细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

摘要

通过RNA文库筛选分离出多个针对HIV-1Ba-L gp120、具有纳摩尔亲和力的2’-氟代RNA适配体 体外 SELEX 流程。一种新型双抑制功能抗 gp120 适配体-siRNA 嵌合体被成功构建，在全身性抗 HIV 治疗中展现出显著潜力。

摘要

艾滋病病毒（HIV）感染的全球流行使得开发新型抗逆转录病毒药物变得尤为紧迫。小干扰RNA（siRNA）能够有效抑制互补RNA转录本的表达，这一特性正被开发为治疗包括艾滋病在内的多种疾病的一类新型治疗手段。以往许多研究已表明，基于RNA干扰（RNAi）的抗HIV/AIDS治疗策略具有广阔的应用前景；然而，siRNA在治疗应用及临床转化中的一个关键障碍是其递送效率。特别是考虑到RNAi疗法的安全性与有效性，开发一种能够靶向特定细胞群体或组织的细胞内siRNA递送方法显得尤为重要。HIV-1的gp120蛋白是存在于病毒表面的一种糖蛋白包膜成分，在病毒进入CD4细胞的过程中发挥关键作用。gp120与CD4受体的相互作用可触发HIV-1进入细胞并启动细胞融合，该过程已被证实为药物研发中具有临床相关性的抗病毒策略靶点。

本文首先讨论2'-F修饰的抗HIV gp120 RNA适体的筛选与鉴定。采用传统的硝酸纤维素膜筛选（SELEX）方法，从一个包含50个随机核苷酸的RNA文库中分离出多个具有纳摩尔亲和力的新适体。为了成功获得亲和力更高的结合物种，通过精确调控筛选条件以严格控制筛选的严谨性。所筛选出的适体能够特异性结合并快速被表达HIV-1包膜蛋白的细胞内化。此外，这些适体本身即可中和HIV-1的感染性。基于最优适体A-1，我们还构建了一种新型的双功能抑制性抗gp120适体-siRNA嵌合体，其中适体部分和siRNA部分均具有强效的抗HIV活性。进一步地，我们利用gp120适体-siRNA嵌合体实现将siRNA特异性递送至HIV-1感染的特定细胞类型。这种双功能嵌合体在联合应用多种核酸治疗剂（适体与siRNA）以抑制HIV-1感染方面展现出巨大潜力，使适体-siRNA嵌合体成为对高效抗逆转录病毒治疗（HAART）失败患者极具吸引力的治疗候选方案。

方案

1. RNA文库的制备

1. 起始DNA文库包含50个核苷酸的随机序列，由Integrated DNA Technologies（爱荷华州科拉尔维尔）合成。单链DNA寡核苷酸文库序列为5'- GGG AGG ACG ATG CGG - N₅₀- CAG ACG ACT CGC CCG A - 3'（81 nt）。该随机区域两侧为恒定区，其中包含用于T7启动子的序列 体外 转录以及用于RT-PCR的3'标签。5'和3'恒定序列分别为5' – TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3'（32 mer）和5' -TCG GGC GAG TCG TCT G - 3'（16 mer）。用水配制贮存液，并分装后于-80℃保存。20°C.
2. 扩增单链DNA寡核苷酸随机文库（0.4 μM通过PCR使用 3 μM 5'-和3'-引物各一条，以及2 mM MgCl₂₂ 和 200 μM 每种dNTP。为了保持原始DNA文库的丰度，将PCR循环次数限制在10个循环。PCR反应结束后（共10个反应， 100 μL 每次反应），使用 QIAquick Gel 纯化试剂盒（QIAGEN）回收扩增的双链DNA产物。
3. 使用 DuraScription 试剂盒（Epicentre，Madison，WI）按照制造商说明书将所得的 dsDNA 转化为 RNA 文库。在转录反应体系中，用 2'-F-CTP....

讨论

适配体是 体外 经过进化而形成的核酸，能够形成特定且稳定的三维结构，从而对靶向分子实现高度特异性的紧密结合⁸低纳摩尔级别的结合亲和力以及对靶标的高度特异性，使适配体成为诊断学中的多功能工具， 体内 成像与治疗⁹随着适体技术在靶向siRNA递送中的出现，现在可以利用适体的结合功能实现受体介导的siRNA内吞作用。^10-12针对膜受体筛选获得的适配体已作为一种有前景的递送载体，能够以细胞类型特异性的方式靶向特定疾病或组织¹³，这可以增强药物的治疗效果，同时减少不必要的毒性副作用。

迄今为止，通过传统的纯化膜蛋白SELEX或全细胞SELEX技术，已成功分离并表征了越来越多能够靶向特定细胞类型或恶性细胞亚群的适配体。然而，在使用重组蛋白进行筛选时，由于目标受体种类不可获得、天然状态不稳定或存在复杂的生化与物理性质等问题，高效生成新的细胞特异性归巢适配体仍面临关键挑战。因此，细胞SELEX为获得可特异性结合特定靶细胞群体的适配体提供了一种替代策略。然而，人们注意到死细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MF-Millipore 膜滤器	EMD Millipore	HAWP01300	孔径 0.45 μm
Swinnex 滤器支架	EMD Millipore	SX0001300	13 mm 直径
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706	DNA纯化
Microcon YM-30 柱	EMD Millipore	42410	RNA浓度
Bio-spin 30 柱	伯乐（Bio-Rad）	732-6250	RNA纯化
Taq PCR DNA聚合酶	Sigma-Aldrich	D1806
ThermoScript RT-PCR 系统	Invitrogen	11146-024
DuraScribe T7 转录试剂盒	Epicentre Biotechnologies	DS010925
PCR用dNTP	罗氏集团	1 581 295
核糖核酸，来自大肠杆菌的转移RNA	Sigma-Aldrich	R1753	tRNA 竞争物
HIV-1Ba-L gp120蛋白	美国国立卫生研究院	4961	靶蛋白
Silencer siRNA 标记试剂盒 - Cy3	Ambion	1632
酸性酚/氯仿 5/1 溶液（pH 4.5）	Ambion	AM9720
氯仿/异丙醇 24/1 溶液	Sigma-Aldrich	C0549
小牛肠碱性磷酸酶（CIP）	New England Biolabs	M0290L
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201L
糖原	罗氏集团	10 901 393 001	RNA沉淀
Gamma-P32-ATP	MP Biomedicals	013502002	放射性
40% AccuGel 19:1	国家诊断公司	EC-850
10xTBE	国家诊断公司	EC-860
N,N,N,N’- 四甲基乙二胺（TMEMD）	Sigma-Aldrich	T9281
过硫酸铵（APS）	Sigma-Aldrich	A3678
L-甲硫氨酸亚砜亚胺	Sigma-Aldrich	M5379-250 mg
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11835-030
7.5% w/v 碳酸氢钠溶液	Invitrogen	25080-094
最低必需培养基（MEM）（10'）	Invitrogen	11430-030
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩）	Invitrogen	11140-050
TA 克隆试剂盒（含 pCR 2.1）	Invitrogen	K2040-01