染后 24 小时，用 PBS 轻柔洗涤细胞三次以去除游离病毒。继续将感染细胞置于 37°C、含 5% CO2 的显微镜培养箱中培养 4 天。
- RNA 处理前，用 PBS 轻柔洗涤感染细胞三次以去除游离病毒。在 96 孔板中，将 2×104 个感染细胞和 3×104 个未感染细胞与重折叠的实验性 RNA 在 400 nM 的终浓度下于 37°C 共同孵育（每孔 100 μL，三链体实验）。
- 在不同时间点（第 3、5、7 和 9 天）收集培养上清液（每孔 10 μL），并于 -20°C 保存直至进行 p24 检测。
- 使用 HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒进行 p24 抗原分析。
10. 通过定量RT-PCR检测siRNA功能
- 用HIV病毒（IIIB、NL4-3或Bal）感染CCRF-CEM细胞或人外周血单个核细胞（PBMCs），并按照上述方法加入实验性RNA（400 nM）进行处理。
- 处理7天后，离心收集细胞，使用STAT-60提取总RNA。用DNase I处理总RNA以去除基因组DNA，并使用2 μg总RNA反转录生成cDNA。
- 混合以下试剂：8 mL无核酸酶水；1.5 mL 10 x DNase缓冲液；4 μL RNA（2 μg）；0.5 μL RNase抑制剂和1.0 μL无RNase的DNase I。将总体积为15 μL的反应体系在37°C孵育1小时，然后在80°C加热10分钟以灭活DNase I。立即置于冰上冷却。
- 向上述反应体系中加入2 μL随机引物（50 ng/μL）和1 μL dNTP（10 mM），在65°C加热5分钟。立即置于冰上冷却。
- 加入以下试剂：5 mL 5x第一链缓冲液；2.5 mL 0.1 M DTT；0.5 mL RNase抑制剂和1.0 mL MMLV-RT。将总体积为27 mL的反应体系在25°C孵育10分钟，然后在37°C孵育1小时。反应结束后，在70°C加热15分钟以灭活逆转录酶，随后置于冰上冷却。所得cDNA可用于qRT-PCR分析。
- 使用2 x iQ SyberGreen Mastermix和特异性引物组（终浓度为400 nM，三重检测）通过定量RT-PCR分析目标基因的表达水平。以GAPDH的表达作为内参，对qPCR数据进行标准化。
11. 代表性结果：
1. 针对HIV-1BaL gp120的新型RNA适配体被分离并进行表征。
如实验部分所述，初始DNA寡核苷酸文库包含一个50 nt的随机区域，其两端分别被5'和3'端的固定引物区域所包围，该文库被扩增并转录成RNA文库。此初始文库包含多达1015种不同的序列（1 nmol），可折叠形成大量不同的三维结构。初始文库的高度复杂性和多样性可能确保其中存在对靶标具有较强结合亲和力的活性结构。
采用 体外 SELEX 实验流程（图1) 筛选可特异性结合R5型HIV-1的2'-氟代嘧啶修饰RNA适配体BaL gp120 包膜蛋白7如图所示 图1采用基于硝酸纤维素膜的筛选策略，从非结合性RNA分子中分离特异性靶标结合RNA。由于蛋白质可吸附于硝酸纤维素膜上，只有RNA/蛋白质复合物或聚集体能够滞留在膜上，而游离的RNA则被洗脱。在变性条件下，回收结合的RNA，将其逆转录为cDNA，再扩增生成双链DNA，随后 体外 转录以生成新的RNA文库用于下一轮筛选。通过减少靶蛋白的用量并增加竞争性tRNA的用量来提高筛选严格性。每轮筛选中所使用的RNA文库、蛋白和竞争性tRNA的量如表所示 表1.
通过滤膜结合实验监测每轮SELEX筛选后筛选进程的进展。以保留在滤膜上的RNA占总RNA文库的百分比来评估结合亲和力。起始RNA文库（1-RNA）仅有0.1%的输入RNA保留在膜上。然而，经过九轮筛选后，第九轮RNA文库（9-RNA）有9.72%的输入RNA被结合。尽管后续继续进行了额外的筛选轮次，但未观察到进一步富集，表明RNA文库的结合能力已达到最大值（图2A）。与滤膜结合实验类似，凝胶迁移实验也是测定解离常数最常用的方法之一。该方法操作简便、易于实施。如图2B所示，凝胶迁移实验进一步验证了各RNA文库的结合活性。这些结果表明，在这些RNA文库中，针对目标蛋白具有高结合特异性的部分配体被成功富集。
克隆并测序高度富集的适配体文库（12-RNA）。根据各个克隆的适配体序列比对结果，可将其分为六组，如表2所示。约40%的克隆（第I组和第II组适配体）包含一个保守序列：A(A/G)TTGAGGGACC(A/G)。由于这些序列在其各自组中相对丰度较高，我们从每组中选择一个代表性序列（例如：A-1、A-5、A-9、A-12、A-28 和 B-68）进行进一步表征。通过天然凝胶迁移率偏移实验，计算出这些代表性适配体的解离常数（Kd）（图3A）。例如，其中最优的适配体A-1的表观Kd值为52 nM（图3B）。如图3A所示，这些筛选出的适配体能够选择性地结合靶标HIV-1 Bal gp120，而不能结合HIV gp120 CM蛋白。
2. 抗gp120适配体可特异性结合表达HIV gp160的细胞并被其内化，从而在细胞培养中抑制HIV-1感染。
稳定表达HIV包膜糖蛋白gp160的CHO-gp160细胞用于检测所选抗gp120适配体的结合与内化情况。由于这些细胞缺乏gag编码的蛋白酶，无法将gp160加工为gp120和gp41。作为对照，我们使用不表达gp160的亲本CHO-EE细胞系。流式细胞术分析（图4A）显示，Cy3标记的适配体特异性结合CHO-gp160细胞，而不结合对照CHO-EE细胞。此外，实时活细胞Z轴共聚焦显微镜观察表明，在孵育2小时后，Cy3标记的适配体被选择性地内化至CHO-gp160细胞内（图4B和4C），而在CHO-EE对照细胞中则无此现象（图4D）。图4C还显示，适配体在细胞质中聚集，提示gp120适配体可能通过受体介导的内吞作用进入细胞。
在HIV-1攻击实验中，用适配体处理HIV-1感染的PBMC细胞。在适配体处理后的不同时间点，取培养基等分试样检测病毒p24抗原水平（图4E）。结果显示，抗gp120适配体（A-1）在纳摩尔浓度下即可抑制HIV-1 p24的产生。
3. 设计抗gp120适配体-siRNA嵌合体，并评估其作为细胞类型特异性siRNA递送系统的有效性
如图5A所示，siRNA的适配体和有义链片段含有耐核酸酶的2'-氟代尿苷三磷酸（2'-Fluoro UTP）和2'-氟代胞苷三磷酸（2'-Fluoro CTP），并通过体外噬菌体转录由相应的双链DNA模板合成。为了增加分子的灵活性，在适配体与Dicer底物区域之间插入了一个两个核苷酸的连接序列（UU）。为制备含有嵌合结构的siRNA， 体外 转录的嵌合适配体-正义链聚合物与等摩尔浓度的未修饰反义链RNA退火。这些数据来自凝胶迁移实验（图5B）以及流式细胞术（图5C）表明，嵌合体与适配体单独存在时的结合亲和力大致相同。实时共聚焦显微镜的时间序列图像（图 5D) 显示，Cy3标记的嵌合体Ch A-1可成功内化至细胞的细胞质中。与预期一致，CHO-EE对照细胞中未观察到嵌合体的摄取图5E).
类似地，通过HIV-1攻击实验评估RNA的抗病毒潜力。HIV p24抗原分析结果（图6A和6B）显示，适配体和嵌合体均可抑制p24的产生，但以嵌合体Ch A-1处理时抑制效果最强。
为了证实siRNA组分在Ch A-1嵌合体进入感染细胞后与适配体协同发挥作用，我们还通过定量RT-PCR表达分析评估了tat/rev基因表达的相对抑制水平。我们发现，用嵌合体处理感染细胞可诱导tat/rev基因的沉默，而单独使用适配体则不影响tat/rev基因的表达（图6C和6D）。这些结果进一步支持了适配体递送的siRNA可触发RNA干扰（RNAi）的结论。
| 筛选过程中使用的蛋白、RNA文库和tRNA的量 | |||||
| SELEX轮次 | 靶标/RNA比例 | Gp120蛋白 | RNA文库 | 竞争性tRNA | 筛选缓冲液 |
| 1 | 1/6.5 | 229.8 pmol | 1.5 nmol (40.1 μg) | 0 | 低盐SELEX缓冲液 |
| 2 | 1/6.5 | 114.9 pmol | 0.75 nmol (20.1 μg) | 0.25 nmol (6.6 μg) | |
| 3 | 1/8 | 76.6 pmol | 0.625 nmol (16.7 μg) | 0.25 nmol (6.6 μg) | |
| 4 | 1/8 | 76.6 pmol | 0.625 nmol (16.7 μg) | 0.25 nmol (6.6 μg) | |
| 5 | 1/8 | 38.3 pmol | 0.306 nmol (8.18 μg) | 0.5 nmol (13.2 μg) | 高盐SELEX缓冲液 |
| 6 | 1/8 | 38.3 pmol | 0.306 nmol (8.18 μg) | 0.5 nmol (13.2 μg) | |
| 7 | 1/10 | 26.8 pmol | 0.268 nmol (7.16 μg) | 0.5 nmol (13.2 μg) | |
| 8 | 1/10 | 26.8 pmol | 0.268 nmol (7.16 μg) | 1 nmol (26.4 μg) | |
| 9 | 1/10 | 15.3 pmol | 0.153 nmol (4.09 μg) | 1 nmol (26.4 μg) | |
| 10 | 1/10 | 15.3 pmol | 0.153 nmol (4.09 μg) | 1.5 nmol (39.6 μg) | |
| 11 | 1/12.5 | 7.66 pmol | 0.096 nmol (2.56 μg) | 2 nmol (52.8 μg) | |
| 12 | 1/12.5 | 7.66 pmol | 0.096 nmol (2.56 μg) | 2 nmol (52.8 μg) | |
表1. 筛选条件。列出了每次筛选所用的蛋白质、RNA文库和tRNA的量，以及筛选缓冲液。
| 组别 | RNA | 随机序列 | 频率（140个克隆） |
| 第一组 | A-1 | AATTGAGGGACCACGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAGTTTGTCGGATGG | 33 (23.6%) |
| B-7 | AATTGAGGGACCAACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTATTTGCGTGATGG | 3 | |
| A-32 | AATTGAGGGACCGTTGGTAAAAGCCGGAAATTGAGCTTTTACGGCGATGG | 5 | |
| B-55 | AATTGAGGTACCGCGTTATTAGGAACAAATTGGAATTCTAAACGCGATGG | 2 | |
| A-24 | AATAGAGGGACCCAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTGGATGG | 1 | |
| B-19 | AATAGAGGAACCGTTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGCGACGG | 1 | |
| B-31 | AATAGAGGGACCGTGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCACGATGG | 1 | |
| 第二组 | A-12 | AGTAGAGGAACCAAGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTTGATGG | 10 (7.1%) |
| 第三组 | A-9 | TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG | 15 (10.7%) |
| 第四组 | A-28 | TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACGTTTGTG | 10 (7.1%) |
| 第五组 | A-5 | GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCGTTGGTG | 9 (6.4%) |
| 第六组 | B-68 | ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT | 2 |
| 其他 | 孤立序列 | 48 |
表2. RNA适配体的比对与鉴定。经过12th 筛选一轮后，将选出的RNA文库进行克隆并测序。在比对全部140个克隆后，鉴定出六组抗gp120适配体。仅显示适配体核心区域（5'-3'）的随机序列。出现频率较高的序列已特别注明。
图1：利用硝酸纤维素膜进行体外筛选以获得针对HIV-1 Bal gp120蛋白的RNA适配体的示意图。(A) 起始RNA文库与靶蛋白孵育形成复合物。(B) 结合的RNA分子被保留在膜上，并在变性条件下从膜上洗脱。(C) 未结合的RNA被洗去。(D) 筛选出的RNA经逆转录并进行PCR扩增。(E) 相应的DNA随后转录生成新的RNA文库，用于下一轮筛选。(F) 经过10-15轮筛选后，将筛选出的适配体进行克隆和测序。
图2： HIV-1 gp120 适配体筛选的进展。A通过带有竞争性tRNA的滤膜结合实验，分析每个循环中RNA文库的结合活性。结合活性计算为滤膜上蛋白质/RNA复合物所保留的输入RNA的百分比。B) 通过凝胶迁移实验分析每个循环中RNA文库的结合活性。12th RNA混合物显示出最高的结合活性。
图3： 针对HIV-1Bal gp120筛选出的单个适配体的结合活性检测。（A）将5'端P32标记的单个适配体与不同浓度的目标gp120蛋白或非特异性CM蛋白共同孵育。通过凝胶迁移实验分析结合反应体系。适配体A-1和B-68显示出对目标蛋白的最佳结合亲和力，而对CM蛋白无结合。数据代表四次重复实验的平均值。（B） 凝胶迁移实验获得的结合曲线。
图4： 细胞类型特异性适配体结合与摄取研究。A通过流式细胞术评估Cy3标记RNA的细胞表面结合能力。检测Cy3标记RNA与CHO-gp160细胞及CHO-EE对照细胞的结合情况。所筛选的适配体表现出对细胞类型的特异性结合亲和力。第2nd RNA 池和无关 RNA 用作阴性对照。数据代表三个重复的平均值。B内化分析。将 CHO-gp160 细胞接种于 35 mm 培养皿中，并在培养基中加入 100 nM 的 Cy3 标记 A-1，用于实时活细胞共聚焦显微镜分析。使用 40 倍物镜，每隔 15 分钟采集一次图像。C，D定位分析。将CHO-gp160细胞和CHO-EE对照细胞接种于35 mm培养皿中。在与100 nM Cy3标记的A-1共孵育前，先用Hoechst 33342（活细胞核染料）对细胞进行染色，随后采用实时共聚焦显微镜进行分析。E所选抗gp120适配体可抑制先前感染HIV-1 NL4-3病毒的人外周血单个核细胞（PBMCs）中HIV-1的复制。展示了不同浓度和时间点的结果，列出了IC50值。数据表示p24三项重复测量的平均值。
图5： 适配体-siRNA 嵌合体递送系统的设计与评价。A) 适配体-siRNA 嵌合 RNA 示意图：抗 gp120 适配体区域负责与 gp120 结合，siRNA 则靶向 HIV-1 的一个共有外显子 tat/rev2'-氟修饰的适配体-siRNA 有义单链共转录，随后与互补的 siRNA 反义链退火，形成完整的嵌合分子。适配体与 siRNA 之间的连接子（UU）以绿色标示。B) 与亲本适配体具有相似 Kd 值的适配体-siRNA 嵌合 RNA 能特异性结合 HIV 平衡 gp120蛋白。数据为三个重复样本的平均值。 (C) 适配体的细胞类型特异性结合研究。将Cy3标记的RNA用于CHO-gp160细胞和CHO-EE对照细胞的结合实验，通过流式细胞术检测Cy3标记RNA在细胞表面的结合情况。筛选获得的适配体表现出对特定细胞类型的结合亲和性。第2nd RNA混合物和无关RNA用作阴性对照。数据代表两个重复的平均值。D，E内化作用与细胞内定位分析。将CHO-gp160细胞接种于35 mm培养皿中，并用Hoechst 33342（活细胞核染料）染色。随后，将细胞在含100 nM Cy3标记嵌合体的培养基中孵育，进行实时活细胞共聚焦显微镜分析，方法如前所述。
图 6： 适配体-siRNA 嵌合体介导的 HIV-1 感染双重抑制作用。抗 gp120 适配体及适配体-siRNA 嵌合体均可中和 HIV-1 感染，分别在（A）CEM 细胞（IIIB 毒株）和（B）人外周血单个核细胞（PBMCs）（BaL 毒株）培养体系中。数据表示 p24 三项重复测量的平均值。嵌合体的抑制效果强于单独使用适配体，表明（C, D）适配体递送的 siRNA 在 PBMCs 中下调了 tat/rev 基因表达。数据代表三个重复样本的平均值。
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讨论
适配体是 体外 经过进化而形成的核酸，能够形成特定且稳定的三维结构，从而对靶向分子实现高度特异性的紧密结合8低纳摩尔级别的结合亲和力以及对靶标的高度特异性，使适配体成为诊断学中的多功能工具， 体内 成像与治疗9随着适体技术在靶向siRNA递送中的出现，现在可以利用适体的结合功能实现受体介导的siRNA内吞作用。10-12针对膜受体筛选获得的适配体已作为一种有前景的递送载体，能够以细胞类型特异性的方式靶向特定疾病或组织13，这可以增强药物的治疗效果，同时减少不必要的毒性副作用。
迄今为止，通过传统的纯化膜蛋白SELEX或全细胞SELEX技术，已成功分离并表征了越来越多能够靶向特定细胞类型或恶性细胞亚群的适配体。然而，在使用重组蛋白进行筛选时，由于目标受体种类不可获得、天然状态不稳定或存在复杂的生化与物理性质等问题，高效生成新的细胞特异性归巢适配体仍面临关键挑战。因此，细胞SELEX为获得可特异性结合特定靶细胞群体的适配体提供了一种替代策略。然而，人们注意到死细胞...
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披露
J. R 和 J. Z. 拥有一项关于“细胞类型特异性适配体-siRNA 递送系统用于 HIV-1 治疗”的待批专利。美国专利商标局，编号 12/328994，公开日期：2009 年 6 月 11 日。
致谢
感谢Britta Hoehn、Guihua Sun、Harris Soifer和Lisa Scherer的有益讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予J.J.R.的资助项目AI29329和HL07470的支持。以下试剂通过美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）、艾滋病研究部（Division of AIDS, NIAID, NIH）获得：CHO-EE和CHO-gp160细胞系；pNL4-3 luc载体；来自DAIDS、NIAID的HIV-1BaL gp120。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore 膜滤器 | EMD Millipore | HAWP01300 | 孔径 0.45 μm |
| Swinnex 滤器支架 | EMD Millipore | SX0001300 | 13 mm 直径 |
| QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | DNA纯化 |
| Microcon YM-30 柱 | EMD Millipore | 42410 | RNA浓度 |
| Bio-spin 30 柱 | 伯乐（Bio-Rad） | 732-6250 | RNA纯化 |
| Taq PCR DNA聚合酶 | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR 系统 | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 转录试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | DS010925 | |
| PCR用dNTP | 罗氏集团 | 1 581 295 | |
| 核糖核酸，来自大肠杆菌的转移RNA | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA 竞争物 |
| HIV-1Ba-L gp120蛋白 | 美国国立卫生研究院 | 4961 | 靶蛋白 |
| Silencer siRNA 标记试剂盒 - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| 酸性酚/氯仿 5/1 溶液（pH 4.5） | Ambion | AM9720 | |
| 氯仿/异丙醇 24/1 溶液 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| 小牛肠碱性磷酸酶（CIP） | New England Biolabs | M0290L | |
| T4 多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201L | |
| 糖原 | 罗氏集团 | 10 901 393 001 | RNA沉淀 |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedicals | 013502002 | 放射性 |
| 40% AccuGel 19:1 | 国家诊断公司 | EC-850 | |
| 10xTBE | 国家诊断公司 | EC-860 | |
| N,N,N,N’- 四甲基乙二胺（TMEMD） | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-甲硫氨酸亚砜亚胺 | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI 1640 培养基 | Invitrogen | 11835-030 | |
| 7.5% w/v 碳酸氢钠溶液 | Invitrogen | 25080-094 | |
| 最低必需培养基（MEM）（10'） | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM非必需氨基酸（100倍浓缩） | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA 克隆试剂盒（含 pCR 2.1） | Invitrogen | K2040-01 |
参考文献
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
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- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
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